Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Het algemene doel van het volgende experiment is om de endosomale compartimenten van de gist Saccharomyces cei op ultrastructureel niveau te visualiseren. Dit wordt bereikt door het bereiden van gist Spheraplast, die vervolgens een endocytische opname van positief geladen nano goudpartikels ondergaan. Als tweede stap wordt het monster gefixeerd en gesneden om ultradunne cryo-secties van de cellen te verkrijgen.

Vervolgens worden de cryo-secties onderworpen aan de zilverversterkingsreactie. Om de endocytose van positief geladen nano goudpartikels te vergroten en te visualiseren, worden resultaten verkregen die de morfologie van de verschillende endosomale compartimenten van de gist laten zien op basis van de specifieke markering van deze procedure. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals ImmunoGold-markering van secties, is dat het niet afhankelijk is van antilichamen die vaak niet werken bij elektronenmicroscopiepreparaten.

Hoewel deze methode ons inzichten kan geven in het lysosomale systeem van de gist sarchi ESIS vei, kan deze ook worden toegepast op andere eukaryote modellen zoals andere gisten en zoogdiercellen. De gisten waaruit de Sphero Plast zal worden bereid, worden eerst een nacht bij 30 graden Celsius geïncubeerd in 10 milliliter van het geschikte medium, zoals bepaald door het ontwerp van het experiment op de volgende dag. Na het meten van de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer, verdun de cellen in hetzelfde cultuurmedium tot een OD 600 van 0,2 tot 0,4.

Laat de cellen groeien tot een exponentiële groeifase met een OD 600 van een tot twee overdracht, 10 D 600 equivalenten cellen naar een 50 milliliter buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2100 Gs. Na centrifugatie gooit u het supernatant weg en resuspendeert u de cellenpellet in vijf milliliter 100 millimolair pipe en 10 millimolair dihi drie bij Hall gedurende 10 minuten bij 30 graden Celsius. Verzamel de cellen door centrifugatie.

Na het weggooien van het supernatant Resus, schors de cellen in vijf milliliter medium dat een molair sorbitol bevat, en vijf milligram lytisch enzym. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius met zacht schudden. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 300 Gs om een pelletfractie te verzamelen die overeenkomt met de Sphero plats.

Gooi het supernatant weg en resuspendeer de splats in 960 microliters ijs Koud media dat een molair sorbitol bevat. Breng het mengsel over in een ijs Koud twee milliliter microcentrifugebuisje. Om de procedure voor nano goudpartikelopname te starten, gebruik een pipet en meng de Sphero plast voorzichtig met vier van positief geladen nano goudpartikels.

Resus geschorst in 40 microliter water. Het eindvolume van het mengsel moet een milliliter zijn. Plaats de verkregen celsuspensie gedurende 15 minuten op ijs.

Breng de suspensie naar kamertemperatuur en incubeer gedurende de vereiste tijd om nano goudpartikelinternalisatie door endocytose mogelijk te maken. Wanneer de gewenste nano goudpartikelopname compleet is, stopt u de reactie door een milliliter dubbele sterkte fixeermiddel met een molair sorbitol toe te voegen aan de celsuspensie. Laat de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur staan.

Keer de microcentrifugebuisje gedurende de 30 minuten handmatig meerdere keren om om de PHE plast en suspensie te bewaren. Vervolgens centrifugeer twee keer gedurende 25 seconden bij 1700 Gs, gooi het supernatant weg en voeg een milliliter vers standaardsterkte fixeermiddel met een molair sorbitol toe en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een langzaam roterend wiel. Vervolgens worden de cellen verwerkt en cryo-gesneden zoals beschreven in het tekstprotocol voorafgaand aan het starten van deze procedure, verwijder de zilverversterkingskit uit de vriezer en ontdooi in een 37 graden Celsius incubator. Plaats de ontdooiende kit in een 24 graden Celsius tafelincubator die eerder in de donkere kamer is geplaatst tot gebruik.

Plaats een verwarmingsplaat in een donkere kamer en verwarm deze tot een eindtemperatuur van 24 graden Celsius. Bedek de bovenkant van de verwarmingsplaat met een tafelcoating oppervlak, met de glanzende kant naar boven en zet het vast met plakband. Plaats parafilm op het oppervlaktebeschermer en markeer de randen met een zwarte stift om visualisatie in het donker mogelijk te maken.

Plak een thermometer op de bovenkant van de oppervlaktebeschermer. Om de temperatuur van de verwarmingsplaat te bewaken, pas geleidelijk de temperatuur aan. Als het niet 24 graden Celsius is, plaats een 50 milliliter buis met dubbel gedestilleerd water.

Vul in de incubator een kleine petrischaal met dubbel gedestilleerd water, voorverwarmd op 37 graden Celsius. Plaats twee nikkelroosters met de cryo-secties in het water, specimenzijde naar beneden, gedurende 30 minuten. Na 30 minuten vult u een tweede petrischaal met voorverwarmd dubbel gedestilleerd water en plaatst u dezelfde twee nikkelroosters gedurende nog eens 30 minuten in het water.

Spuit de roosters opnieuw door ze met de specimenzijde naar beneden over verschillende druppels dubbel gedestilleerd water bij 24 graden Celsius te laten passeren die op de parfum zijn geplaatst die op de verwarmingsplaat is gefixeerd. Zorg ervoor dat er negen extra druppels dubbel gedestilleerd water klaar staan ​​op de parfum voor het spoelen na de zilverversterkingsreactie. Op dit punt in de procedure moeten alle lichten in de donkere kamer worden uitgeschakeld en het rode licht worden ingeschakeld.

Echter, alleen voor filmdoeleinden, blijft het licht aan. Neem in deze demonstratie de a en B oplossingen van de zilverversterkingskit uit de 24 graden Celsius incubator in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje bij zes druppels van de A-oplossing, gevolgd door zes druppels van de B-oplossing en meng goed met een glazen pasti pipet terwijl u het vormen van bubbels vermijdt. Vortex de oplossing.

Breng de a en B oplossingen kort terug naar de 24 graden Celsius incubator en neem de C-oplossing eruit. Voeg zes druppels van de C-oplossing toe