Name: Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer een snelle methode voor het karakteriseren van celadhesiemoleculen met behulp van ectodomeinfragmenten en magnetische kralen. Deze techniek test direct de adhesieve eigenschappen van eiwitten in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een NSF/ARRA-subsidie (IOS 0920357) en een subsidie van de NIH (5R21MH098463).

1 Cell Voorbereiding (dag -2 tot 0) <ol><li> Split HEK293 cellen 1: 5 met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing en incubeer in groeimedia bij 37 ° C met 5% CO2 totdat 60 - 80% confluent (2-3 dagen). Voor elke aandoening, cultuur cellen in 2 x 100 mm gerechten. </li></ol> 2 celtransfectie (Dag 1) <ol><li> Transfecteren HEK293 cellen met plasmide codeert Fc-fusie met een transfectie reagens zoals Lipofectamine. Alternatieve methoden die resulteren in vergelijkbare transfectie efficiënties kunnen ook worden gebruikt. </li><li> Terug getransfecteerde cellen incubator gedurende 24 uur. </li></ol> 3 Cell Voortplanting (Dag 2) <ol><li> Verwarm Growth Media zonder foetaal runderserum (-FBS) tot 37 ° C. </li><li> Spoel schotels 2x met 10 ml Groei Media -FBS, en de terugkeer van de gerechten tot de 37 ° C incubator gedurende 1 uur. </li><li> Spoel de kweken gerechten een keer met 10 ml kweekmedium -FBS, voor een totaal van 3 wasbehandelingen. </li><li> Incubate de getransfecteerde HEK293 cellen bij 37 ° C gedurende nog 48 uur zonder FBS voor het verzamelen media. </li></ol> 4 Bead Aggregation (dag 4) <ol><li> Om media vanaf kweekschaaltjes verzamelen, overbrengen media van elk paar gerechten tot 50 ml conische buizen en draaien op 500 xg gedurende 5 minuten om cellulaire puin neer te slaan. </li><li> Filter media uit 50 ml conische buis in een centrifugaal filter met behulp van een 30 ml spuit en 0,45 pm spuitfilter. </li><li> Spin centrifugale filters bij 4.000 xg en 4 ° C tot het volume geconcentreerd kweekmedium is ongeveer 500 pi (ongeveer 15 min). Herhaal dit tot alle kweekmedia toegevoegd en geconcentreerd. </li><li> Voeg 1,5 ul Proteïne G magnetische kralen 1 ml ijskoude bindingsbuffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis voor elk monster, plaats op een magneet en verwijdert buffer. Voeg onmiddellijk de geconcentreerde kweekmedium aan de Proteïne G magnetische korrels. </li><li> Draai buizen bij 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Place-buizen op een magneet en verwijder media. Snel wassen kralen tweemaal met ijskoud 1 ml Binding Buffer, en vervolgens opnieuw in suspensie kralen in 300 ul Binding Buffer. </li><li> Split geresuspendeerd parels in 2 buizen, 150 ul in elke buis en voeg 1,5 ul van 200 mM CaCl2 en 200 mM EDTA de &quot;calcium&quot; en &quot;no calcium&quot; omstandigheden respectievelijk. </li><li> Breng 100 pi van elke aandoening depressie goed glijden en laat microfoto met een doorvallend licht microscoop (figuur 2). Verzamel beelden van 5 gezichtsveld voor elk experiment op elk gewenst tijdstip. </li></ol> 5 Data Analysis <ol><li> Met behulp van ImageJ, of vergelijkbare software voor beeldanalyse, opent u een van de vijf beelddatasets behulp van de Import / Afbeelding Sequence ... uit het File pulldown menu. Deze wordt geopend als afbeeldingsstapel. </li><li> In het Beeld / Eigenschappen ... dialoogvenster veranderen de image eenheden naar pixels en stel Pixel Breedte en Pixel Hoogte tot 1,0. </li><li> Converteer de beelden naar binair via de Adjust / Drempel ... commando in het Afbeelding pulldown menu. Stel de drempel om pixels die bijdragen aan kralen of kralen aggregaten omvatten, maar dat uitgesloten achtergrond en kleine deeltjes. Toegepast op alle beelden in de stapel. </li><li> Klik in het dialoogvenster Metingen Set doos, controleer dan de dozen Ruimte en Stack Position. </li><li> Run Analyseer Deeltjes ... in het Analyseren pulldown menu. Dit zal een lijst van de geïdentificeerde deeltjes, met inbegrip van hun grootte (gebied) en het beeld waarin ze werden geïdentificeerd genereren. </li><li> Herhaal dit proces voor die experiment en experimentele conditie. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Celhechting een essentieel kenmerk van meercellig leven en wordt gemedieerd door een brede reeks celoppervlak eiwitten. Hiervan worden de gedetailleerde kleefeigenschappen begrepen slechts een relatief klein deel. Hier hebben we een eenvoudige, snelle protocol beschreven voor het onderzoeken van de homofiele hechtmiddel aantal uitgescheiden ectodomeinen gefuseerd aan een geschikte epitoop tag. Deze benadering heeft een aantal belangrijke voordelen. Eerst worden stabiele cellijnen niet nodig 14,20, voldoende h...

Adhesie van cellen is essentieel voor de ontwikkeling en integriteit van meercellige organismen en wordt gemedieerd door een diverse reeks van celoppervlakmoleculen. Veel van deze adhesiemoleculen zijn geïdentificeerd en gekarakteriseerd, hoewel velen nog worden ontdekt. Verschillende methoden worden gebruikt om de eigenschappen van celadhesie moleculen (CAMs), inclusief celsortering assays, cel aggregatie assays 1-8 en biofysische werkwijzen zoals atomic force microscopie en oppervlaktekracht spectroscopie 9-12 onderzoeken. De complexiteit zelfs vereenvoudigde in vitro systemen die cellijnen bemoeilijkt de kleefeigenschappen van een vermeende CAM bepalen. Typisch wordt een molecuul als een CAM indien induceert cel aggregatie bij getransfecteerd in een niet hechtende cellijn. Het is echter duidelijk dat dit niet direct bewijs kleefmiddel activiteit. Bijvoorbeeld, het celoppervlak levering of stabiliteit van een vergemakkelijkingCAM leidt ook tot verhoogde celaggregatie 1,13. Bovendien kan een echte CAM niet aan celaggregatie mediëren als de cellijn mist andere co-factoren nodig zijn voor celoppervlak levering of stabilisatie. Om deze complicerende factoren te vermijden, meer direct testen kunnen worden gebruikt die zijn gebaseerd op het idee dat bindingsinteracties dient een intrinsieke biochemische eigenschap van het extracellulaire domein. Terwijl korrels aanvankelijk gebruikt Ng-CAM 2 karakteriseren, zijn deze assays uitgebreid om-cadherine-gemedieerde adhesie 12,14,15 onderzoeken. Met fusie van de C-cadherine ectodomein-Fc-fusies, de Gumbiner lab bleek dat meerdere cadherine herhalingen bijdragen tot 14 homofiele interacties. Met vergelijkbare kraal aggregatie assays, E-cadherine en N-cadherine hechting zijn ook gekarakteriseerd 12,15, evenals een aantal protocadherines 1,15-18 en Dscam isovormen van Drosophila <em&gt; 19. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en snelle test voor het karakteriseren van de kleefstof activiteit van uitgescheiden, epitoop-gemerkte ectodomeinen van vermoedelijke homophilic CAMs (figuur 1). We hebben deze assay gebruikt hoofdzakelijk, leden van de cadherine-superfamilie karakteriseren.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 plasmid</td><td>Addgene</td><td>Te dienen</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads – Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Depressieschuifjes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugafiltereenheid met Ultracel-10 membraan</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm spuitfilter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magneet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Beeldanalysesoftware</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel van Buffers/Oplossingen</td></tr><tr><td>Groeimedium</td><td>DMEM + 10% FBS + Pen-Strep</td><td>Filter steriliseren en bewaren bij 4 &deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>Groeimedium –FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filter steriliseren en bewaren bij 4 &deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>Binding Buffer</td><td>50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vortex tot oplossing, op ijs bewaren.</td><td></td></tr></tbody></table>

kraal aggregation testen voor de karakterisering van vermoedelijke celadhesiemoleculen

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cel-cel adhesie is fundamenteel voor meercellig leven en wordt gemedieerd door een divers scala aan eiwitten van het celoppervlak. Echter, de bindingsinteracties voor veel van deze eiwitten slecht begrepen. Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de klevende eigenschappen van vermeende homofiele celadhesiemoleculen. Gekweekte HEK293 cellen getransfecteerd met DNA dat codeert voor een uitgescheiden, epitoop-gelabelde ectodomein van een celoppervlakte-eiwit. Met gefunctionaliseerde kralen specifiek voor het epitoop tag, wordt de oplosbare, uitgescheiden fusie-eiwit gevangen uit het kweekmedium. De beklede korrels kunnen vervolgens direct in kraal aggregatie assays of fluorescente kralen sortering assays om te testen op homofiele adhesie. Desgewenst kan mutagenese dan worden gebruikt om de specifieke aminozuren of domeinen die voor hechting helderen. Deze test vereist slechts kleine hoeveelheden van tot expressie gebracht eiwit, niet vereist de productie van stabiele cellijnen en kan worden ACCOmplished in 4 dagen.

<html> Een voorbeeld experiment wordt gepresenteerd in figuur 2, die calcium afhankelijk bead aggregatie toont het ectodomein van N-cadherine gefuseerd aan Fc (NcadEC-Fc). Aangezien calcium, parels vertonen weinig of geen neiging tot aggregeren en er is geen toename in korrelgrootte tijd (Figuur 1 A, C). In de aanwezigheid van calcium, kralen bekleed met NcadEC-Fc tonen robuuste aggregatie, met totale grootte verhoging in de tijd (Figuur 1B, C). Dit experiment werd driem...

Hier presenteren we een eenvoudige, snelle methode voor het karakteriseren van de intrinsieke adhesieve eigenschappen van vermeende celadhesiemoleculen. Het uitgescheiden, epatoom-getagde ectodomein van een celadhesiemolecuul wordt gevangen uit het kweekmedium op kleine, uniforme functionele kralen. Deze kralen kunnen vervolgens onmiddellijk worden gebruikt in eenvoudige kralagomaggregatie-assays.

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van eiwitecto-domeinen te testen om homofiele adhesie te mediëren om dit te bereiken, worden plasmiden die coderen voor de fusie van een ecto-domeinfragment naar het FC-gebied van humaan IgG getransfecteerd in HEC 2 93-cellen. De uitgescheiden Odin FC-fusie-eiwitten worden gevangen op magnetische kralen geconjugeerd aan proteïne G en na een wasbeurt, worden de gecoate kralen toegelaten om te interageren in oplossing. De gecoate kralen worden vervolgens geïmaged om de mate van aggregatie te beoordelen en tenslotte, gekwantificeerd. Met behulp van eenvoudige beeldanalyse, onthullen de resulterende gegevens of het eiwit onder studie in staat is om homofiele adhesie te mediëren.De belangrijkste voordelen van deze techniek boven bestaande methoden zoals celadhesie-assays, is dat het snel, eenvoudig is en direct de adhesie-activiteit van uw gekozen eiwit test. Het demonstreren van deze techniek zal Dr. Michelle Eman, een senior wetenschapper van het laboratorium, zijn. Begin deze procedure door de gekweekte cellen voor NCA hier ECFC, twee tot drie dagen vóór transfectie voor te bereiden.Gebruik 0,05% trips in EDTA om de HEC 2 93-cellen los te maken van kweekschotels. Bereid twee 100 millimeter schotels voor elke conditie. Splits de cellen een tot vijf en kweek ze vervolgens in.Gesupplementeerd groeimedium. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide tot ze 60 tot 80% confluënt zijn. Op de dag van de transfectie, gebruik een reagens zoals lipo om een plasmide te introduceren dat FC-fusie codeert.Na de transfectie, breng de cellen terug in de incubator voor 24 uur. De dag na de transfectie, voorverwarm DMEM met pent strep en zonder foetaal bovien serum tot 37 graden Celsius. Spoel elke schotel twee keer met 10 milliliter van het verwarmde medium en breng de schotels vervolgens terug in de 37 graden Celsius incubator gedurende één uur. Na de incubatie, spoel de kweekschotels nog één keer met 10 milliliter DMEM zonder foetaal bovien serum voor een totaal van drie wasbeurten, en bewaar de gekweekte cellen vervolgens gedurende nog eens 48 uur bij 37 graden Celsius voordat het medium wordt verzameld. Vier dagen na transfectie, gebruik een serologische pipette om het medium van elk paar kweekschotels te verzamelen en over te brengen naar een 50 milliliter conische buis.Centrifugeer vervolgens het medium bij 500 Gs gedurende vijf minuten om de cellulaire deeltjes te pellen. Na het centrifugeren, giet het medium van elke 50 milliliter conische buis in een 30 milliliter spuit en filter het door een 0,45 micron spuit. Filter in een centrifugaal concentrator. Spuit de centrifugaalfilters totdat het volume van geconcentreerd kweekmedium is verminderd tot ongeveer 500 microliters.Dit duurt ongeveer 15 minuten. Herhaal dit proces totdat al het kweekmedium is toegevoegd en geconcentreerd. Vervolgens, in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor elk monster bij 1,5 microliters van proteïne G magnetische kralen tot één milliliter ijskoud bindingsbuffer.Het moeilijkste aspect van deze procedure is de kraalaggregatie. Om succes te garanderen, zorg ervoor dat u de procedure precies volgt. Bekijk de kralen snel, maar niet te hard.
Ze mogen nooit drogen op de zijkant van de buis of te lang op de magneet blijven. Plaats de buis op een magneet en gebruik een pipette om de buffer af te zuigen. Voeg vervolgens onmiddellijk het geconcentreerde kweekmedium toe aan de proteïne G magnetische kralen.Roteer de buizen bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Plaats de buizen op een magneet en verwijder het medium snel. Was de kralen twee keer met één milliliter ijskoud bindingsbuffer en suspendeer vervolgens de kralen in 300 microliters bindingsbuffer.Splits de gesuspendeerde kralen in twee buizen met 150 microliters in elke buis. Voeg vervolgens 1,5 microliters calciumchloride of EDTA toe voor de calcium- en geen calcium-condities respectievelijk. Breng 100 microliters van elke conditie over naar een depressie.
Schuif onder een doorlichtingsmicroscoop. Verzamel beelden van vijf beeldvelden voor elk experiment op elk gewenst tijdstip. Gebruik beeld J of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
Open een van de vijf beeldgegevenssets in beeld J in het vervolgkeuzemenu. Selecteer bovenaan het scherm bestand. Selecteer vervolgens importeer, vervolgens beeldsequentie.
Zoek de map met de beeldbestanden en open ze vervolgens als een beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op beeld en selecteer eigenschappen. Om het eigenschappenvenster daar te openen.
Verander de beeldeenheden naar pixels en stel de pixelbreedte en pixelhoogte in op 1,0. Klik opnieuw op beeld, selecteer aanpassen en vervolgens drempel om het drempelvenster te openen en gebruik de schuifregelaar om de beelddrempel aan te passen. Neem pixels op die bijdragen aan kralen en sluit kleine deeltjes uit.
Pas de drempel toe op alle beelden in de beeldstapel. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu bovenaan het scherm op analyseren.
Selecteer vervolgens meetinstellingen instellen om het meetdialoogvenster te openen. Gebruik de selectievakjes om gebied en stapelpositie bovenaan het scherm te selecteren. Klik op analyseren en selecteer vervolgens deeltjes analyseren. Dit genereert een lijst van geïdentificeerde deeltjes, inclusief hun grootte en het beeld waarin ze zijn geïdentificeerd.
Herhaal dit proces voor elk experiment en elke experimentele conditie om de calciumafhankelijke adhesievermogen van zebravis en cadherine te bepalen. HEC 2 9 3-cellen werden getransfecteerd met de NCAT herrin OD-domein gefuseerd met twee fc en na calciumafhankelijke kraalaggregatie werden cellen geïmaged en geanalyseerd zoals beschreven in deze video, zoals te zien is in deze afbeeldingen. Bij afwezigheid van calcium vertonen de kralen weinig of geen neiging tot aggregatie, en er is geen toename in aggregaatgrootte met de tijd in aanwezigheid van calcium.
Echter, beats gecoat met NCAT hier en ECFC vertonen robuu

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

In this video, we demonstrate the technique to measure transcellular interactions between synaptic cell adhesion molecules through the HEK cell aggregation assay. In this assay, an equal number of HEK cells expressing a desired presynaptic cell adhesion molecule and a fluorescent protein are mixed with HEK cells expressing a post-synaptic cell adhesion molecule and another fluorescent protein. The interaction between the cell adhesion molecules forces the cells to aggregate, which can be...

Cell Aggregation Assay to Detect Trans Interactions between Cell Adhesion Molecules

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Bacterieel hechting aan gasthercelten is een sleutelstap tijdens gastheerkolonisatie en infectie. Dit protocol beschrijft de generatie van polymeer-gekoppelde recombinante adhesines als biomimetische materialen die analyse van de bijdrage van individuele adhesines aan deze processen mogelijk maken, onafhankelijk van andere bacteriële factoren.

Biomimetische materialen Bacteria-gastheer interacties karakteriseren

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Transcellulaire interacties meten via eiwitaggregatie in een heterologe celsysteem

Het artikel beschrijft kwantificering van 1) de grootte en het aantal focale verklevingen en 2) celvormindex en de verdeling ervan van confocale beelden van de confluent monolagen van MCF7-cellen.

Kwantificering van celsubstraatadhesiegebied en celvormverdelingen in MCF7-celmonolagen

Dit protocol presenteert de experimentele procedures om de adhesievoetafdruktest uit te voeren om de adhesiegebeurtenissen tijdens snelle celrollende adhesie in beeld te brengen.

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Leer een snelle methode voor het karakteriseren van celadhesiemoleculen met behulp van ectodomeinfragmenten en magnetische kralen. Deze techniek test direct de adhesieve eigenschappen van eiwitten in vitro.

Kraal Aggregation Testen voor de karakterisering van Vermoedelijke celadhesiemoleculen

Meer video's verkennen