Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen
October 17th, 2014
Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de intrinsieke adhesieve eigenschappen van vermeende celadhesiemoleculen. Het uitgescheiden, epatoom-getagde ectodomein van een celadhesiemolecuul wordt gevangen uit het kweekmedium op kleine, uniforme functionele kralen. Deze kralen kunnen vervolgens onmiddellijk worden gebruikt in eenvoudige kralagomaggregatie-assays.
Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van eiwitecto-domeinen te testen om homofiele adhesie te mediëren om dit te bereiken, worden plasmiden die coderen voor de fusie van een ecto-domeinfragment naar het FC-gebied van humaan IgG getransfecteerd in HEC 2 93-cellen. De uitgescheiden Odin FC-fusie-eiwitten worden gevangen op magnetische kralen geconjugeerd aan proteïne G en na een wasbeurt, worden de gecoate kralen toegelaten om te interageren in oplossing. De gecoate kralen worden vervolgens geïmaged om de mate van aggregatie te beoordelen en tenslotte, gekwantificeerd. Met behulp van eenvoudige beeldanalyse, onthullen de resulterende gegevens of het eiwit onder studie in staat is om homofiele adhesie te mediëren.
De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals celadhesie-assays, is dat het snel, eenvoudig is en direct de adhesie-activiteit van uw gekozen eiwit test. Het demonstreren van deze techniek zal Dr. Michelle Eman, een senior wetenschapper van het laboratorium, zijn. Begin deze procedure door de gekweekte cellen voor NCA hier ECFC, twee tot drie dagen vóór transfectie voor te bereiden.
Gebruik 0,05% trips in EDTA om de HEC 2 93-cellen los te maken van kweekschotels. Bereid twee 100 millimeter schotels voor elke conditie. Splits de cellen een tot vijf en kweek ze vervolgens in.
Gesupplementeerd groeimedium. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide tot ze 60 tot 80% confluënt zijn. Op de dag van de transfectie, gebruik een reagens zoals lipo om een plasmide te introduceren dat FC-fusie codeert.
Na de transfectie, breng de cellen terug in de incubator voor 24 uur. De dag na de transfectie, voorverwarm DMEM met pent strep en zonder foetaal bovien serum tot 37 graden Celsius. Spoel elke schotel twee keer met 10 milliliter van het verwarmde medium en breng de schotels vervolgens terug in de 37 graden Celsius incubator gedurende één uur. Na de incubatie, spoel de kweekschotels nog één keer met 10 milliliter DMEM zonder foetaal bovien serum voor een totaal van drie wasbeurten, en bewaar de gekweekte cellen vervolgens gedurende nog eens 48 uur bij 37 graden Celsius voordat het medium wordt verzameld. Vier dagen na transfectie, gebruik een serologische pipette om het medium van elk paar kweekschotels te verzamelen en over te brengen naar een 50 milliliter conische buis.
Centrifugeer vervolgens het medium bij 500 Gs gedurende vijf minuten om de cellulaire deeltjes te pellen. Na het centrifugeren, giet het medium van elke 50 milliliter conische buis in een 30 milliliter spuit en filter het door een 0,45 micron spuit. Filter in een centrifugaal concentrator. Spuit de centrifugaalfilters totdat het volume van geconcentreerd kweekmedium is verminderd tot ongeveer 500 microliters.
Dit duurt ongeveer 15 minuten. Herhaal dit proces totdat al het kweekmedium is toegevoegd en geconcentreerd. Vervolgens, in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor elk monster bij 1,5 microliters van proteïne G magnetische kralen tot één milliliter ijskoud bindingsbuffer.
Het moeilijkste aspect van deze procedure is de kraalaggregatie. Om succes te garanderen, zorg ervoor dat u de procedure precies volgt. Bekijk de kralen snel, maar niet te hard.
Ze mogen nooit drogen op de zijkant van de buis of te lang op de magneet blijven. Plaats de buis op een magneet en gebruik een pipette om de buffer af te zuigen. Voeg vervolgens onmiddellijk het geconcentreerde kweekmedium toe aan de proteïne G magnetische kralen.
Roteer de buizen bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Plaats de buizen op een magneet en verwijder het medium snel. Was de kralen twee keer met één milliliter ijskoud bindingsbuffer en suspendeer vervolgens de kralen in 300 microliters bindingsbuffer.
Splits de gesuspendeerde kralen in twee buizen met 150 microliters in elke buis. Voeg vervolgens 1,5 microliters calciumchloride of EDTA toe voor de calcium- en geen calcium-condities respectievelijk. Breng 100 microliters van elke conditie over naar een depressie.
Schuif onder een doorlichtingsmicroscoop. Verzamel beelden van vijf beeldvelden voor elk experiment op elk gewenst tijdstip. Gebruik beeld J of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
Open een van de vijf beeldgegevenssets in beeld J in het vervolgkeuzemenu. Selecteer bovenaan het scherm bestand. Selecteer vervolgens importeer, vervolgens beeldsequentie.
Zoek de map met de beeldbestanden en open ze vervolgens als een beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op beeld en selecteer eigenschappen. Om het eigenschappenvenster daar te openen.
Verander de beeldeenheden naar pixels en stel de pixelbreedte en pixelhoogte in op 1,0. Klik opnieuw op beeld, selecteer aanpassen en vervolgens drempel om het drempelvenster te openen en gebruik de schuifregelaar om de beelddrempel aan te passen. Neem pixels op die bijdragen aan kralen en sluit kleine deeltjes uit.
Pas de drempel toe op alle beelden in de beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op analyseren.
Selecteer vervolgens meetinstellingen instellen om het meetdialoogvenster te openen. Gebruik de selectievakjes om gebied en stapelpositie bovenaan het scherm te selecteren. Klik op analyseren en selecteer vervolgens deeltjes analyseren. Dit genereert een lijst van geïdentificeerde deeltjes, inclusief hun grootte en het beeld waarin ze zijn geïdentificeerd.
Herhaal dit proces voor elk experiment en elke experimentele conditie om de calciumafhankelijke adhesievermogen van zebravis en cadherine te bepalen. HEC 2 9 3-cellen werden getransfecteerd met de NCAT herrin OD-domein gefuseerd met twee fc en na calciumafhankelijke kraalaggregatie werden cellen geïmaged en geanalyseerd zoals beschreven in deze video, zoals te zien is in deze afbeeldingen. Bij afwezigheid van calcium vertonen de kralen weinig of geen neiging tot aggregatie, en er is geen toename in aggregaatgrootte met de tijd in aanwezigheid van calcium.
Echter, beats gecoat met NCAT hier en ECFC vertonen robuu
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle methode voor het karakteriseren van de adhesie-eigenschappen van celhechtingsmoleculen met behulp van ectodomeinfragmenten. De techniek omvat het vastleggen van uitgescheiden, epitoop-gelabelde ectodomeinen op gefunctioneerde kralen voor parelkettingsassays.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Celhechting
- Eiwitinteracties
- Biochemische assays
Achtergrond
- Het begrijpen van celhechting is cruciaal voor verschillende biologische processen.
- Traditionele methoden kunnen tijdrovend en complex zijn.
- Deze methode beoogt de beoordeling van eiwit-adhesie-eigenschappen te vereenvoudigen.
- Homofiele hechting is een belangrijke focus van de studie.
Doel van Studie
- Om een snelle en eenvoudige methode te ontwikkelen voor het testen van eiwitectodomein-adhesie.
- Om de adhesie-activiteit van specifieke eiwitten te evalueren.
- Om bestaande celaggregatie-assays te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Transfectie van plasmiden die coderen voor ectodomeinfragmenten in HEC 2 93 cellen.
- Vastlegging van uitgescheiden FC-fusie-eiwitten op magnetische kralen geconjugeerd met eiwit G.
- Interactie van beklede kralen in oplossing gevolgd door beeldvorming.
- Kwantificering van parelketting met behulp van beeldanalyse.
Belangrijkste Resultaten
- De methode maakt direct testen van eiwit-adhesiemogelijkheden mogelijk.
- Resultaten geven aan of het eiwit homofiele hechting kan mediëren.
- Is aangetoond sneller en eenvoudiger te zijn dan traditionele methoden.
- Biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van celhechtingsmoleculen.
Conclusies
- Deze techniek biedt een gestroomlijnde aanpak om eiwit-adhesie te beoordelen.
- Het heeft potentiële toepassingen in verschillende biologische onderzoeksgebieden.
- Toekomstige studies kunnen op deze methode voortbouwen om andere adhesie-eigenschappen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Rapid characterization of cell adhesion molecules is critical for de-risking early discovery targets and clarifying mechanistic hypotheses in cell biology-driven therapeutic programs. The bead aggregation assay enables direct, quantitative assessment of homophilic adhesion properties, supporting predictive confidence in target selection and functional validation. This streamlined workflow reduces ambiguity in protein function, accelerating portfolio triage and prioritization at the discovery inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-mediated cell adhesion mechanisms for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing intrinsic adhesive properties of candidate molecules.
- Facilitates rapid functional assessment to inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Provides a platform for mutagenesis studies to map critical adhesion domains.
Screening & Assay Development
- Delivers a reproducible, quantitative assay for evaluating adhesive activity of protein ectodomains.
- Standardizes measurement of bead aggregation, supporting assay transferability and scalability.
- Enables preparation of validated bead-based systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
- Reduces reliance on stable cell lines, increasing throughput and flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms where cell adhesion is implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Provides semi-quantitative outputs that can inform translational biomarker strategies when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This bead aggregation assay fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge between molecular characterization and functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for cell adhesion function and pathway mapping.
- Screening: Offers quantitative, reproducible readouts for comparing protein variants or conditions.
- Analytics: Generates image-based measurements of aggregate size and kinetics for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease models where adhesion is a key driver.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular assay platform adaptable to diverse protein targets and mutational analyses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, scalable, and standardized assay procedures.
- Strategic Value: Enables earlier, data-driven go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of adhesion-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and quantitative image analysis.
- Needs access to protein G magnetic beads, imaging systems, and analysis software such as ImageJ.
- Demands strict adherence to protocol for reproducibility and cross-team standardization.
- Can be adapted to different protein targets and mutational studies with minimal optimization.
- Limited by the need for soluble ectodomain expression and bead compatibility with target proteins.
