Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie
25 juli 2014
Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en hun locatie, beweging en dynamische associatie in supramoleculaire complexen te analyseren. Dit wordt bereikt door snap-getagde receptoren op zeer lage niveaus op het oppervlak van levende cellen te exprimeren en ze te labelen met heldere organische fluoroforen om detectie van enkele moleculen mogelijk te maken. Als tweede stap worden cellen gevisualiseerd door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie, die het mogelijk maakt om een snelle beeldsequentie van individuele receptordeeltjes te verkrijgen die zich op het celoppervlak bewegen.
Vervolgens worden geautomatiseerde detectie- en volgalgoritmen toegepast op de beeldsequentie om de positie en intensiteit van elk receptordeeltje in de loop van de tijd te verkrijgen. Resultaten worden verkregen die een nauwkeurige analyse laten zien van de grootte van receptorcomplexen in dit voorbeeld, bèta-twee adrenerge receptoren op basis van een gemengde Gaussische fitting van de intensiteitsverdeling van de deeltjes aan het begin van de beeldsequentie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celbiologie, zoals hoe onze receptoren zich organiseren in domeinen van het oppervlak van levende cellen.
Hoe ze met elkaar interageren om dimeren en oligomeren te vormen, en hoe dynamische gebeurtenissen aan de basis van receptorsignalering daadwerkelijk plaatsvinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven standaard biochemische en microscopiemethoden is dat het het gedrag van enkele receptoren in de natuurlijke omgeving onderzoekt, waardoor we belangrijke aspecten kunnen bestuderen die typisch verborgen zijn in ensemblemetingen. De deksels voor de monsters moeten grondig worden gereinigd om achtergrondfluorescentie te minimaliseren. Tijdens het beeldvormen, gebruik schone pincetten om een diameter van 24 millimeter te plaatsen.
Glazen deksels in een dekselhouder die afzonderlijke deksels scheidt. Doe de houder met deksels in een beker en voeg chloroform toe totdat de deksels bedekt zijn. Bedek de beker met aluminiumfolie om verdamping te verminderen en soniceer in een bad.
Soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Haal na een uur de dekselhouder uit de beker en laat de deksels drogen. Plaats vervolgens de houder met de deksels in een andere beker en voeg vijf molaire natriumhydroxideoplossing toe totdat de deksels bedekt zijn.
Zoals eerder, bedek de beker met folie en soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur, breng de dekselhouder over in een nieuwe beker en was drie keer met gedestilleerd water. Leg ten slotte de gereinigde deksels in een glazen celkweekschaal gevuld met 100% ethanol. Hier worden deksels voor en na het schoonmaken getoond, geïmageerde door totale interne reflectiefluorescentie of turf-microscopie.
Cal-kalibratiemonsters worden gebruikt om de intensiteit van enkele fluorescerende moleculen tijdens turf-microscopie te schatten. Om de monsters voor te bereiden, lost u de fluorescerende kleurstof op in het juiste oplosmiddel. Bereid een een-op-tien serieverdunning van de fluorescerende kleurstof variërend van één picaMolar tot één ano molair.
In filtergesteriliseerde water. Was de eerder gereinigde deksels door ze over te brengen naar een celkweekschaal gevuld met filtergesteriliseerde water. Plaats vervolgens elke deksel in een putje van een zes-putjes celkweekplaat en wacht tot ze drogen. Spot 20 microliters van elke fluorescente kleurstofverdunning op een aparte gereinigde deksel.
Laat de deksels drogen onder een steriele kap. Bescherm de deksels tegen licht en stof tot gebruik voorafgaand aan transfectie. Bereid een zes-putjes celkweekplaat voor. Was de gereinigde deksels met steriele PBS en plaats één deksel in elk putje van de zes-putjes celkweekplaat.
De CHO-cellen die voor dit onderzoek worden getransfecteerd, worden gekweekt bij 37 graden Celsius in 5% CO2 in één, een-op-één ECCOs gemodificeerd arendskruitkweekmedium F 12 aangevuld met 10% foetaal runderserum penicilline en streptomycine na trypsinisatie en het tellen van de cellen volgens standaardmethoden gezaaid bij een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per putje. In de zesde celkweekplaat met deksels, laat de cellen 24 uur groeien in een incubator om ongeveer 80% confluentie te bereiken, wat de optimale celdichtheid is. Voor transfectie.
Het moeilijkste aspect van dit protocol is om een extreem laag expressieniveau van membraanreceptoren op het celoppervlak te bereiken om succes te garanderen. De transfectievoorwaarden. Bijvoorbeeld, de hoeveelheid plus media NA en tijd na transfectie moet worden geoptimaliseerd Op de dag van transfectie.
Bereid de transfectiereagentia voor voor elke zal twee microgram van de gewenste plaid DNA verdunnen in 500 microliters optimum medium in een andere buis. Voor elke put verdun zes microliters van Lipectomy 2000 in 500 microliters van Optum medium. Incubeer beide buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Na vijf minuten, combineer beide oplossingen in één buis en meng om een transfectiemengsel te verkrijgen. Incubeer het transfectiemengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de CHO-cellen voor.
Was de cellen twee keer met voorgewaarschuwde PBS Na de tweede wasbeurt, vervang PBS met één milliliter per putje van fenolroodvrij D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS, maar zonder antibiotica. Voeg één milliliter van het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan elke put en schud de plaat voorzichtig heen en weer om volledige menging te garanderen. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5% CO2 gedurende twee tot vier uur voordat u onmiddellijk doorgaat naar de eiwitlabeling.
Om deze procedure te beginnen, verdun één microliter van de fluoro-vier geconjugeerde benzo guine derivaat- of fluoro-vier BG-stockoplossing In één milliliter van D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS om een eindconcentratie van één micromolar te verkrijgen. Haal de getransfecteerde cellen uit de incubator en was twee ke
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om enkele receptoren op levende celoppervlakken te visualiseren en te volgen met behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie. Het maakt de analyse van receptormobiliteit, complexgroottes en voorbijgaande interacties mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Receptordynamiek
Achtergrond
- Het begrijpen van receptororganisatie is cruciaal in de celbiologie.
- Eenmalige molecuuldetectie biedt inzichten in receptorgedrag.
- Receptoren kunnen supramoleculaire complexen vormen die cellulaire functies beïnvloeden.
- Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie is een krachtige beeldvormingstechniek.
Doel van het onderzoek
- Om enkele receptoren op levende celoppervlakken te visualiseren.
- Om receptorbeweging en dynamische associaties te analyseren.
- Om de organisatie van receptoren in celmembranen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Expressie van snap getagde receptoren op lage niveaus op celoppervlakken.
- Labelen van receptoren met heldere organische fluoroforen voor detectie.
- Gebruik van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming.
- Toepassing van geautomatiseerde detectie- en volgalgoritmen voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- Precieze analyse van receptorcomplexgroottes met behulp van Gaussiaanse fitting.
- Visualisatie van individuele receptordeeltjes die zich op celoppervlakken bewegen.
- Inzichten in receptororganisatie binnen membraandomeinen.
- Demonstratie van voorbijgaande receptor-receptor interacties.
Conclusies
- Deze methode verbetert het begrip van receptordynamiek in levende cellen.
- Het kan worden uitgebreid om andere membraaneiwitten te bestuderen.
- De bevindingen dragen bij aan het bredere veld van celbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence microscopy enables direct visualization of receptor dynamics in living cells, providing critical insights into target behavior that are obscured in ensemble assays. This approach supports early-stage target validation by revealing receptor organization, complex formation, and transient interactions in native membrane environments. The resulting quantitative data enhances predictive confidence in lead identification and mechanistic de-risking for GPCR and other membrane protein targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing receptor monomers, dimers, and oligomers in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of receptor complex size and stoichiometry via mixed Gaussian fitting of intensity distributions.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by characterizing transient receptor-receptor interactions that underlie signaling mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates diffusion coefficients and mobility profiles that serve as functional biomarkers for receptor state.
- Operational Value: Delivers reproducible, single-particle tracking data suitable for assay standardization across compound screening campaigns.
- Scientific Value: Enables detection of ligand-induced changes in receptor dynamics, supporting phenotypic screening approaches.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by validating receptor behavior in disease-relevant cellular models.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized imaging and analysis workflows.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by linking receptor dynamics to downstream signaling outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, informing target validation prior to lead identification and enabling data-driven decisions in preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of receptor organization and interaction kinetics in native membranes.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative mobility and complex size readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Yields diffusion coefficients, complex size distributions, and interaction frequencies for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects single-molecule observations to cellular signaling continuity in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse membrane proteins across multiple cell lines and labeling strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in receptor signaling models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized sample preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement and complex formation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated dynamic behavior in living systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transfection, and single-molecule fluorescence microscopy.
- Depends on TIRF microscopy systems with high NA objectives, EMCCD cameras, and laser excitation sources.
- Necessitates cross-team standardization of labeling, imaging, and analysis parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for varying receptor expression levels, membrane environments, and fluorophore brightness.
- Includes practical limitations such as photobleaching, background fluorescence, and the need for low expression levels to ensure single-molecule sensitivity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:00
Coverslip Cleaning
3:33
Preparation of Calibration Samples
4:41
Transfection
7:35
Protein Labeling
8:58
Image Acquisition
10:49
Image Analysis
12:35
Results: TIRF Microscopy Detects and Tracks Single Receptors on the Surface of Living Cells
14:31
Conclusion
