Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Het algemene doel van het volgende experiment is om de endosomale compartimenten van de gist Saccharomyces cei op ultrastructureel niveau te visualiseren. Dit wordt bereikt door gist-Spheroplasten te prepareren, die vervolgens positief geladen nanogouddeeltjes via endocytose opnemen. In een tweede stap wordt het monster gefixeerd en gesneden om ultradunne cryosecties van de cellen te verkrijgen.

Vervolgens worden de cryosneden onderworpen aan de zilverversterkingsreactie. Om de positief geladen nano-gouddeeltjes in de endocytose te vergroten en te visualiseren, worden resultaten verkregen die de morfologie van de verschillende endosomale compartimenten van gist tonen, gebaseerd op de specifieke markering van deze procedure. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals ImmunoGold-markering van coupes, is dat deze niet afhankelijk is van antilichamen, die vaak niet werken bij preparaten voor elektronenmicroscopie.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in het lysosomale systeem van de gist sarchi ESIS vei, kan deze ook worden toegepast op andere eukaryote modellen, zoals andere gisten en zoogdiercellen. De gist waaruit de spheroplasten worden bereid, wordt eerst gedurende de nacht geïncubeerd bij 30 °C in 10 ml van het geschikte medium, zoals bepaald door het ontwerp van het experiment voor de volgende dag. Nadat de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm is gemeten, worden de cellen in hetzelfde cultuurmedium verdund tot een OD 600 van 0,2 tot 0,4.

Kweek de cellen tot een exponentiële groeifase met een OD 600 van één tot twee, overbreng 10 OD 600 equivalenten cellen naar een buis van 50 milliliter en centrifugeer bij 2100 ×g gedurende vijf minuten. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspendeer het celpellet in vijf milliliter 100 millimolar PBS en 10 millimolar DTT; incubeer dit bij 30 °C gedurende 10 minuten. Verzamel de cellen door centrifugatie.

Nadat het supernatant is weggegooid, worden de cellen geresuspendeerd in vijf milliliter medium dat één molar sorbitol en vijf milligram lytisch enzym bevat. Incubeer het mengsel 30 minuten bij 30 °C onder zachte schudding. Centrifugeer de celsuspensie 5 minuten bij 300 ×g om een pelletfractie te verkrijgen die overeenkomt met de sferoplasten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de sferoplasten in 960 µL ijskoud medium dat 1 M sorbitol bevat. Breng het mengsel over in een ijskoude microcentrifugebuis van 2 mL. Om de procedure voor de opname van nanogoud te starten, mengt u de sferoplasten voorzichtig met positief geladen nanogouddeeltjes met behulp van een pipet.

Resuspendeer in 40 µL water. Het uiteindelijke volume van het mengsel moet één ml zijn. Plaats de verkregen cel-suspensie gedurende 15 minuten op ijs.

Breng de suspensie naar kamertemperatuur en incubeer gedurende de vereiste tijd om de internalisatie van nano gold via endocytose mogelijk te maken. Wanneer de gewenste opname van nano gold voltooid is, wordt de reactie gestopt door één milliliter tweevoudig fixatiemiddel bevattend één molair sorbitol aan de celsuspensie toe te voegen. Bewaar de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Keer de microcentrifugebuis tijdens de 30 minuten voorzichtig enkele keren handmatig om om het PHE-plastic en de suspensie in beweging te houden. Centrifugeer vervolgens twee keer bij 1700 Gs gedurende 25 seconden, verwijder het supernatant en voeg één milliliter vers fixatief van standaardsterkte toe dat één molar sorbitol bevat; incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een langzaam draaiend wiel. Vervolgens worden de cellen verwerkt en cryogesneden zoals beschreven in het tekstprotocol voorafgaand aan het starten van deze procedure. Haal de silver enhancement kit uit de vriezer en ontdooi deze in een incubator van 37 °C. Plaats de ontdooide kit in een bench-incubator van 24 °C, die vooraf in de donkere kamer is geplaatst tot aan gebruik.

Plaats een warmteplaat in een donkere kamer en verwarm deze tot een eindtemperatuur van 24 °C. Bedek de bovenkant van de warmteplaat met een beschermende tafelmat, met de glanzende zijde naar boven, en zet deze vast met tape. Breng parafilm aan op de oppervlaktebeschermer en markeer de randen met een zwarte marker om visualisatie in het donker mogelijk te maken.

Plak een thermometer op de bovenkant van de oppervlaktebeschermer. Pas de temperatuur geleidelijk aan om de temperatuur van de warmteplaat te bewaken. Indien deze niet 24 °C is, plaats dan een buis van 50 mL met dubbel gedestilleerd water.

Vul in de incubator een kleine Petrischaal met dubbel gedestilleerd water, vooraf opgewarmd tot 37 °C. Plaats twee nikkelroosters met de cryosnedes gedurende 30 minuten met de monsterzijde naar beneden in het water. Vul na 30 minuten een tweede Petrischaal met vooraf opgewarmd dubbel gedestilleerd water en plaats dezelfde twee nikkelroosters nogmaals 30 minuten in het water.

Spoel de roosters opnieuw door ze met de monsterzijde naar beneden over verschillende druppels dubbel gedestilleerd water bij 24 °C te halen, die zijn geplaatst op het parfum dat op de warmteplaat is gefixeerd. Zorg ervoor dat er negen extra druppels dubbel gedestilleerd water op het parfum klaarstaan voor het spoelen na de zilverversterkingsreactie. Op dit punt in de procedure moeten alle lichten in de donkere kamer worden uitgeschakeld en het rode licht worden ingeschakeld.

Echter, uitsluitend voor de opname blijft het licht aanstaan. Haal in deze demonstratie de a- en B-oplossingen van de silver enhancement kit uit de incubator van 24 °C in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met zes druppels van de A-oplossing, gevolgd door zes druppels van de B-oplossing, en meng deze goed met een glazen Pasturetpipet terwijl belvorming wordt vermeden. Vortex de oplossing.

Plaats de a- en B-oplossingen kortstondig terug in de incubator op 24 °C en haal de C-oplossing eruit. Voeg zes druppels van de C-oplossing toe aan het AB-mengsel. Meng opnieuw met een pasteurpijpet en vortex vervolgens, waarbij luchtbellen worden vermeden.

Gebruik dit uiteindelijke mengsel onmiddellijk. Plaats druppels op de parafilm met een schoon paar antimagnetische pincetten. Plaats de grids op het mengsel.

Dit is de zilverversterkingsreactie. Laat de roosters zes tot 15 minuten in het mengsel, afhankelijk van de gewenste versterking voor het experiment. Verwijder de roosters uit het mengsel en spoel ze snel door een opeenvolging van zes druppels dubbel gedestilleerd water op Perfil, waarbij de laatste drie wasbeurten bij 24 °C plaatsvinden.

Laat de roosters zeven minuten per druppel water inwerken. Indien een echt experiment wordt uitgevoerd, schakelt u de lampen weer in zodra het wassen is voltooid. Vervolgens worden de resultaten gevisualiseerd door middel van ImmunoGold-labeling of membraankleuring voor een EM-onderzoek.

Verschillende typen endosomale compartimenten in gist kunnen worden gelabeld met zilverversterkt nanogoud en gevisualiseerd worden middels elektronenmicroscopie. Een opnameperiode van vijf minuten met nanogoud labelt het plasmamembraan en vroege endosomale compartimenten, zoals enkelvoudige blaasjes, die mogelijk endocytische blaasjes zijn, en tubulaire structuren, die zeer waarschijnlijk vroege endosomen zijn. Een incubatie van 30 minuten met nanogoud leidt tot de labeling van late endosomen of multivesiculaire lichaampjes.

De resolutiekracht van de combinatie van een immuno-elektronenmicroscopieprocedure met dit nano-goud-zilverversterkingsprotocol wordt onderstreept door het behoud en de kwaliteit van de morfologie van de getoonde organellen, in het bijzonder de interne blaasjes van de multivesiculaire lichamen. Voordat de zilverversterkingsmethode wordt toegepast, is het noodzakelijk om een proefexperiment uit te voeren om de optimale incubatietijden te bepalen die nodig zijn voor zowel de grootte als de uniformiteit van deze zilverdeeltjes. Volg deze procedure.

Andere methoden, zoals immunolabeling, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals de lokalisatie van een specifiek eiwit in een bepaald compartiment onder de mar.