Name: Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer retrovirale transductie van darmorganoiden voor functionele genetische studies. Deze methode maakt stabiele transgenexpressie en genmanipulatie in vitro mogelijk als alternatief voor dierproeven.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Koo BK en Mustata RC worden ondersteund door de Sir Henry Dale Fellowship van de Wellcome Trust en Andersson-Rolf A wordt ondersteund door de Medical Research Council (MRC). Fink J wordt ondersteund door de Wellcome Trust 4-jarige PhD-programma.

Alle muizen gebruikt in het volgende protocol werden gehouden in specifieke pathogeen-vrije omstandigheden, en alle procedures werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk van Binnenlandse Zaken regelgeving. Bereiding 1 <ol><li> Bereid media 1 uur van te voren van het gebruik (zie tabel 1 en lijst van materialen voor meer informatie) en pre-warm in een 37 ° C waterbad minstens 10 min voor gebruik. </li></ol> 2 kweken dunne darm (SI) Organoids Opmerking: Tenzij anders vermeld, worden alle incubaties uitgevoerd bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Uitrusting en reagentia in contact met levende cellen moeten steriel zijn. Voorverwarmen van de weefselkweek plaat is belangrijk omdat het voorkomt dat de kelder matrix (Matrigel of BME) druppels uit te spreiden wanneer zaaien. Ook moet de kelder matrix worden bewaard op ijs te allen tijde. Bewaren bij -20 ° C en dooiop ijs voor gebruik. <ol><li> Isoleren crypten <ol><li> Voor isolatie van de dunne darm te offeren de muis volgens de nationale regels en voorschriften, dan plaatst het dier op zijn rug en was de buik met 70% ethanol. Voer een longitudinale incisie van de lies tot het borstbeen. Eerst snijd de huid en het onderhuidse weefsel. Verwijder de dunne darm van de blindedarm naar de maag. Crypten geïsoleerd uit duodenum, jejunum en ileum kan voor organoïde cultuur. </li><li> Was de geïsoleerde dunne darm met pre-gekoelde fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder calcium of magnesium (PBS0). </li><li> Snijd het weefsel in 3-5 cm lange stukken en gebruik een schaar te knippen in de lengte te openen. Verspreid het weefsel met behulp van een tang. </li><li> Schraap villi met een dekglaasje. Voorzichtigheid, te veel kracht zal het weefsel scheuren veroorzaken en zal de opbrengst van de crypten verminderen in volgende stappen. </li><li> Transfer van het weefsel in een 50 ml buis met voorgekoeld PBS0 usinG forceps. Was de weefselfragmenten door krachtig schudden en verander het PBS0. Herhaal 2-3x of totdat het PBS0 wordt minder troebel. </li><li> Incubeer het weefsel in een 50 ml buis met 30 ml PBS0 met 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 30 min bij 4 ° C op een buis roller. </li><li> Schud de buis en breng het weefsel een 50 ml buis met 30 ml van PBS0 met 5 mM EDTA. De 1 mM EDTA-oplossing (voorheen met het weefsel) wordt een mengsel van crypten en villi bevatten. Deze fractie is niet geschikt voor het zaaien van organoids als het bevat vaak een hoog percentage van villi. </li><li> Incubeer het weefsel verder gedurende 1 uur bij 4 ° C op een buis roller. </li><li> Schud de buis en het verzamelen van de oplossing in een schone buis van 50 ml. Bevestigen de aanwezigheid van crypten en schatten het aantal, bijvoorbeeld, door het tellen van crypten in 50 pl met lichtmicroscopie. Bereken het benodigde volume 50-100 crypten verkrijgen en overbrengen naar een 1,5 ml tube. </li><li> Draaien op 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 50 ul kelder matrix en zaad in een voorverwarmde 24-well plaat. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator voor 5-15 min, zodat de kelder matrix polymeriseert. </li><li> Overlay met 500 ul ENR medium (zie tabel 1). Ongeveer 24 uur na het zaaien de organoids zal een kleine ronde cystische vorm laten zien en na nog eens 2-3 dagen ontluikende structuren zichtbaar worden. Wissel naar verse ENR media om de 3 dagen. </li><li> Passage organoïde culturen om de 7 dagen. </li></ol></li><li> Passage en onderhouden Organoids <ol><li> Handhaaf de organoids met het opfrissen van de media om de 3 dagen en passage 1: 3 en 1: 5 als het lumen wordt gevuld met dode cellen, ongeveer om de 7 dagen. </li><li> Breek de kelder matrix koepel met medium met 1 ml pipetman tip en over te dragen van de put naar een 1,5 ml tube. </li><li> Mechanisch scheiden de organoids door pipetteren eenpproximately 50x met een fijn (bijvoorbeeld 200 ul) tip. </li><li> Draaien op 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 150-250 ul kelder matrix. Zaad in een voorverwarmde 24-well plaat (50 ui kelder matrix / putje). Voor het zaaien pipet de kelder matrix keer op en neer om de vacht van de wand van de tip. Pipetteer langzaam om luchtbellen en zaad voorkomen in het midden van de put te voorkomen dat de kelder matrix uitspreiden. Het is gewenst een koepel kelder matrix krijgen in het midden van de put. </li><li> Incubeer in een weefselkweek incubator voor 5-15 min, zodat de kelder matrix polymeriseert. Overlay met 500 ul ENR media per well. </li></ol></li></ol> 3 Pre-infectie Behandeling van SI Organoids OPMERKING: Figuur 1 illustreert de transductieprocedure. <ol><li> Exchange ENR te ENRWntNic (zie tabel 1) medium en groeien de organoids in tZijn medium voor minimaal 3 dagen of totdat ze een cystische morfologie vastgesteld. Wnt3a verhoogt het aantal stamcellen en Paneth cellen terwijl Nicotinezuuramide (Nic) verbetert cultuur efficiency. </li></ol> 4 virusproductie <ol><li> Een 150 mm schaal van Platinum-E cellen nodig per infectie. Seed ca. 5 x 10 6 cellen met 15-18 ml medium (DMEM + 10% FBS) in aanwezigheid van puromycine (1 pg / ml) en blasticidine (10 ug / ml). Transfecteren cellen na 2-3 dagen, als ze 70-80% samenvloeiing hebben bereikt. Verander het medium om DMEM + 10% FBS zonder puromycine- en blasticidine voorafgaand aan transfectie. </li><li> Voeg 30 ug retroviraal DNA construct en 240 gl polyethyleenimine (PEI) naar buisjes die 1 ml Opti-MEM scheiden. Meng en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Verzamel de twee oplossingen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20-30 minuten. Voeg het mengsel als geheel aan het medium van de Platinum-E cellen voorzichtig schudden om het plate gelijke verdeling van de DNA-PEI-complexen waarborgen. </li><li> Incubeer de Platinum-E cellen met de transfectie mengsel &#39;s nachts en vernieuw het medium de volgende dag. Laat de cellen in het nieuwe medium gedurende 2 dagen. </li><li> Verzamel alleen het medium in een 50 ml Falcon buis, deze door een 0,45 urn filter en centrifugeer bij 8000 xg bij 4 ° C gedurende 12-16 uur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 250 pl Transductie medium (zie tabel 1). </li></ol> 5. organoïde Fragment Voorbereiding <ol><li> Voor een infectie een goed van een 24-wells plaat nodig. Breek de kelder matrix koepel met medium met 1 ml pipetman tip en overbrengen naar een 1,5 ml tube. </li><li> Gebruik een fijnere volume tip (bijvoorbeeld, 200 ul tips) mechanisch verstoren de organoids door pipetteren (30-50x). De oplossing wordt troebel en er geen hele organoids moet zichtbaar zijn. </li><li> Centrifugeer bij kamertemperatuur 900 g gedurende 5 min<html> . </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 pi van celcultuur leerjaar recombinant protease (bijvoorbeeld TrypLE). Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Na incubatie de grootte van de organoïde fragmenten middels lichtmicroscopie, tellen van het aantal cellen per fragment. Fragmenten die 5-10 cellen ideaal. Indien de meerderheid van de fragmenten bevatten een groter aantal cellen de incubatietijd kan worden verhoogd met 2 minuten per keer. </li><li> Beëindig het dissociatieproces toevoeging van 500 pl ENR medium. </li><li> Centrifugeer bij kamertemperatuur 900 g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en bewaar de pellet op ijs of 4 ° C. </li></ol> 6 retrovirale transductie <ol><li> Combineer organoïde fragmenten met 250 ul van de retrovirale (uit 4.5) in een putje van een 48-well plaat. Meng voorzichtig door langzame pipetteren met 1 ml pipetman tip. </li><li> Dicht de plaat met Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation en Plating <ol><li> Centrifugeer de plaat bij 32 ° C, 600 xg, 1 uur. Verwijder voorzichtig de Parafilm en incubeer de plaat in een weefselkweek incubator voor 6 uur. </li></ol> 8 Zaaien van Infected organoïde Fragmenten <ol><li> Breng de besmette organoïde fragmenten en transductie media uit de put naar een 1,5 ml tube, en draaien op 900 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en zet de buis met de pellet op ijs gedurende 5 minuten om af te koelen. Voeg 100 ul kelder matrix en resuspendeer de pellet door pipetteren langzaam op en neer. </li><li> Zaad druppels 50 gl &#39;kelder matrix-cel mix in een nieuwe 24-well plaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 5-15 min, totdat de kelder matrix stolt. </li><li> Voeg transductie media zonder polybreen aan de putjes en incubeer de plaat in een weefselkweek incubator. Veranderen de media om de 2-3 dagen. </li></ol> 9 Selectie <ol><li> Beginnen selectie na 2-3 dagen door het toevoegen van puromycine (1 pg / ml) aan de media. </li><li> Wanneer de fragmenten beginnen te vormen organoids vervangen Transductie media ENR medium aangevuld met puromycine (1 pg / ml). </li></ol> 10 Post-infectie Behandeling van SI Organoids <ol><li> Cultuur getransduceerde organoids volgens de &quot;Passage en onderhouden organoids&quot; protocol (paragraaf 2.2.1). Na 1-2 weken de SI organoids hun ontluikende structuren zal herwinnen. </li><li> Na weergave van ontluikende structuren induceren de expressie van miRNA of cDNA door toevoeging van 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in een werkende concentratie van 1 uM. Merk op dat deze stap is alleen geldig indien het gebruik van retrovirale vectoren van Addgene (pMSCV-loxP-DsRed-loxP-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxP-DsRed-loxP-3xHA-Puro-WPRE (32703), en pMSCV -Flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) en organoids uiten Cre-ERT2. </li></ol> 11 Bevestiging van Infectie en Exprsessieschijven / Onderdrukking van het gen van belang <ol><li> Bij gebruik van retrovirale vectoren van Addgene (32702, 32703 en 32704) transductie efficiëntie kan worden bevestigd door observatie van DsRed expressie. Bovendien kan de expressie of onderdrukking van het gen van belang worden bevestigd door Western Blot met behulp van de GFP of 3xHA epitoop (voor overexpressie) en qPCR (voor gen knockdown), zoals geïllustreerd in Koo et al 4. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. De auteurs hebben geen belangenconflict verklaard.

<html> Om tot een hoog transductierendement bepaalde aspecten kritisch. Een daarvan is de voorbehandeling van organoids met ENRWntNic media totdat ze een ronde cystische vorm aannemen. Dit verhoogt het aantal stamcellen en daarmee de kans op een stabiele integratie van het transgen, evenals het verhogen van de overlevingskans van de SI organoids gedurende de transductie procedure. Een andere parameter is de incubatietijd volgende spinoculation. Een te kort of te lang incubatie resulteert in een slechte transductie efficiëntie en slechte overleving van de organoids respectievelijk. De spinoculation stap is niet essentieel maar het verhoogt het percentage van getransduceerde organoids. Tenslotte hoge titer virus is essentieel voor een succesvolle transductie. Dit is afhankelijk van het soort verpakking cellijn en virus. De combinatie van platina-E cellijn van muis stamcellen virus (MSCV), bleek een titer hoog genoeg transductie van organoids produceren. ve_content &quot;&gt; Hieronder zijn tips voor probleemoplossing die kunnen bijdragen tot succesvolle transductie te bereiken. eerste, als de transfectie van de verpakkingscellijn is slecht, ervoor zorgen dat de confluentie van de cellen tussen 70-80% en de incubatietijd van de gepoolde PEI-DNA mengsel 20-30 min. Het overleven van de organoids tijdens transductie sterk afhankelijk van de fragmentgrootte. Te lange trypsinisatie veroorzaakt de meeste fragmenten uit minder dan 3 cellen en daardoor vermindert organoïde overlevingskansen. Een andere factor is de activiteit van de Wnt geconditioneerde medium, indien de activiteit te laag gehalte opvoeren door toevoeging van CHIR99021 in een werkende concentratie van 5 uM kan de overlevingskans te vergroten. CHIR99021 remt GSK3, resulterend in verhoogde Wnt signalering. Bovendien Y-27362, die voorkomt anoikis wordt toegevoegd aan de transductie media organoïde overlevingskansen verbeteren doordat de organoids verstoord fragmenten (bevattende 1-10 cellen) voorafgaand aan transductie. Al60, hierboven vermeld, dient de incubatietijd na spinoculation niet meer dan 6 uur. Ten slotte, als slechte transductie wordt waargenomen de bovengenoemde factoren die de virale titer en de maximale grootte van het inzetstuk voor de retrovirale vector moet worden beschouwd. De efficiëntie van de knockdown is sterk afhankelijk van de miRNA. Aangezien de efficiëntie varieert met de combinatie van het doelgen en miRNA is het goed uitvoeren van een efficiency scherm die het best werken identificeren. De techniek is beperkt tot de epitheliale verschijnselen van het organoïde systeem. In de toekomst zal het mogelijk zijn om infectieuze of immuungemedieerde ziekten door co-kweek van pathogenen of reconstitutie studie met componenten afgeleid van het immuunsysteem, respectievelijk. Bovendien kunnen retrovirussen enkel dragen inserts van betrekkelijk geringe omvang. Bijgevolg nature voorkomende regulerende gebieden moeten worden uitgesloten en derhalve de expressie van het transgen kan nabootsen die vanhet endogene gen. Zoals hierboven vermeld, de knockdown efficiëntie afhankelijk van het doelgen en miRNA. Wanneer geen miRNA met geschikte knockdown efficiëntie vindt kan het gebruik van de techniek voor die doelwitgen beperken. Theoretisch organoids zijn compatibel met alle gestandaardiseerde manipulatieve technieken die worden gebruikt voor de cellijnen. Retrovirale transductie was de eerste methode worden gemeld 4, en recent BAC (kunstmatig bacterieel chromosoom) -transgenesis is beschikbaar 5 geworden. Met een totale productie van 2-3 weken na transfectie van de virale plasmide in de verpakkingscellijn is aanzienlijk sneller dan het genereren van een transgene (tg) muizen. Door het handhaven van de in vivo crypte-villus architectuur tegelijkertijd de stamcellen en alle gedifferentieerde cellijnen van het darmepitheel, het organoïde kweeksysteem brug tussen tg dier en voorheen gebruikte celkweek. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; De hier beschreven protocol voorziet in een methode om fenotypische analyse van endodermale epitheel presteren in vitro door gain en verlieslatende van functie studies. Dit maakt het mogelijk om fysiologisch relevante vragen bij volwassen stamcel biologie aan te pakken, met een minimale behoefte van tg muizen. Zo kan de vorming van conditionele knockout muizen te vermijden door organoids afgeleid van pasgeboren mutanten perinatale letaliteit 6. Bovendien kan de techniek worden toegepast organoids afgeleid van eerder vastgestelde knockout muizen om de rol van paralogen bestuderen door extra knockdown 7,8. Na de oprichting van de dunne darm organoids, heeft aanpassing van de oorspronkelijke cultuur protocol stond het kweken van de alvleesklier, lever, dikke darm en maag epitheel 9-11. Bovendien hebben de menselijke darm organoids en tumor organoids afgeleid van normale menselijke biopten, primaire Adenoma en colorectale kanker biopsieën 10. De virale infectie protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid om dit soort organoids en biedt ongekende wijze het functioneel studies in mensen afgeleide weefsels. Tezamen retrovirale transductie dunne darm organoids is een waardevolle bron voor onderzoek stamcellen onderhoud, differentiatie en Celgedrag, alsmede celsignalen en cel-cel interacties.

High-throughput functionele genetica is nodig om onze biologische kennis van het lichaam te verhogen, om de huidige fundamentele wetenschap en de geneeskunde te verbeteren. Muisgenetica is de gouden standaard voor het onderzoek van genfunctie in vivo, hoewel het zowel tijdrovend en kostbaar. Cellijnen, die andere zijn voorkomende keuze, een hogere doorvoercapaciteit terwijl goedkoper. Ze worden echter gehinderd door hun onvermogen om de juiste micro en daardoor de fysiologische responsen waargenomen in vivo reproduceren. Daarom is er een duidelijke behoefte aan een gemakkelijk te hanteren modelsysteem dat de kosten / tijd-efficiënte high throughput analyse terwijl toelaat nabootsen van de fysiologische responsen waargenomen in in vivo transgene (tg) muisexperimenten. Voor de endodermal epitheel een dergelijk modelsysteem verscheen in 2009 1. Onder de opgedane kennis uit de ontdekking van Lgr5-positieve intestinale stamcellen werdinformaties niche overeenkomt met de extracellulaire matrix en groeifactoren nodig voor stamceltransplantatie onderhoud. Gebruik makend van deze informatie het mogelijk om &#39;mini-guts&#39; ook wel bekend als organoids 2 vast geworden. Onlangs consensus nomenclatuur in vitro culturen waar organoids worden aangeduid als &quot;enteroids &#39;, werd gesuggereerd 3. Net als cellijnen, de organoids zijn steeds groeiende en gemakkelijk te behandelen met liganden en remmers. Echter, in plaats van tweedimensionale ze driedimensionale zelforganiserende structuren die de crypte-villus houdsorganisatie en stamcellen en gedifferentieerde cellijnen van de dunne darm (SI). Organoids bestaan ​​uit een enkele laag van epitheelcellen die een luminale gebied omringen. Vooruitstekende ontluikende structuren komen overeen met de dunne darm crypten waarin de stamcel compartiment. Vanaf de top van de ontluikende structuur stamcellen differentiëren ze miRasp de richting van de epitheel, waar terminaal gedifferentieerde cellen worden afgeworpen in het lumen. Vergeleken met cellijnen Deze ex vivo systeem beter recapituleert de normale fysiologie en is daarom een veelbelovend modelsysteem voor de kleine darm epitheel. In deze video protocol van retrovirale transductie, presenteren we een methode die ex vivo gen-functie studies stelt in deze roman organoïde kweeksysteem. We beginnen met een beschrijving organoïde cultuur in een stap voor stap manier en verder door het aantonen van de vorming van retrovirussen gevolgd door de transductie procedure. Ten slotte is er een sectie voor bijkomend advies voor het oplossen van problemen. Een voordeel van deze techniek is dat het kan worden gecombineerd met live imaging of drug screening homeostase, lot van de cel beslissingen en cel-cel interacties te bestuderen in het darmepitheel. Door hun eenvoudige architectuur en snelle omloopsnelheid, organoids vertegenwoordigen een ideaal model systeem voor het bestuderen van volwassen stamcellen biologie. Bovendien kunnen retrovirale transductie worden toegepast organoids afgeleid van vooraf vastgestelde transgene muizen en humane patiënt monsters. Zoals knock-in en knock-out benadering niet kan worden uitgebreid tot de mens, de menselijke SI organoids vormen een aantrekkelijk alternatief. Samengevat, genetische manipulatie door retrovirale transductie laat fenotypische analyse in de dunne darm organoids afgeleid van muizen of menselijk weefsel monsters, waardoor aanvulling muis genetica en cellijnen tijdens het openen van nieuwe wegen voor onderzoek bij mensen afgeleide weefsels. Retrovirale transductie maakt gain en verlies-van-functie studies in het organoïde kweeksysteem 4 uit te voeren. Dit maakt het een waardevolle bron voor onderzoek van genfunctie, volwassen stamcellen biologie en ziekte terwijl volgens de drie V (vermindering, verfijning en vervanging).

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcysteïne 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &micro;g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro;g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin voorwaardelijke media</td><td></td><td></td><td>De voorwaardelijke media worden gegenereerd vanuit HEK293-cellen, voor details zie Sato en Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Wnt voorwaardelijke media</td><td></td><td></td><td>De voorwaardelijke media worden gegenereerd vanuit L-cellen, voor details zie Sato en Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro;M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &micro;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standaard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) kan worden gebruikt als alternatief, geleverd door AMSBIO.</td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E cellen</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen-imion (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

een video protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk intestinale organoïde cultuur

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positieve stamcellen kan worden aangevuld met de essentiële groeifactoren EFG Noggin, en R-Spondin, die ons in staat om de cultuur steeds groeiende primaire 3D-epitheliale structuren in vitro. Zowel de architectuur en de fysiologische eigenschappen van deze &#39;mini-guts&#39;, ook wel organoids, sterk lijken op hun in vivo tegenhangers. Dit maakt hen een aantrekkelijk model voor de kleine darm epitheel. Met behulp van retrovirale transductie, kan functionele genetica nu worden uitgevoerd door conditionele gen overexpressie of knock-down. Deze video toont de procedure van organoïde cultuur, het genereren van retrovirussen en de retrovirale transductie van organoids tot fenotypische analyse van de dunne darm epitheel in vitro ondersteunen. Deze nieuwe organotypische modelsysteem in combinatie met retrovirale gemedieerde genexpressie verschaft een waardevol instrument voor snelle analyse van genfunctie in vitro zonder van costly en tijdrovend generatie van transgene dieren.

Organoids klaar te verdelen wanneer de centrale lumen wordt verduisterd door de aanwezigheid van dode cellen (figuur 2). Na 2-3 dagen van voorbehandeling organoids moet een ronde cystic morfologie (figuur 3) vast te stellen. Dit verhoogt het aantal stamcellen, het verbeteren van de kansen op stabiele integratie. De grootte van de virale pellet kan variëren na centrifugeren van het virale supernatant, waarschijnlijk door variërende bijdrage van celresten de korrelgrootte. Er is geen duidelijke correlatie met transductie efficiëntie is waargenomen. Tijdens de selectieprocedure niet-getransduceerde organoids sterven, terwijl die een stabiele integratie blijft. De fluorescerende eiwit van MSCV-eGFP retrovirus kan worden waargenomen in cellen afkomstig van overleven organoids, die een cystische morfologie binnen 2-3 dagen na transductie hebben (figuur 4). <img alt<html> = &quot;Figuur 1&quot; fo: content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figuur 1 Een schematische tekening van de retrovirale transductie procedure. Voorafgaand aan infectie organoids zijn voorbehandeld met ENRWntNic totdat ze een cystische structuur (stap 1) vast te stellen. Platinum-E cellen worden gebruikt als de verpakkingscellijn en gekweekt tot zij 70-80% confluentie bereikt. Daarna worden ze getransfecteerd met het retrovirale construct met PEI. Virussen worden 2 dagen later (stap 2) geoogst. Organoids worden getrypsiniseerd fragmenten bevattende 1-10 cellen (stap 3) te verkrijgen, en vervolgens geïnfecteerd (stap 4). Na spinoculation de infectie-efficiëntie (stap 5) te verhogen, worden de geïnfecteerde organoïde fragmenten geënt (stap 6) en 2-3 dagen later selectie voor positieve klonen met stabiele integratie kan worden uitgevoerd (stap 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figuur 2 representatief beeld van organoids na 4-6 dagen van de cultuur. Het lumen is gevuld met dode cellen, waardoor het donker lijken. Organoids in dit stadium zijn klaar om te worden gepasseerd. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 representatief beeld van de dunne darm organoids gekweekt in ENRWntNic media voor 3-4 dagen. De organoids nemen een cystic morfologie. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 representatief beeld van de dunne darm organoids (a) dat de virale transgene expressie (b, eGFP) tonen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 4 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1 M Hepes </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotica 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 2 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteïne (500 mM) </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> muis EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ui </td></tr><tr><td> muis Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> R-Spondin conditioned medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a geconditioneerd medium </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1M) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> Transductie medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bereid verse </td></tr><tr><td> ENRWntNic medium </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 uM) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> Polybreen (8 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR medium (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 4 weken </td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> B27 supplement (50x) </td><td> 400 gl </td></tr><tr><td> N2 supplement (100x) </td><td> 200 gl </td></tr><tr><td> N-acetylcysteïne (500 mM) </td><td> 50 gl </td&gt; </tr><tr><td> muis EGF (500 ug / ml) </td><td> 2 ui </td></tr><tr><td> muis Noggin (100 ug / ml) </td><td> 20 gl </td></tr><tr><td> R-Spondin geconditioneerd medium </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Media voor platina-L-cellen (500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaar bij 4 ° C gedurende 12 weken </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycine (1 pg / ml) </td><td> 50 gl </td></tr><tr><td> Blasticidine (10 ug / ml) </td><td> 500 pi </td></tr></tbody></table> Tabel 1 Media samenstelling voor Advanced DMEM / F12 +++, ENRWntNic medium, Transduction medium, ENR medium en medium voor Platinum-E cellen.

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch modelsysteem.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe functionele genetische studies in organoïden kunnen worden uitgevoerd. Dit wordt bereikt door de organoïden eerst voor te behandelen met WINT drie A bevattende media om hun overgang naar een cystische vorm te vergemakkelijken en hun stamcellen te vermenigvuldigen. In de tweede stap wordt het virus geproduceerd en worden de organoïdfragmenten vervolgens getransduceerd en geïnoculeerd.In de laatste stap worden de getransfecteerde organoïden geplaatst en vervolgens geselecteerd op stabiele virale integratie. Uiteindelijk kan de expressie of onderdrukking van het gen van belang worden beoordeeld door GFP-fluorescentie. Het grote voordeel van het gebruik van deze techniek ten opzichte van bestaande AL-modellen zoals de muis, is dat met deze techniek functionele genetische experimenten in vitro kunnen worden uitgevoerd met de intestinale organoïden.De procedure zal worden gedemonstreerd door Amanda Andro, een promovenda uit mijn laboratorium Om de crypten te isoleren, begin met het wassen van de dunne darm met voorgekoelde calcium- en magnesiumvrij PBS. Snijd vervolgens het weefsel in stukken van drie tot vijf centimeter lang en open de stukken longitudinaal met een schaar. Gebruik een pincet om de weefsels open te spreiden, schraap overtollige villi eraf met een dekglas en breng de stukken vervolgens over naar een 50 milliliter buis met gekoeld PBS.Was de weefselfragmenten twee tot drie keer met krachtig schudden, ververs het PBS totdat het PBS na de laatste wasbeurt minder troebel wordt, incubeer het weefsel in een 50 milliliter buis met 30 milliliter PBS aangevuld met één millimolair EDTA bij vier graden Celsius op een buisrol. Na 30 minuten krachtig, schud de buis opnieuw en breng het weefsel over naar een andere 50 milliliter buis met 30 milliliter PBS aangevuld met vijf millimolair EDTA. Na een uur incubatie bij vier graden Celsius op de buisrol krachtig.Schud de buis opnieuw en breng de oplossing over in een nieuwe 50 milliliter buis. Tel vervolgens het aantal crypten in 50 microliter. Bereken en breng het volume dat 50 tot 100 crypten bevat over in een 1,5 milliliter buis.Spin vervolgens de crypten naar beneden en resuspendeer het pellet in 50 microliters basement matrix. Zaai vervolgens de cryptenoplossing in een voorverwarmde 24-well plaat en incubeer de plaat vijf tot 15 minuten in een weefselkweekincubator. Zodra de basement membraan is gepolymeriseerd, incubeer de matrix met 500 microliter ENR-medium in een cellenkweekincubator.Door het medium elke drie dagen te verversen, ongeveer 24 uur na het plaatsen, zullen de organoïden een kleine ronde cystische vorm vertonen. Na nog eens twee tot drie dagen worden knopsporen zichtbaar terwijl de organoïden hun cystische morfologie aannemen Zaai ongeveer vijf keer 10 tot de zesde platinum E-cellen in een 150 millimeter schaal met 15 tot 18 milliliter medium aangevuld met pur, mycine en blastin. Na twee tot drie dagen, ververs het medium naar medium zonder antibiotica en voeg 30 microgram retroviraal DNA-construct en 240 microliter pi toe aan twee afzonderlijke buizen, elk met één milliliter optimum.Meng vervolgens de buizen en incubeer ze bij kamertemperatuur. Na vijf minuten, combineer de twee oplossingen en incubeer ze nog eens 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het volledige mengsel toe aan de platinum E-cellen en schud de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de DNA PI-complexen te garanderen.Na een nachtelijke incubatie, ververs het medium en incubeer de cellen opnieuw. Na twee dagen, verzamel alleen het medium in een 50 milliliter Falcon-buis en filter het door een 0,45 micron filter. Centrifugeer vervolgens de oplossing gedurende 12 tot 16 uur bij 8.000 keer G en vier graden Celsius, en resuspendeer het pellet in 250 microliters transductiemedium.Om de organoïdfragmenten voor te bereiden op retrovirale transductie, pipet eerst de cultuur 30 tot 50 keer met een 200 microliter pipette tip om de organoïden mechanisch te verstoren, de oplossing wordt troebel en er mogen geen hele organoïden worden gedetecteerd. Na het afspina van de fragmenten, incubeer het pellet in 500 microliters cellenkweek, graad recombinante protease bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik na de incubatie een lichtmicroscoop om de grootte van de organoïdfragmenten te beoordelen en het aantal cellen per fragment te tellen.Voeg vervolgens 500 microliters ENR-medium toe om het dissociatieproces te beëindigen en spin de celfragmenten naar beneden. Gooi het supernatant weg, plaats het pellet op ijs en zaai vervolgens de fragmenten in één put van een 48-puts plaat in 250 microliters van de eerder bereide retrovirale oplossing.Meng de celloplossing voorzichtig met een één milliliter pipette tip en sluit vervolgens de plaat af met param om de inenting uit te voeren. De 48-well plaat gedurende één uur bij 600 keer G en 32 graden Celsius. Verwijder voorzichtig de parafilm en incubeer de plaat nog eens zes uur in een cellenkweekincubator.Na de incubatie, breng de geïnfecteerde fragmenten over naar een 1,5 milliliter buis. Spin vervolgens de organoïdfragmenten weer naar beneden en koel het pellet vijf minuten op ijs. Zodra het pellet is afgekoeld, voeg 100 microliter basement matrix toe aan de buis en pipet het pellet langzaam op en neer om het te resuspenderen.Zaai vervolgens 50 microliter druppels van de fragmentmatrix suspensie in elke put van een 24-well plaat en incubeer de plaat gedurende vijf tot 15 minuten bij 37 graden Celsius Na het stollen van de basement matrix, incubeer de organoïden met transductiemedia zonder polybrein. Na twee tot drie dagen, voeg purmycine bevattend medium toe aan de putten om de selectie te starten. Wanneer de fragmenten organoïden beginnen te vormen, vervang het transductiemedium door ENR-medium aangevuld.Met purammycine zijn organoïden klaar om te worden gesplitst wanneer hun centrale lumen verduisterd raken door de aanwezigheid van dode cellen. Na twee tot drie dagen van Wint

a-video-protocol-retroviral-infection-primary-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Presenteren wij protocollen voor isolatie van intestinale 3D structuren uit weefsel in vivo en in vitro kelder matrix ingesloten organoids, en detail verschillende fixatie en kleuring van protocollen die zijn geoptimaliseerd voor immuno-labeling van microtubuli, centrosomal en regulates eiwitten zo goed zoals markeringen met inbegrip van de stamcel proteïne Lgr5 cel.

Immuno-belichting fluorescerende etikettering van microtubuli en Centrosomal eiwitten in Ex Vivo intestinale weefsel en 3D In Vitro intestinale Organoids

We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Hier presenteren we twee protocollen die het modelleren van intestinale apicale-specifieke interacties mogelijk maken. Organoïde-afgeleide intestinale monolagen en Air-Liquid Interface (ALI) culturen vergemakkelijken de generatie van goed gedifferentieerde epithelia toegankelijk vanaf zowel luminale als basolaterale zijden, terwijl polariteit-omgekeerde intestinale organoïden hun apicale kant blootstellen en vatbaar zijn voor hoge doorvoertesten.

Kweekmethoden om apicale-specifieke interacties te bestuderen met behulp van intestinale organoïde modellen

Dit protocol beschrijft hoe menselijke intestinale organoïden kunnen worden geïnfecteerd vanaf hun apicale of basolaterale kant om gastheer / pathogeeninteracties op eencellig niveau te karakteriseren met behulp van eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) -technologie.

Aanpassing van gastro-intestinale organoïden voor pathogene infectie en single cell sequencing onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Leer retrovirale transductie van darmorganoiden voor functionele genetische studies. Deze methode maakt stabiele transgenexpressie en genmanipulatie in vitro mogelijk als alternatief voor dierproeven.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Meer video's verkennen