Name: Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Leer efficiënt gentargeting in menselijke embryonale stamcellen met zink-vinger nucleases. Deze methode maakt precieze genetische modificaties mogelijk voor onderzoek naar CNS-ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk beschreven in dit protocol werd mede mogelijk gemaakt door financiering uit het Victoriaanse regering als onderdeel van een samenwerkingsproject alliantie met het Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM).

Alle procedures worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroming kap uitgevoerd. Alle media en oplossingen worden geëquilibreerd tot 37 ° C tenzij anders aangegeven. 1 Uitbreiding van de Mens PSC (hESC &#39;s en hiPSCs, WA-09 gebruikt in dit protocol) voor transfectie Opmerking: Het is niet nodig om hESCs op Matrigel of Geltrex breiden. hESCs uitgebreid op muis embryonale fibroblasten (MEF) kan worden gebruikt voor elektroporatie of nucleofection na een MEF verwijderingsstap (zie paragraaf 2.8). <ol><li> Bereid 1 x 100 mm schaal en 1 x 75cm2 kolf van DR4 MEFs op 2,0 x 10 4 cellen per cm2 in MEF media (zie tabel 1) op de vaat vooraf gecoat met 0,1% w / v gelatine. Opmerking: CF1, Blk6 of MF1 MEF kan worden gebruikt, echter, is het raadzaam dat de antibiotica-resistente MEF lijnen worden gebruikt, bijvoorbeeld, DR410. </li><li> De volgende dag, passage hESC &#39;s op een 100 mm schaal pre-plated met MEF opgesteld in paragraaf 1.1. Om dit te doen ASPItarief hESC media uit culturen gerechten, wassen hESCs met Ca2 + / Mg2 + -vrije Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), voeg Dispase (zie tabel 2 voor de juiste volumes) en plaats in een bevochtigde incubator bij 37 ° C / 5% CO 2. Na 3-5 minuten incubatie, aspireren Dispase en voorzichtig te wassen 1-2 keer met HBSS om MEF verwijderen. Voeg hESC media (zie tabel 3) en met een cel schraper of 5 ml pipet voorzichtig schrapen de kolonies van het oppervlak van de kweekschaal. </li><li> Verzamel de kolonie fragmenten in suspensie uit de kweekschaal in een 15 ml centrifugebuis. Spoel cultuur schotel met hESC media en transfer naar de buis van 15 ml. Wees voorzichtig om niet breken klonten in enkele cellen of kleine fragmenten. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 160 xg om kolonie fragmenten pellet. </li><li> Aspireren supernatant. Tik bodem van 15 ml buis met vinger aan kolonie fragment pellet los. Zachtjes hersuspendeer kolonie fragmenten in hESC media volgens de split ratio (normallya split verhouding tussen 1: 4 en 1: 8 is van toepassing). Wees zeer voorzichtig niet te klonten in enkele cellen of kleine fragmenten als deze maken zal beïnvloeden opnieuw platen efficiëntie. </li><li> Voorafgaand aan opnieuw platen hESC fragmenten op MEF wassen 1x met HBSS. Voeg langzaam de juiste hoeveelheid (zie tabel 2) van de cel suspensie die hESC fragmenten in hESC media om gerechten pre-plated met MEF. </li><li> Plaats cultuur gerechten op plank in incubator en beweeg langzaam heen en weer en heen en weer om kolonie fragmenten gelijkmatig te verdelen. </li><li> Vervang dagelijks hESC media. </li><li> Om geconditioneerde media van MEF (MEF-CM) bereiden Was de 75 cm 2 fles pre-plated met MEF 1 x met HBSS. Voeg hESC media. Na 24 uur, verzamelen geconditioneerde media en te vervangen door verse hESC media. Dagelijks herhalen voor maximaal 12 dagen. Slaan MEF-CM bij 4 ° C totdat het nodig is. </li></ol> 2 Voorbereiding van de Mens SER voor Transfection <ol><li> Let op de groei van hESCsonder een microscoop dagelijks. Wanneer kolonies worden 40-50% samenvloeiing, plaat 3 x 100 mm schalen met 2,0 x 10 5 MEF per cm 2. </li><li> Wanneer kolonies worden 60-70% samenvloeiing zijn ze klaar om te worden getransfecteerd. &#39;Groom&#39; kolonies door het verwijderen van gedifferentieerde koloniën of kolonie kernen. Let op: Omdat wij geloven hogere transfectie en targeting efficiëntie ontstaan ​​wanneer cellen in de log-fase groei, wordt gesuggereerd dat elektroporatie worden uitgevoerd voordat hESCs bereiken ≥ 70% samenvloeiing. </li><li> Was hESC kolonies met HBSS en voeg Accutase. Opmerking: Het is niet nodig om voor te behandelen hESCs met ROCK remmer Y-27632 als voldoende remming vindt plaats wanneer geïncubeerd met Y-27632 tijdens stap 2.7 </li><li> Incubeer gedurende 10 - 20 minuten bij 37 ° C / 5% CO2 totdat kolonies worden weergegeven als enkele cellen bekeken onder een microscoop. Vermaal cellen met een pipet 1 ml. </li><li> Voeg hESC media en filter in een 15 ml conische buis met behulp van een 40 micrometer cel strainer om celklonten verwijderen. </li><li> Centrifugeer bij 160 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer celpellet in verse hESC media en herhalen om eventueel resterende Accutase oplossing te verwijderen. </li><li> Resuspendeer cellen in hESC media met 10 uM Y-27632 en breng de totale celsuspensie om een ​​100 mm schaal vooraf gecoat met gelatine. </li><li> Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten. </li><li> Gedurende deze tijd zal MEF houden aan de gelatine beklede schotel. Collect niet-hechtende hESCs met een pipet 1 ml in een verse 15 ml centrifugebuis en bepalen celdichtheid met behulp van een hemocytometer. </li></ol> 3 Elektroporatie van hESCs <ol><li> Filter CM-MEF media met een 0,22 urn filter en voeg 10 ng / ml recombinant humaan fibroblast groeifactor 2 (rhFGF2). </li><li> Transfer 7.5 x 106 hESCs uit sectie 2.9 in nieuw 15 ml conische buis en centrifugeer bij 160 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Gedurende deze tijd het opzetten van de electroporator: Kies het programma voor exponentiële electroporation en stel de volgende parameters, Voltage: 250 V, Capaciteit: 500 uF, en Resistance: ∞-. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer cel pellet in 0,8 ml ijskoude 0,22 pm gefilterd HBSS. Breng de oplossing van een steriele 0,4 cm elektroporatie cuvet. </li><li> Voeg TV-hPITX3-forward targeting construct (30 pg DNA) en meng voorzichtig met een 200 ul pipet. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Gedurende deze tijd verwijdert u een monster van PITX3 ZFN mRNA en ontdooien op ijs. Toen ontdooide overdracht 7,5 pi van ZFN mRNA tot DNA / cel mengsel in elektroporatiecuvet. Meng voorzichtig met een 200 ul pipet. Opmerking: De locus doelwit is de belangrijkste factor die bijdraagt ​​aan targeting efficiency. Loci coderende stille genen, genen die niet uitgedrukt in SER, zoals PITX3 moeilijk te richten met conventionele homologe recombinatie 6. Dus, maakt gebruik van dit protocol op maat ontworpen ZFNs voor het menselijk PITX3 locus een DNA dubbele streng b inducerenreak. </li><li> Electroporate door het volgen van de instructies op het scherm op de electroporator. </li><li> Met behulp van een 200 ul pipet breng de inhoud van de elektroporatie cuvet een 15 ml buis met 10 ml hESC media. Was de cuvette tweemaal met 200 ul van hESC media telkens en overbrengen in een 15 ml buis. Er zullen &quot;slijm-achtige&quot; puin bestaande uit DNA en eiwit uit de gelyseerde cellen die negatief uitwerkt celoverleving. Centrifugeer bij 160 xg gedurende 5 minuten bij het vuil te verwijderen. </li><li> Zuig het supernatant en tik zachtjes cel pellet los te maken. Re-schorten in 30 ml aangevuld MEF-CM met 10 uM Y-27632 en replate op 3 x 100 mm gerechten preplated met MEF. </li><li> Veranderen dagelijks de media. Op dag 2, kan Y-27632 worden ingetrokken en gekweekt in enkel hESC media. </li><li> Na 2-3 dagen de hESCs 50-70% confluent zouden zijn. Op dit punt beginnen antibioticumselectie (bijvoorbeeld 0,5 ug / ml puromycine). </li><li> Behouden selectie door het toevoegen van verse hESC / puromycine- media dagelijks. Na ~ 7 dagen kleine kolonies zichtbaar zijn. Als antibiotica resistente MEFs niet worden gebruikt, kunnen MEFs worden aangevuld door toevoeging van een extra 1,0 x 10 4 cellen per cm2. </li></ol> 4 Picking Transgene hESC Clones <ol><li> Ongeveer 14-21 dagen na selectie (wanneer kolonies ~ 1 mm diameter hebben bereikt) bereiden platen voor uitbreiding en screening. Begin met ontdooien een hoeveelheid van Matrigel of Geltrex bij 4 ° C gedurende ten minste 5 uur. Verdun volgens instructies van de fabrikant en voeg 75 ul aan elk putje van 3 x 96-well platen. Bereid 3 x 48-well platen door uitplating MEFs op 2,0 x 10 4 cellen per cm2. Incubeer beide platen O / N bij 37 ° C / 5% CO2. </li><li> De volgende dag ontleden kolonies in 16-25 stukken met een 21 G naald op het uiteinde van een pipet 2 ml door snijden van een raster. </li><li> Aspireren Matrigel van 96-well platen en vervang met Aanvteerde CM-MEF media. Was MEF in 48-well platen 1 x met HBSS en voeg hESC media. </li><li> Met behulp van een pipet 200 ul zacht overdracht 1/3 van de kolonie ontleed in een 48-well plaat voor uitbreiding. Breng de overige 2/3 van de kolonie ontleed in een overeenkomstige 96-wells plaat met aangevuld CM-MEF media. </li><li> Aanvullen beide platen door dagelijks wisselende media (aangevuld CM-MEF media voor 96-well Matrigel beklede platen en hESC media voor 48-well platen met MEFs, beide gesupplementeerd met 0,5 ug / ml puromycine). </li><li> Expand tot 96-well platen zijn 100% confluent en aanvankelijk screenen via PCR. </li></ol> 5 Screening en uitbreiding van positieve klonen <ol><li> Om genomische DNA (methode op basis van 11) voor te bereiden verwijder al het papier uit platen door het omkeren, dan deppen op keukenpapier. </li><li> Spoel elk putje tweemaal met RT PBS (100 ul / well elke wasbeurt), omkeren en vlek als bij stap 5.1. Plaats platen bij -80 ° Cfof 1-2 uur om te helpen bij cellysis (platen kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen als dit). </li><li> Terwijl cellen bij -80 ° C te Sarcosyl Lysis Buffer (zie tabel 4) (50 gl / putje). Cellen, warm platen lyseren voor 5 min bij RT en pipetteer vervolgens lysis buffer in elk putje. Verzegel de randen van elke plaat met tape, plaats in een afsluitbare houder met vochtige papieren handdoeken vocht te maken, en incubeer O / N bij 60 ° C. </li><li> Na incubatie met 150 ul van 5M NaCl tot 10 ml van -20 ° C absolute ethanol, meng goed en voeg 100 ul aan elk putje (Opmerking: ethanol zal troebel gaan als NaCl wordt toegevoegd). Tik platen voorzichtig te mengen (niet pipet) en laat gedurende minimaal 30 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd de oplossing helder worden en het DNA precipiteren. </li><li> Verwijder oplossing in stap 5.1 voeg 150 pl 70% ethanol aan elke well. Omkeren plaat voorzichtig en dep als voorheen. Herhaal deze stap nog 2x. Let op: Omdat de neergeslagen DNA natuurlijk Adheres aan de weefselkweek plastic het niet verdreven tijdens deze stappen wassen geworden.) </li><li> Na de laatste wassing kort centrifuge platen bij topsnelheid om het DNA op de bodem van elk putje vervolgens aan de lucht drogen bij kamertemperatuur (of 37 ° C) gedurende ten minste 30 min concentreren. </li><li> Voeg 40 - 50 gl T0.1E (pH 8,0) (zie tabel 5) of TE (pH 8,0) aan elk putje en plaats platen bij 65 ° C gedurende 1 uur of bij 4 ° CO / N alvorens voor PCR. Resuspendeer DNA door de zijkanten van de plaat te tikken. Gebruik 1-2 ul geresuspendeerde DNA / 10 ul PCR reactie. </li><li> Met behulp van het uitbreiden Long Template PCR System met hPITX3 L arm gen. F en hPITX3 L arm GFP R primers uitvoeren initiële screening van klonen bij 58 ° C annealing, extensie 45 sec, 35 cycli. </li><li> Electrophorèse monsters met Hyperladder 1kb in een 1% agarosegel bevattende GelRed bij 100 V gedurende 45 minuten en detecteren positieve klonen via UV belichting. </li><li> Bevestig PCR positieve klonen door digestie van genomisch DNA van expahebben gereageerd klonen (zie hieronder) met HindIII en hybridiserende probes 5 &#39;en 3&#39; van de vector homologie-armen een Southern blot (zoals eerder beschreven in 1). Probes worden gegenereerd door PCR met primer paren hPITX3 5 &#39;probe F en R en hPITX3 3&#39;probe F en R, gedigereerd met EcoRI en geligeerd in de algemene kloneringsvector. </li><li> Afhankelijk van het aantal positieve klonen te bereiden 2 putjes van een 6-well plaat door pre-plating met MEF (2,0 x 10 4 cellen per cm2). </li><li> De volgende dag voorbehandelen positieve klonen in de 48-well plaat met 10 pM Y-27632 minimaal 1 uur. </li><li> Was positieve klonen met HBSS en voeg 300 ul Accutase. </li><li> Wanneer kolonies worden gerenderd enkele cellen, voeg 1 ml van hESC media en verzamelen in een 15 ml buis. </li><li> Veranderen dagelijks de media. Op dag 2, kan Y-27632 worden ingetrokken en de cellen gekweekt in hESC media. </li><li> Wanneer kolonies 70 - 80% confluent, subcultuur en vries de rest van de colony fragmenten. </li></ol>

<ol><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+Allows+Context-Specific+Isolation+of+Progenitors+of+GABAergic+or+Dopaminergic+Neurons+During+Neural+Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).</li>
<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
<li>Collin, J., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+putting+a+finger+on+stem+cell+biology%3A+zinc+finger+nuclease-driven+targeted+genetic+editing+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects%3A+zinc-finger+nucleases+as+gene+therapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents.</a> Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iESCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+in+human+stem+cells+using+zinc+finger+nucleases+and+integrase-defective+lentiviral+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery.</a> Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).</li>
<li>Boch, J., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthomonas+AvrBs3+family-type+III+effectors%3A+discovery+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function.</a> Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+embryonic+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).</li>
<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De generatie van de reporter cellijnen biedt een krachtig middel op te sporen, te visualiseren en te isoleren cellen van belang uit een heterogene populatie afkomstig van hESC &#39;. Echter, gene targeting via conventionele homologe recombinatie heeft bewezen zeer inefficiënt voor menselijke SER 3 zijn. In dit protocol beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige techniek voor het inbrengen van een RP in exon een van de PITX3 locus, in hESCs behulp van een algemeen gebruikt richtende vector met ZFNs. I...

Voor deze embryonale stamcel (ESC) differentiatie protocollen resulteren in heterogene celpopulaties, met name wat betreft de afleiding van specifieke neuronale fenotypen. Ofschoon kweken bevatten de gewenste cellulaire fenotype, andere neuronale en niet-neuronale en niet-gedifferentieerde celtypen zijn vaak aanwezig 1. Deze eigenschappen beperken de toepassing van ESC afgeleid cel bronnen voor gebruik in celvervangingstherapie en in vitro ziektemodel. Genetische reporter cellijnen bieden een middel te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang, op voorwaarde dat de expressie van het eiwit (RP) reproduceert endogene expressie. Het gebruik van promoters onmiddellijk stroomopwaarts van een gen coderend gebied kan worden gebruikt om ruwe genetische reporters ontlenen maar dergelijke constructen missen de juiste regulerende elementen dat endogene genexpressie. Daarentegen homologe recombinatie biedtmogelijkheid om high-fidelity uitdrukking van de RP te garanderen. In het verleden, richtende vectoren ontworpen voor homologe recombinatie op specifieke loci plaats zijn gebruikt om RP in muizen SER (mESCs) te zoeken via elektroporatie als middel DNA levering 1,2. De generatie van de reporter cellijnen via conventionele homologe recombinatie is echter zeer inefficiënt voor menselijke SER (hESC &#39;s), en dus alleen onderbouwd in een handvol gevallen (beoordeeld in 3). Door een gemanipuleerde chimere eiwit dat een fusie van een Fok I nuclease met plaatsspecifieke zinkvinger motieven, gezamenlijk bekend als zinkvinger nucleasen (ZFNs), DNA dubbelstrengs breuken op vooraf bepaalde genomische loci worden geïntroduceerd. Wanneer een DNA vector met homologie aan beide zijden van de DNA dubbele streng breuk wordt toegevoegd, kan de genomische locatie worden gerepareerd door homologe recombinatie, waardoor de opname van de DNA-sequentie donor. Deze techniek is nuttig gebleken fof genomische bewerken in zowel humane primaire cellen 4,5 en hESCs 6,7. Meer recent werk is gebruikt transcriptie activator-achtige effector nucleases (Talens), transcriptiefactoren gebruikt door plantenpathogenen 8, om te helpen bij het ​​ontwerp van de site-specifieke nucleasen 9. In het volgende protocol tonen we de vorming van een hESC reporter cellijn door elektroporatie van een EGFP die homoloog targeting vector 6 met ZFNs voor de menselijke hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Na antibiotische selectie voor 2-3 weken, kan hESCs met correct geïntegreerde DNA handmatig worden geplukt, uitgebreid en gescreend in eerste instantie via PCR, en vervolgens gevalideerd door Southern blotting.

<table><tbody><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer - 40 &mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0.22 &mu;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm electroporation cuvette</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Human TV-hPITX3-forward targeting construct</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; Human PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids&nbsp; (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp;region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K solution (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F (primer): 5&rsquo; TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3&rsquo;</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm GFP R (primer): 5&rsquo; ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3&rsquo;</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Australia</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

zink-vinger nuclease enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Een belangrijke beperking van de huidige menselijke embryonale stamcellen (ESC) differentiatie protocollen is de generatie van heterogene celpopulaties. Deze kweken bevatten de cellen van belang, maar ook verontreinigd met ongedifferentieerde SER, niet-neurale derivaten en andere neuronale subtypes. Dit beperkt hun gebruik in in vitro en in vivo toepassingen, zoals in vitro model voor geneesmiddelenonderzoek of celvervangingstherapie. Om u te helpen overwinnen van deze, reporter cellijnen, die een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang te bieden, kunnen worden geconstrueerd. Echter, om dit te bereiken in humane embryonale stamcellen via conventionele homologe recombinatie inefficiënt. Dit protocol beschrijft richten van de hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus in humane embryonale stamcellen met aangepaste gemaakt zinkvinger nucleasen die plaats-specifieke dubbelstrengs DNA breuken te introduceren, samen met eenPITX3 - EGFP-specifieke DNA donorvector. Na het genereren van de PITX3 reporter cellijn kan dan worden gedifferentieerd door gepubliceerde protocollen voor gebruik in studies zoals in vitro Parkinson ziektemodel of celvervangingstherapie.

Na co-elektroporatie van de speciaal ontworpen PITX3 zinkvinger pair met de PITX3 - EGFP-specifieke DNA donorvector en daaropvolgende puromycine selectie, werden positieve klonen hESC aanvankelijk gedetecteerd via genomische PCR screening (figuur 1). Southern blot hybridisatie van deze PCR-positieve klonen met 5 &#39;en 3&#39; probes bevestigd correct targeting met exon 1 van het PITX3 locus (figuur 2), met een rendement van 19%. Immunofluorescent bee...

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Het algemene doel van dit protocol is om transgenen efficiënt te targeten naar loci van belang in menselijke embryonale stamcellen met behulp van op maat gemaakte zinkvingernucleasen. Menselijke embryonale stamcellen of HSC's worden uitgebreid om voldoende materiaal te genereren voor elektroporatie, vervolgens worden ze gedigesteerd om enkele cellen te verkrijgen. Vervolgens wordt mRNA dat codeert voor twee op maat gemaakte zinkvingernucleasen samen met de gelinealiseerde EGFP donorsequentie in de HSC's geco-elektroporeerd en vervolgens worden de cellen geplateerd op verse muis embryonale fibroblasten of MEFs.De geëlektroporateerde zinkvingernucleasen introduceren een dubbelstrengsbreuk in het eerste exon van de pit X drie locus in de cellen. Vervolgens wordt de EFGP donorsequentie, die geflankeerd wordt door targeting armen met homologie met de DNA dubbelstrengsbreuk site sequentie, tijdens celdeling na 14 tot 21 dagen opgenomen. Een derde van een individuele HESC kolonie wordt overgebracht naar elke put van een met matrigel gecoate 96-wel plate en de andere twee derden wordt overgebracht naar een overeenkomstige put van een 48-wel plate met verse ME Fs. Wanneer de cellen op de 96

zinc-finger-nuclease-enhanced-gene-targeting-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ondanks de recente ontwikkelingen in genetische modificatie, transfectie van humane embryonale stamcellen (hESC 's) blijft een grillig proces. Voor zover wij weten, zijn systematische en efficiënte methoden om menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) transfecteren niet gemeld. Hier beschrijven we robuuste protocollen om efficiënt te transfecteren en nucleofect menselijke iPSCs.

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

De CompoZr Custom Zink-vinger Nuclease (ZFN) Service maakt een nauwkeurige genoom bewerken in een organisme of cel lijn op elk locus bepaald door de gebruiker. In dit artikel beschrijft het proces voor het ontwerp, de fabricage, validatie en implementatie van de CompoZr Custom ZFN Service.

Genoom bewerken met CompoZr Custom Zinc Finger Nucleasen (ZFNs)

This video demonstrates a technique of zinc-finger nuclease-based genome editing in human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs can potentially be differentiated into various cell types, this technology is helpful for in vitro pathological and pharmacological studies in a patient-specific manner.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: A Technique for Modifying Genome in Human Pluripotent Stem Cells by Double-Stranded Homology Dependant Repair Mechanism

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

TALEN-gemedieerde genre-editing op het veilige haven-locus AAVS1 maakt hoog-efficiënte toevoeging van transgenen mogelijk in menselijke iPSC's. Dit protocol beschrijft de procedures voor het voorbereiden van iPSC's voor TALEN en donorvector-levering, het transfecteren van iPSC's en het selecteren en isoleren van iPSC-klonen om gerichte integratie van een GFP-gen te bereiken voor het genereren van reporter-lijnen.

Transfectie, Selection, en Kolonie-picking van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen TALEN-gericht, met een GFP-gen in de AAVS1 Safe Harbor

Genoombewerking van humane pluripotente stamcellen (hPSC's) kan snel en efficiënt worden uitgevoerd. Hier wordt een robuuste experimentele procedure gepresenteerd om hPSC's genetisch te manipuleren, zoals geïllustreerd door het bewerken van het AAVS1-veilige havenlocus om EGFP tot expressie te brengen en antibioticaresistentie te introduceren.

Oprichting van Genome bewerkte menselijke pluripotente stamcellijnen: Van Targeting naar Isolation

Hier melden wij een snelle en efficiënte gen-editing methode op basis van RMCE in de AAVS1 locus van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), die verbetert eerder beschreven systemen. Met deze techniek kan isogene lijnen snel en betrouwbaar worden gegenereerd voor goede vergelijkende studies vergemakkelijkt-gemedieerde transgenese onderzoek met hPSCs.

Snelle en efficiënte generatie van recombinant humaan pluripotente stamcellen door Recombinase-gemedieerde Cassette Exchange in de<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

De gepresenteerde methode beschrijft het genereren van een CRISPR-gemedieerde gen-knock-out in de menselijke embryonale stamcel (hESC) lijn H9, die sgRNA's gericht op het L2HGDH-gen stabiel tot expressie brengt met behulp van een zeer efficiënt lentiviraal-gemedieerd genafgiftesysteem.

CRISPR-Cas9 gemedieerde gendeletie in menselijke pluripotente stamcellen gekweekt onder feedervrije omstandigheden

Leer efficiënt gentargeting in menselijke embryonale stamcellen met zink-vinger nucleases. Deze methode maakt precieze genetische modificaties mogelijk voor onderzoek naar CNS-ontwikkeling.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Meer video's verkennen