Name: Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Leer nanogoudlabeling van het endosomale systeem in Saccharomyces cerevisiae voor ultrastructurele analyses. Deze methode gebruikt positief geladen nanodeeltjes en zilverversterking voor verbeterde visualisatie zonder antilichamen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Rene Scriwanek voor de hulp bij de voorbereiding van de figuur. FR wordt ondersteund door ECHO (700.59.003), ALW Open Programma (821.02.017 en 822.02.014), DFG-NWO samenwerking (DN82-303) en ZonMW VICI (016.130.606) subsidies.

1. Sferoplast Bereiding <ol><li> Incubeer de gist overnacht bij 30 ° C in 10 ml van het geschikte medium bepaald door het ontwerp van het experiment. </li><li> De dag na, meet de optische dichtheid van de kweek bij 600 nm (OD600) met een fotometer, Verdun cellen in hetzelfde kweekmedium een OD600 van 0,2-0,4 en groeien ze tot een exponentiële groeifase indien het model van de experiment vereist een andere aandoening. Cellen zijn in de exponentiële fase waarin de cultuur heeft een OD 600 van 1-2. </li><li> Verzamel 10 OD 600 equivalenten van cellen door centrifugeren bij 3500 xg gedurende 5 minuten in een 50 ml buisje. Na het centrifugeren, gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml 100 mM PIPES (pH 9,6), 10 mM dithiothreitol en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Verzamel opnieuw de cellen door centrifugeren bij 3500 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 5 ml medium (bepaald door het ontwerp van het experiment) bevattende 1 M sorbitol en 5 mg lytisch enzym en incubeer het mengsel bij 30 ° C onder zacht schudden gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten om de pellet-fractie, die overeenkomt met de sferoplasten verzamelen. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de sferoplasten in 960 pl ijskoud medium (gemiddeld bepaald door het ontwerp van het experiment) bevattende 1 M sorbitol en breng het mengsel aan een ijskoude 2 ml microcentrifugebuis. </li></ol> 2. Nanogold Opname <ol><li> Met behulp van een pipet, meng de sferoplast met 4 nmol van positief geladen Nanogold deeltjes geresuspendeerd in 40 pl water. Het uiteindelijke volume van het mengsel van 1 ml te zijn. </li><li> Plaats de verkregen celsuspensie op ijs gedurende 15 minuten. </li><li> Breng de suspensie bij kamertemperatuur en incubeer voor de vereiste tijd om Nanogold internalisatie mogelijk via endocytosis. OPMERKING: Een 5 min opname zal voornamelijk leiden tot de etikettering van endocytische blaasjes en vroeg endosomale compartimenten, terwijl een 15 min opname zal toelaten om het hele endosomale systeem (vroege en late endosomen) te markeren. Langere incubatietijden (meer dan 30 minuten) zal toestaan ​​de vacuole label. OPMERKING: Pulse-chase labeling experimenten is niet mogelijk met deze methode. Daarom, wanneer de etikettering voor de analyse van LE, Nanogold zal ook te vinden op de PM en INEE. </li></ol> 3. Fixatie en Snijden <ol><li> Stop de Nanogold opname door toevoeging van 1 ml van dubbele sterkte fixeermiddel [4% paraformaldehyde (PFA), 0,4% glutaaraldehyd (GA) in 0,1 M PHEM-buffer (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl 2)] bevattende 1 M sorbitol aan de celsuspensie. Hield de buis bij kamertemperatuur. </li><li> Zwenk handmatig de micocentrifuge buizen meerdere malen gedurende 30 min (dit zal toelaten om de sferoplasten in te houdenschorsing) en centrifugeer vervolgens twee keer in 1700 xg gedurende 25 sec. </li><li> Vervang het fixeermiddel door weggooien het supernatant en door toevoeging van 1 ml vers standaard sterkte fixatief (2% PFA, 0,2% GA 0,1 M PHEM-buffer) bevattende 1 M sorbitol en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een langzaam roterend wiel. </li><li> Verwerk de cellen voor cryo-snijden zoals eerder beschreven 6. OPMERKING: Bij de Nanogold opname en zilver verbetering procedures, perjoodzuur behandeling in de aangegeven protocol beschreven niet worden uitgevoerd. De periodieke zuurbehandeling is aan de celwand 26 beter doorlaatbaar maar deze structuur is geëlimineerd tijdens de vorming van sferoplasten. </li><li> Snijd 50 nm dunne cryosecties bij -120 ° C met droge diamant mes met behulp van een UCT ultramicrotoom zoals eerder beschreven 8 en leg ze op Formvar koolstof beklede 50 mazen nikkel grids. </li></ol> 4. Silver Enhancement voor Nanogold Particle Visuabiliseren OPMERKING: De procedure om de reactiemengsels te bereiden is in principe aangegeven door de fabrikant. Praktische aanpassingen met dit protocol, maakt de zilveren enhancement procedure effectief en betrouwbaar op vriescoupes. <ol><li> Verwijder de versterking met zilver kit van de vriezer en ontdooien in een 37 ° C incubator of waterbad. Wanneer ontdooid, plaats de kit in een 24 ° C incubator geplaatst in een donkere kamer tot gebruik (zie 4.7). </li><li> Zet de verwarming plaat in de donkere kamer en warm het tot de uiteindelijke temperatuur van 24 ° C. </li><li> Bedek de bovenkant van het verwarmen plaat met het oppervlak beschermer, glimmende kant naar boven, en zet deze vast met een tape. </li><li> Plaats de Parafilm op de Benchkote en markeer de randen met een zwarte stift kunnen de Parafilm randen zien in het donker. </li><li> Tape een thermometer bovenaan de Benchkote om de temperatuur van de verwarmingsplaat volgen. Geleidelijk de temperatuur aan te passen, zo niet 24 ° C. </li><li> Place de 50 ml buis met dubbel gedestilleerd water en de versterking met zilver kit binnen. </li><li> Vul het kleine petrischalen met dubbel gedestilleerd water, voorverwarmd bij 37 ° C. Plaats de roosters in het water, specimen naar beneden, gedurende 30 minuten. </li><li> Herhaal deze stap 4.7 nog een keer. </li><li> Breng de roosters in de opbergbox en breng ze naar de donkere kamer. </li><li> Spoel de roosters weer door ze (het model naar beneden) op enkele druppels dubbel gedestilleerd water bij 24 ° C geplaatst op de Parafilm die is vastgesteld op de verwarmingsplaat. </li><li> Zorg ervoor dat 9 extra dubbel gedestilleerd water druppels zijn klaar om op de Parafilm, voor het spoelen na de versterking met zilver reactie. </li><li> Doe het licht uit en zorg ervoor dat alle lichten uit zijn. Draai het rode lampje op. </li><li> Neem de A-en B-oplossingen van de zilveren enhancement kit van de 24 ° C incubator. </li><li> Zet eerste 6 druppels Een oplossing en vervolgens 6 druppels B oplossing in een 1,5 ml microcentrifugebuis, en meng goed met een glas Pasteur pipet vermijden om zeepbellen te maken. De oplossing is vrij dik en het moet handmatig worden gemengd met een pipet voordat eindelijk vortexen het kort. </li><li> Doe de A-en B-oplossingen terug in de 24 ° C incubator en verwijder de C-oplossing. </li><li> 6 druppels van de C oplossing van het A / B mengsel. Meng dan weer eerst met een Pasteur pipet en vervolgens door vortexen, voorkomen dat bellen. </li><li> Onmiddellijk het uiteindelijke mengsel door het plaatsen van druppels (~ 20 ul / druppel) op de Parafilm. </li><li> Met een schone, anti-magnetisch pincet, plaatst u de roosters op het mengsel (bijv.., Zilver verbeteren reactie) voor 6 tot 15 minuten, afhankelijk van de versterking (dwz. Grootte van de gouddeeltjes) wenste te worden verkregen. </li><li> Verwijder de roosters uit het mengsel en doorgeven aan de bovenkant van het dubbel gedestilleerd water druppels bij 24 ° C voor wassen. Gebruik eerst in snel achter elkaar 6 druppels en vervolgens 3 druppels met 7 min incubatietijd per druppel, Voordat u de lichten aan. </li><li> Ga naar de volgende stap, of immuno-goud labeling of membraankleuring 27 teneinde het resultaat te visualiseren voor een EM onderzoek. </li></ol>

<ol><li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+pathway%3A+a+mosaic+of+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li>
<li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes%3A+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li>
<li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+imagination%3A+understanding+the+endo-lysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li>
<li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li>
<li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III%3A+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li>
<li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li>
<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+PtdIns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li>
<li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li>
<li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li>
<li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li>
<li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li>
<li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+contact+site+complex%2C+a+determinant+of+mitochondrial+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li>
<li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li>
<li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li>
<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
<li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%2C+hexokinase%2C+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+gold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Immuno-elektron-microscopie is een techniek waarmee combineren lokalisatie van eiwitten met de ultrastructurele resolutie van de dragers en organellen wanneer deze eiwitten bevinden. Dit is vooral van cruciaal belang bij het bestuderen van de gist endosomale systeem, omdat haar compartimenten verschijnen als puntlaesies structuren in fluorescentie microscopie. Het is derhalve moeilijk te onderscheiden. Daarom is het gebruik van een probe detecteerbaar door EM en het invoeren van de endocytische route op een tijdsafhanke...

De endosomale systeem is een belangrijke membraan sorteerinrichting die meerdere cruciale cellulaire functies, waaronder handel in lysosomale enzym sorteren receptoren en de recycling van plasmamembraan (PM) speelt receptoren 1,2. Endosomen worden onderverdeeld in drie compartimenten, dwz. de vroege endosomen (EE), de late endosomen (LE) en de recycling endosomes. Deze indeling is gebaseerd op de tijd die het duurt voor endocytosed materiaal om hen te bereiken, op specifieke marker-eiwitten en op hun morfologie. Membranen, dwz eiwit en lipidendubbellagen geïnternaliseerd van de PM kan ofwel lysosomen worden geleverd via endosomes voor degradatie of worden teruggevoerd. Membranen zijn ook vervoerd endosomen naar het Golgi en evenzo hetzij verder lysosomen of teruggestuurd naar de Golgi opgehaald. Bovendien kunnen eiwitten worden gesorteerd in luminale vesicles binnenwaarts knopvorming aan het endosomale membraan beperken, een proces dat leidt tot de vorming vaneen subcategorie van LE, de multivesiculaire lichamen. De gist endosomale systeem relatief minder complex dan die van hoge eukaryotische cellen. Gist endosomes zijn verdeeld in EE en LE. In tegenstelling tot zoogdiercellen en niet recycling endosomen maar ook weefselspecifieke-lysosoom gerelateerde organellen bevatten. Daarom hebben ze een minder complex netwerk van endosomaal smokkelroutes 3,4. Daarom gist heeft vertegenwoordigd en vormt nog steeds een voordelige experimenteel systeem om een ​​aantal van de principes onderliggende membraan verkeer studeren in het endosomale systeem. Dit voordeel wordt benadrukt door het feit dat vele genen betrokken bij de endosomale paden zijn aanvankelijk geïsoleerd met genetische screens in gist 5. Terwijl de gist endosomale systeem in wild-type en mutante cellen is uitgebreid bestudeerd met behulp van biochemische en fluorescentie microscopie benaderingen, heeft haar onderzoek op het ultrastructurele niveau alleen geweestminimaal. Morfologische analyses zijn met name relevant in gist, omdat de meeste van de endosomal organellen worden gedetecteerd als puntlaesies structuren met behulp van fluorescentie microscopie, die moeilijk hun ondubbelzinnige identificatie 6 maken. Er is een beperkt aantal antisera herkennen gist endosomen markers werkt in immuno-elektronen-microscopie (IEM) preparaten 7-10. Voor sommige eiwitten, is dit probleem omzeild door de endogene tagging van het gen van belang en het gebruik van een antilichaam dat het label om het 7,11,12 detecteren. Vaak echter, eiwitten zijn niet op te sporen door IEM vanwege hun lage expressie niveaus. Hun overexpressie is geen oplossing, want deze aanpak mis-lokalisatie en / of wijzigingen kunnen veroorzaken in het organel morfologie / functies. Dus de etikettering van de endocytische compartimenten met een probe detecteerbaar door elektronenmicroscopie EM is een effectieve optie. Dit is een optimale oplossing vooral als de probe betreedt de endocytische route een tijdsafhankelijke wijze, waardoor weten wanneer het een bepaalde organel 6 zal markeren. De opname van positief geladen Nanogold door gistsferoplasten (dwz. Gist waar de celwand is enzymatisch verwijderd) is met succes gebruikt voor identificatie van de gist endosomale compartimenten 10. Deze deeltjes sterk binden aan de negatief geladen lipiden waaruit de biologische membranen. Dus de positief geladen Nanogold associeert met de PM, dringt de cel door endocytose en loopt door het EE en LE alvorens de vacuole. Deze kleine gouddeeltjes hebben echter geen adequate afmetingen zichtbaar EM. Om ze zichtbaar te maken, kan de grootte worden vergroot door chemische reacties die leiden tot de afzetting van zilver of goud om de gouden sonde 13-15. We hebben ontwikkeld en met succes toegepast een IEM aanpak op basis van de Tokuyasu methode om subcellulaire voerenlokalisatie bestudeert 8,16. Deze methode maakt het uitvoeren immunogold etikettering op gist preparaten met een uitstekende resolutie van de morfologie 8,17-24. We hebben ook vastgesteld in een procedure te combineren IEM protocol met de Nanogold etikettering van de gist endosomal systeem compartimenten 6. Met deze aanpak hebben we morfologisch gekarakteriseerd verschillende subklassen van endosomes en ultrastructureel onderzocht mutanten met een endosomaal transport defect 6,25. Bovendien hebben we aangetoond dat deze Nanogold kenmerken te combineren met immunogoud labelings die de mogelijkheid om de verdeling van een eiwit van belang van de verschillende subpopulaties endosoom verkennen. Hier presenteren we hoe de etikettering van de gist endosomal systeem met positief geladen Nanogold praktisch wordt uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Positief geladen Nanogold</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>HQ-zilver&trade; verbeteringskit</td><td>Nanoprobes, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 8% EM-kwaliteit</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Lytische enzym</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nikkelroosters&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Verenigd Koninkrijk</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-immuno diamantmes 35&deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Zwitserland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>UCT ultramicrotome&nbsp;</td><td>Leica, Solms, Duitsland</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 hars</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 meshes nikkelroosters&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Verenigd Koninkrijk</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Grids opslagdoos</td><td>Leica, Solms, Duitsland</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm Petri-schaal</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur capillaire pipetten 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, Nederland</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Duitsland</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml buis</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, Nederland</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Benchkote oppervlaktebeschermer</td><td>Whatman, Maidstone, Verenigd Koninkrijk&nbsp;</td><td>1159201</td><td></td></tr></tbody></table>

nanogold labeling van de gist endosomale systeem voor ultrastructurele analyses

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomen zijn een van de belangrijkste membraan sorteren controlestations in eukaryote cellen en ze reguleren recycling of vernietiging van eiwitten voornamelijk uit de celmembraan en het Golgi. Door het endosomale systeem speelt een centrale rol in het handhaven celhomeostase en mutaties in genen die tot dit netwerk van organellen verbonden door vesiculair transport, ernstige pathologieën waaronder kanker en neurobiologische aandoeningen. Het is daarom van het grootste belang om de mechanismen die ten grondslag liggen van de biogenese en de organisatie van het endosomale systeem te begrijpen. De gist Saccharomyces cerevisiae is cruciaal geweest bij deze taak. Om specifiek te etiketteren en te analyseren op het ultrastructurele niveau het endosomale systeem van dit model organisme, presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de positief geladen Nanogold opname door sferoplasten gevolgd door de visualisatie van deze deeltjes door middel van een versterking met zilver reactie. Deze methode is ook een waardevol tel voor de morfologische onderzoek van mutanten met defecten in endosomaal transport. Bovendien is niet alleen voor ultrastructurele onderzoek maar kan ook gecombineerd worden met immuno labelings voor eiwit lokalisatie onderzoeken.

Volgens de gepresenteerde protocol, kan de morfologie van de gist endosoom systeem toegang worden door transmissie EM Figuur 1. Toont verschillende soorten endosomal compartimenten die zijn bereikt en daarom gelabeld met Nanogold. De zilveren versterkte Nanogold duidelijk te zien als elektronendonor dichte deeltjes. De optimale instellingen vastgesteld voor de versterking met zilver reactiemengsel kan met gouddeeltjes in een homogene afmetingen tussen 5 en 15 nm, die niet interfereert met de ultrastruct...

Gist, Saccharomyces cerevisiae, heeft een sleutelrol modelorganisme om genen die de biogenese en functies van het endosomale systeem te identificeren en te bestuderen geweest. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de specifieke kenmerken van de endosomale compartimenten voor ultrastructurele studies.

Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de endosomale compartimenten van de gist Saccharomyces cei op ultrastructureel niveau te visualiseren. Dit wordt bereikt door gist-Spheroplasten te prepareren, die vervolgens positief geladen nanogouddeeltjes via endocytose opnemen. In een tweede stap wordt het monster gefixeerd en gesneden om ultradunne cryosecties van de cellen te verkrijgen.Vervolgens worden de cryosneden onderworpen aan de zilverversterkingsreactie. Om de positief geladen nano-gouddeeltjes in de endocytose te vergroten en te visualiseren, worden resultaten verkregen die de morfologie van de verschillende endosomale compartimenten van gist tonen, gebaseerd op de specifieke markering van deze procedure. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals ImmunoGold-markering van coupes, is dat deze niet afhankelijk is van antilichamen, die vaak niet werken bij preparaten voor elektronenmicroscopie.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het lysosomale systeem van de gist sarchi ESIS vei, kan deze ook worden toegepast op andere eukaryote modellen, zoals andere gisten en zoogdiercellen. De gist waaruit de spheroplasten worden bereid, wordt eerst gedurende de nacht geïncubeerd bij 30 °C in 10 ml van het geschikte medium, zoals bepaald door het ontwerp van het experiment voor de volgende dag. Nadat de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm is gemeten, worden de cellen in hetzelfde cultuurmedium verdund tot een OD 600 van 0,2 tot 0,4.Kweek de cellen tot een exponentiële groeifase met een OD 600 van één tot twee, overbreng 10 OD 600 equivalenten cellen naar een buis van 50 milliliter en centrifugeer bij 2100 ×g gedurende vijf minuten. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspendeer het celpellet in vijf milliliter 100 millimolar PBS en 10 millimolar DTT; incubeer dit bij 30 °C gedurende 10 minuten. Verzamel de cellen door centrifugatie.Nadat het supernatant is weggegooid, worden de cellen geresuspendeerd in vijf milliliter medium dat één molar sorbitol en vijf milligram lytisch enzym bevat. Incubeer het mengsel 30 minuten bij 30 °C onder zachte schudding. Centrifugeer de celsuspensie 5 minuten bij 300 ×g om een pelletfractie te verkrijgen die overeenkomt met de sferoplasten.Verwijder het supernatant en resuspendeer de sferoplasten in 960 µL ijskoud medium dat 1 M sorbitol bevat. Breng het mengsel over in een ijskoude microcentrifugebuis van 2 mL. Om de procedure voor de opname van nanogoud te starten, mengt u de sferoplasten voorzichtig met positief geladen nanogouddeeltjes met behulp van een pipet.Resuspendeer in 40 µL water. Het uiteindelijke volume van het mengsel moet één ml zijn. Plaats de verkregen cel-suspensie gedurende 15 minuten op ijs.Breng de suspensie naar kamertemperatuur en incubeer gedurende de vereiste tijd om de internalisatie van nano gold via endocytose mogelijk te maken. Wanneer de gewenste opname van nano gold voltooid is, wordt de reactie gestopt door één milliliter tweevoudig fixatiemiddel bevattend één molair sorbitol aan de celsuspensie toe te voegen. Bewaar de buis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Keer de microcentrifugebuis tijdens de 30 minuten voorzichtig enkele keren handmatig om om het PHE-plastic en de suspensie in beweging te houden. Centrifugeer vervolgens twee keer bij 1700 Gs gedurende 25 seconden, verwijder het supernatant en voeg één milliliter vers fixatief van standaardsterkte toe dat één molar sorbitol bevat; incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een langzaam draaiend wiel. Vervolgens worden de cellen verwerkt en cryogesneden zoals beschreven in het tekstprotocol voorafgaand aan het starten van deze procedure. Haal de silver enhancement kit uit de vriezer en ontdooi deze in een incubator van 37 °C. Plaats de ontdooide kit in een bench-incubator van 24 °C, die vooraf in de donkere kamer is geplaatst tot aan gebruik.Plaats een warmteplaat in een donkere kamer en verwarm deze tot een eindtemperatuur van 24 °C. Bedek de bovenkant van de warmteplaat met een beschermende tafelmat, met de glanzende zijde naar boven, en zet deze vast met tape. Breng parafilm aan op de oppervlaktebeschermer en markeer de randen met een zwarte marker om visualisatie in het donker mogelijk te maken.Plak een thermometer op de bovenkant van de oppervlaktebeschermer. Pas de temperatuur geleidelijk aan om de temperatuur van de warmteplaat te bewaken. Indien deze niet 24 °C is, plaats dan een buis van 50 mL met dubbel gedestilleerd water.Vul in de incubator een kleine Petrischaal met dubbel gedestilleerd water, vooraf opgewarmd tot 37 °C. Plaats twee nikkelroosters met de cryosnedes gedurende 30 minuten met de monsterzijde naar beneden in het water. Vul na 30 minuten een tweede Petrischaal met vooraf opgewarmd dubbel gedestilleerd water en plaats dezelfde twee nikkelroosters nogmaals 30 minuten in het water.Spoel de roosters opnieuw door ze met de monsterzijde naar beneden over verschillende druppels dubbel gedestilleerd water bij 24 °C te halen, die zijn geplaatst op het parfum dat op de warmteplaat is gefixeerd. Zorg ervoor dat er negen extra druppels dubbel gedestilleerd water op het parfum klaarstaan voor het spoelen na de zilverversterkingsreactie. Op dit punt in de procedure moeten alle lichten in de donkere kamer worden uitgeschakeld en het rode licht worden ingeschakeld.Echter, uitsluitend voor de opname blijft het licht aanstaan. Haal in deze demonstratie de a- en B-oplossingen van de silver enhancement kit uit de incubator van 24 °C in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met zes druppels van de A-oplossing, gevolgd door zes druppels van de B-oplossing, en meng deze goed met een glazen Pasturetpipet terwijl belvorming wordt vermeden. Vortex de oplossing.Plaats de a- en B-oplossingen kortstondig terug in de incubator op 24 °C en haal de C-oplossing eruit. Voeg zes druppels van de C-oplossing toe aan het AB-mengsel. Meng opnieuw met een pasteurpijpet en vortex vervolgens, waarbij luchtbellen worden vermeden.Gebruik dit uiteindelijke mengsel onmiddellijk. Plaats druppels op de parafilm met een schoon paar antimagnetische pincetten. Plaats de grids op het mengsel.Dit is de zilverversterkingsreactie. Laat de roosters zes tot 15 minuten in het mengsel, afhankelijk van de gewenste versterking voor het experiment. Verwijder de roosters uit het mengsel en spoel ze snel door een opeenvolging van zes druppels dubbel gedestilleerd water op Perfil, waarbij de laatste drie wasbeurten bij 24 °C plaatsvinden.Laat de roosters zeven minuten per druppel water inwerken. Indien een echt experiment wordt uitgevoerd, schakelt u de lampen weer in zodra het wassen is voltooid. Vervolgens worden de resultaten gevisualiseerd door middel van ImmunoGold-labeling of membraankleuring voor een EM-onderzoek.Verschillende typen endosomale compartimenten in gist kunnen worden gelabeld met zilverversterkt nanogoud en gevisualiseerd worden middels elektronenmicroscopie. Een opnameperiode van vijf minuten met nanogoud labelt het plasmamembraan en vroege endosomale compartimenten, zoals enkelvoudige blaasjes, die mogelijk endocytische blaasjes zijn, en tubulaire structuren, die zeer waarschijnlijk vroege endosomen zijn. Een incubatie van 30 minuten met nanogoud leidt tot de labeling van late endosomen of multivesiculaire lichaampjes.De resolutiekracht van de combinatie van een immuno-elektronenmicroscopieprocedure met dit nano-goud-zilverversterkingsprotocol wordt onderstreept door het behoud en de kwaliteit van de morfologie van de getoonde organellen, in het bijzonder de interne blaasjes van de multivesiculaire lichamen. Voordat de zilverversterkingsmethode wordt toegepast, is het noodzakelijk om een proefexperiment uit te voeren om de optimale incubatietijden te bepalen die nodig zijn voor zowel de grootte als de uniformiteit van deze zilverdeeltjes. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals immunolabeling, kunnen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden zoals de lokalisatie van een specifiek eiwit in een bepaald compartiment onder de mar.

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Accurate kwantificering van vesiculaire transportgebeurtenissen levert vaak sleutelinzichten op in de rol van specifieke eiwitten en de effecten van mutaties. Dit artikel presenteert methoden voor het gebruik van superecliptic pHluorin, een pH-gevoelige GFP-variant, als een hulpmiddel voor kwantificering van endocytische gebeurtenissen in levende cellen met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

Het huidige protocol beschrijft een kloonbare elektronenmicroscopie-etiketteringstechnologie voor het detecteren van metallothioneïne-gelabelde eiwitten in cellen met behulp van een nieuwe op autonucleatieonderdrukkingsmechanisme gebaseerde gouden nanodeeltjessynthesetechniek.

Directe synthese van EM-zichtbare gouden nanodeeltjes in cellen voor eiwitlokalisatieanalyse met goed bewaarde ultrastructuur

Leer nanogoudlabeling van het endosomale systeem in Saccharomyces cerevisiae voor ultrastructurele analyses. Deze methode gebruikt positief geladen nanodeeltjes en zilverversterking voor verbeterde visualisatie zonder antilichamen.

Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Meer video's verkennen