Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van eiwitecto-domeinen te testen om homofiele adhesie te mediëren om dit te bereiken, worden plasmiden die coderen voor de fusie van een ecto-domeinfragment naar het FC-gebied van humaan IgG getransfecteerd in HEC 2 93-cellen. De uitgescheiden Odin FC-fusie-eiwitten worden gevangen op magnetische kralen geconjugeerd aan proteïne G en na een wasbeurt, worden de gecoate kralen toegelaten om te interageren in oplossing. De gecoate kralen worden vervolgens geïmaged om de mate van aggregatie te beoordelen en tenslotte, gekwantificeerd. Met behulp van eenvoudige beeldanalyse, onthullen de resulterende gegevens of het eiwit onder studie in staat is om homofiele adhesie te mediëren.

De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals celadhesie-assays, is dat het snel, eenvoudig is en direct de adhesie-activiteit van uw gekozen eiwit test. Het demonstreren van deze techniek zal Dr. Michelle Eman, een senior wetenschapper van het laboratorium, zijn. Begin deze procedure door de gekweekte cellen voor NCA hier ECFC, twee tot drie dagen vóór transfectie voor te bereiden.

Gebruik 0,05% trips in EDTA om de HEC 2 93-cellen los te maken van kweekschotels. Bereid twee 100 millimeter schotels voor elke conditie. Splits de cellen een tot vijf en kweek ze vervolgens in.

Gesupplementeerd groeimedium. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide tot ze 60 tot 80% confluënt zijn. Op de dag van de transfectie, gebruik een reagens zoals lipo om een plasmide te introduceren dat FC-fusie codeert.

Na de transfectie, breng de cellen terug in de incubator voor 24 uur. De dag na de transfectie, voorverwarm DMEM met pent strep en zonder foetaal bovien serum tot 37 graden Celsius. Spoel elke schotel twee keer met 10 milliliter van het verwarmde medium en breng de schotels vervolgens terug in de 37 graden Celsius incubator gedurende één uur. Na de incubatie, spoel de kweekschotels nog één keer met 10 milliliter DMEM zonder foetaal bovien serum voor een totaal van drie wasbeurten, en bewaar de gekweekte cellen vervolgens gedurende nog eens 48 uur bij 37 graden Celsius voordat het medium wordt verzameld. Vier dagen na transfectie, gebruik een serologische pipette om het medium van elk paar kweekschotels te verzamelen en over te brengen naar een 50 milliliter conische buis.

Centrifugeer vervolgens het medium bij 500 Gs gedurende vijf minuten om de cellulaire deeltjes te pellen. Na het centrifugeren, giet het medium van elke 50 milliliter conische buis in een 30 milliliter spuit en filter het door een 0,45 micron spuit. Filter in een centrifugaal concentrator. Spuit de centrifugaalfilters totdat het volume van geconcentreerd kweekmedium is verminderd tot ongeveer 500 microliters.

Dit duurt ongeveer 15 minuten. Herhaal dit proces totdat al het kweekmedium is toegevoegd en geconcentreerd. Vervolgens, in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor elk monster bij 1,5 microliters van proteïne G magnetische kralen tot één milliliter ijskoud bindingsbuffer.

Het moeilijkste aspect van deze procedure is de kraalaggregatie. Om succes te garanderen, zorg ervoor dat u de procedure precies volgt. Bekijk de kralen snel, maar niet te hard.

Ze mogen nooit drogen op de zijkant van de buis of te lang op de magneet blijven. Plaats de buis op een magneet en gebruik een pipette om de buffer af te zuigen. Voeg vervolgens onmiddellijk het geconcentreerde kweekmedium toe aan de proteïne G magnetische kralen.

Roteer de buizen bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Plaats de buizen op een magneet en verwijder het medium snel. Was de kralen twee keer met één milliliter ijskoud bindingsbuffer en suspendeer vervolgens de kralen in 300 microliters bindingsbuffer.

Splits de gesuspendeerde kralen in twee buizen met 150 microliters in elke buis. Voeg vervolgens 1,5 microliters calciumchloride of EDTA toe voor de calcium- en geen calcium-condities respectievelijk. Breng 100 microliters van elke conditie over naar een depressie.

Schuif onder een doorlichtingsmicroscoop. Verzamel beelden van vijf beeldvelden voor elk experiment op elk gewenst tijdstip. Gebruik beeld J of vergelijkbare beeldanalysesoftware.

Open een van de vijf beeldgegevenssets in beeld J in het vervolgkeuzemenu. Selecteer bovenaan het scherm bestand. Selecteer vervolgens importeer, vervolgens beeldsequentie.

Zoek de map met de beeldbestanden en open ze vervolgens als een beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op beeld en selecteer eigenschappen. Om het eigenschappenvenster daar te openen.

Verander de beeldeenheden naar pixels en stel de pixelbreedte en pixelhoogte in op 1,0. Klik opnieuw op beeld, selecteer aanpassen en vervolgens drempel om het drempelvenster te openen en gebruik de schuifregelaar om de beelddrempel aan te passen. Neem pixels op die bijdragen aan kralen en sluit kleine deeltjes uit.

Pas de drempel toe op alle beelden in de beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op analyseren.

Selecteer vervolgens meetinstellingen instellen om het meetdialoogvenster te openen. Gebruik de selectievakjes om gebied en stapelpositie bovenaan het scherm te selecteren. Klik op analyseren en selecteer vervolgens deeltjes analyseren. Dit genereert een lijst van geïdentificeerde deeltjes, inclusief hun grootte en het beeld waarin ze zijn geïdentificeerd.

Herhaal dit proces voor elk experiment en elke experimentele conditie om de calciumafhankelijke adhesievermogen van zebravis en cadherine te bepalen. HEC 2 9 3-cellen werden getransfecteerd met de NCAT herrin OD-domein gefuseerd met twee fc en na calciumafhankelijke kraalaggregatie werden cellen geïmaged en geanalyseerd zoals beschreven in deze video, zoals te zien is in deze afbeeldingen. Bij afwezigheid van calcium vertonen de kralen weinig of geen neiging tot aggregatie, en er is geen toename in aggregaatgrootte met de tijd in aanwezigheid van calcium.

Echter, beats gecoat met NCAT hier en ECFC vertonen robuu