Name: Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 13 s
Description: Verken single-molecule fluorescentiemicroscopie om receptordynamica op levende celoppervlakken te analyseren. Deze methode onthult mobiliteit, complexgroottes en tijdelijke interacties van receptoren in hun natuurlijke omgeving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door subsidies van de European Research Council (Advanced Grant TOPAS aan M.J.L.) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 aan D.C. en SFB487 aan M.J.L.). T.S. werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting.

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Dekglaasje reiniging LET OP: Brei onder een afzuigkap. <ol><li> Gebruik schone pincet om dekglaasjes (24 mm diameter) te plaatsen in een dekglaasje houder dat individuele dekglaasjes scheidt. </li><li> Plaats de houder met dekglaasjes in een beker en voeg chloroform totdat de dekglaasjes worden gedekt. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie om verdamping en ultrasone trillingen te verminderen in een badsonicator gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Neem het dekglaasje houder uit de beker en laat de dekglaasjes droog. </li><li> Herhaal stap 1.1.2 met 5 M NaOH-oplossing in plaats van chloroform. </li><li> Neem het dekglaasje houder in een nieuwe beker en was driemaal met gedestilleerd water. Zet gereinigd dekglaasjes in een glazen celkweekplaat gevuld met 100% ethanol. </li></ol></li><li> Bereiding van ijkmonsters <ol><li> Los fluorescente kleurstof in geschikt oplosmiddel. </li><li> Bereid een 1:10 seriële verdunning van de fluorescente kleurstof, variërendvan 13:00 tot 1 nM in filter gesteriliseerd (0,22 pm) water. </li><li> Neem schoongemaakt coverslips opgeslagen in 100% ethanol en wassen met een filter gesteriliseerd water. Vlek 20 pi van elke verdunning fluorescente kleurstof op een afzonderlijk gereinigd dekglaasje. Laat de dekglaasjes drogen onder een steriele kap. Bescherm de dekglaasjes van licht en stof tot gebruik. Gebruik deze monsters te schatten de intensiteit van individuele fluorescerende moleculen (zie stap 3). </li></ol></li><li> Transfectie <ol><li> Kweek CHO cellen in 01:01 Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium / voedingsmengsel F-12 (DMEM/F12), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C, in . 5% CO 2 OPMERKING: Gebruik fenol-rood vrije media gedurende het experiment om autofluorescentie minimaliseren. </li><li> Neem gereinigd dekglaasjes van 100% ethanol-oplossing, spoel ze met steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), en plaats een dekglaasje in elk putje van een 6 goed celkweek platen. </li><li> Trypsinize, tellen en zaden CHO-cellen bij een dichtheid van 3 x 10 5 cellen / putje in 6-well celcultuur plaat met de dekglaasjes. Laat de cellen groeien in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 24 uur om ongeveer bereiken. 80% confluentie, wat de optimale celdichtheid voor transfectie. </li><li> Voor elk putje verdunde 2 ug van het gewenste plasmide-DNA (bijv.. SNAP-gelabeld β 2-adrenerge receptoren) en 6 pl Lipofectamine 2000 in twee buisjes die 500 pi Optimem medium. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Combineer de oplossingen van stap 1.3.4 in een buis en meng tot een transfectie mengsel te verkrijgen. Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie (1.3.5), neemt de CHO-cellen en tweemaal wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS. Vervang PBS met 1 ml / putje van fenolrood-vrij DMEM/F12 medium aangevuld met 10% FBS, maar geen antibiotica. </li><li> Voeg de hele transfecterenion mengsel (1 ml) van stap 1.3.5 druppelsgewijs aan elk putje, en schud de plaat heen en weer om volledige menging te garanderen. </li><li> Incubeer gedurende 2 tot 4 uur bij 37 ° C in 5% CO2 en daarna onmiddellijk over tot de volgende stap. OPMERKING: De transfectie omstandigheden zijn geoptimaliseerd om receptor dichtheid &lt;0,45 deeltjes / um 2, die geschikt zijn voor eenmalig worden getild molecule beeldvorming. Aanpassingen kunnen bij het gebruik van verschillende cellen, bouwt of reagentia nodig zijn. </li></ol></li><li> Eiwitmarkerend <ol><li> Verdun 1 pl fluorofoor-BG voorraadoplossing in 1 ml DMEM/F12 medium aangevuld met 10% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 1 uM vinden. Neem de getransfecteerde cellen uit de incubator en tweemaal wassen met voorverwarmde (37 ° C) PBS. Vervang PBS met 1 ml van 1 uM fluorofoor-BG-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C 5% CO2 in een incubator. </li><li> Na de incubatie was de cellen driemalen met DMEM/F12-medium aangevuld met 10% FBS, telkens gevolgd door 5 minuten incuberen bij 37 ° C. Neem een ​​dekglaasje (met gelabelde cellen) met een pincet en plaats deze in een imaging kamer. </li><li> Twee keer wassen met 300 ul beeldvorming buffer. Voeg 300 ul van verse beeldvorming buffer en onmiddellijk overgaan tot beeldvorming (deel 2). </li></ol></li></ol> 2. Image Acquisition OPMERKING: Gebruik een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscoop, uitgerust met een olie-immersie hoge numerieke apertuur doelstelling (bijv. 100X magnification/1.46 numerieke lensopening.), Geschikt lasers (bv, 405 nm, 488 nm, 561 nm en 645 nm diode lasers), een elektron te vermenigvuldigen charge-coupled device (EMCCD) camera, een incubator en een temperatuurregelaar op enkele fluorescerende moleculen te visualiseren. <ol><li> Stel de gewenste microscoop parameters, dwz., Laserlijn, TIRF hoek (deze parameter regelt de penetratietie diepte van de verdwijnende veld), belichtingstijd, frame rate en het aantal beelden per film 10. Houd de kachel / incubator en temperatuurregeling altijd op temperatuur drifts en condensvorming te voorkomen. </li><li> Een druppel immersie olie op het 100x objectief van de microscoop. Plaats de beeldvorming kamer met de gelabelde cellen op het monster houder van de microscoop, en breng de cellen in focus met helderveld verlichting. </li><li> Schakel over naar TIRF verlichting. Houd laservermogen zo laag mogelijk zoeken naar de gewenste cel, maar tegelijkertijd het minimaliseren fotobleken mogelijk. </li><li> Selecteer de gewenste cel en fijn scherp. Stel het laservermogen tot een niveau dat visualisatie van enkele fluoroforen maakt. Acquire image reeks, en sla rauw beeldsequentie bestand als. Tiff. </li></ol> 3. Calibration (Single Fluoroforen op glas en Monomeer / dimeer Receptor Controls) <ol><li> Monteer elke kalibratie sample bereid zoals beschreven in 1.2 in de beeldvorming kamer. Plaats elk monster op de microscoop en kies het monster dat goed gescheiden buigingsbegrensde plekken die bleken in een enkele stap. Opmerking: Deze vlekken vertegenwoordigen enkele moleculen van de fluorescente kleurstof. </li><li> Verwerven TIRF beeld sequenties zoals beschreven in stap 2. Belangrijk: dezelfde beeldparameters worden gebruikt voor alle experimenten, inclusief die voor kalibratie. </li><li> Voer de detectie en tracking analyse zoals beschreven in 4,1-4,2. Extraheer de intensiteit van elk deeltje zoals beschreven in 4.2.6. Uit deze gegevens berekent het gemiddelde (μ) en de standaarddeviatie (σ) van de intensiteit van enkele fluoroforen. </li><li> Optioneel: voeren dezelfde analyse van cellen getransfecteerd met een monomere receptor van het celoppervlak (. Bijvoorbeeld CD86), N-terminaal gelabeld met een of twee kopieën van SNAP 10 en gelabeld met het fluorofoor-BG derivaat. Follow de hierboven beschreven voor de enkele fluorofoor op glas procedure. Schat de etikettering efficiëntie zoals beschreven in Calebiro, D. et al.. 10 </li></ol> 4. Beeldanalyse <ol><li> Beeldsequentie voorbereiding <ol><li> Gebruik een image processing software (bijv.., ImageJ) om de beelden bij te snijden. </li><li> Spaar individuele frames als afzonderlijke. TIFF-afbeeldingen in een nieuwe map, wat aangeeft op elk beeld het framenummer. </li><li> Meet het celoppervlak door het tekenen van een gebied van belang (ROI) langs de omtrek van een cel en door meting gereedschap ImageJ of dergelijks in andere software. Met deze waarde deeltjesdichtheid berekend door het totale aantal deeltjes aan het begin van de film van het cel oppervlak. </li></ol></li><li> Deeltjesdetectie en volgen OPMERKING: Gebruik niet-commerciële software zoals u-spoor 13, het werken in Matlabmilieu, om automatisch te detecteren en te volgen enkele receptor deeltjes. OPMERKING: De u-circuit algoritme is gebaseerd op de meervoudige hypothese volgen benadering. Deze benadering koppelt deeltjes tussen frames door bouwkosten matrices, waarbij de individuele probabiliteiten die een bepaald deeltje in een frame correspondeert met een bepaald deeltje in het volgende frame, wordt, verdwijnt of fuseert / splitst met / van andere deeltjes toegewezen. De oplossing die wereldwijd minimaliseert de kosten, dwz. Degene met de hoogste waarschijnlijkheid, is uiteindelijk gekozen. Dit maakt ook het volgen van een tijdelijk verdwijnen deeltje, een typisch verschijnsel veroorzaakt door fluorofoor knipperen. De nieuwste versie van U-track (2.1.0) heeft grafische gebruikersinterfaces die de uitvoering van deze analyses te vergemakkelijken. <ol><li> Van de Matlab commando prompt &quot;movieSelectorGUI&quot; om de film selectie-interface te openen. Volg de instructies om een ​​te creërennieuwe film-database vanaf de eerder opgeslagen afzonderlijke beelden (zie 4.1.2). </li><li> Bieden de pixelgrootte in nm, tijdsinterval in seconden, numerieke opening, camera bit diepte en emissie golflengte van de fluorofoor, die nodig zijn voor deeltjes detectie en tracking. Sla de film-database. </li><li> Uit de film selectie interface, voert u de analyse, het kiezen van &quot;single-deeltjes&quot;, zoals type objecten. Een nieuw venster verschijnt waarin de parameters die worden gebruikt voor deeltjes detectie en tracking kan worden gedefinieerd. Begin met de standaard parameters. Later, passen deze parameters als de kwaliteit van de detectie en / of tracking is niet bevredigend (bijvoorbeeld zijn sommige deeltjes niet gedetecteerd of tracks zijn gefragmenteerd) Optioneel:. Onder de tracking-instellingen controleren &quot;Exporteren bijhouden van resultaten op de matrix van formaat&quot; om op te slaan de coördinaten en amplitudes van alle deeltjes in een matrix (veld &quot;trackedFeaturedInfo&quot;). Voor een gedetailleerde beschrijving van deze parameters vindt u in de u-spoor documentatie. </li><li> Voer het algoritme. Dit algoritme de locatie en intensiteit boven achtergrond van elke buigingsbegrensde vlek (dwz. Enkel receptoren / receptor complexen) door een tweedimensionale Gaussische functie met standaarddeviatie gelijk aan de puntspreidingsfunctie van de microscoop in lokale maxima intensiteit automatisch bepalen . Vervolgens voert u de tracking algoritme. Bewaar de resultaten van de analyses in een. Mat bestand. </li><li> Gebruik de &quot;movieViewer&quot; routine, die in de u-spoor pakket, of soortgelijke aangepaste degenen om de tracks te visualiseren en controleren de kwaliteit van de opsporing en tracking. </li><li> Open de mat bestand. De positie en amplitude (dwz., Intensiteit) van de bijgehouden deeltjes bij elk frame bekijken. Gegevens die bij stap 4.2.4 zijn opgenomen in het veld tracksCoordAmpCG van de tracksFinal array en / of in trackedFeaturedInfo. Van het totale aantal deeltjes gedetecteerd berekenen deeltjesdichtheid deze waarde te delen door het cel oppervlak gemeten 4.1.3. </li><li> Optioneel: Gebruik het deeltje coördinaten in de tijd (zie 4.2.6) om de beweging van de receptor deeltjes te analyseren. Bereken de gemiddelde vierkante verplaatsingen (MSD) en diffusiecoëfficiënten (D) met behulp van Matlab of soortgelijke software. Voor elk deeltje en elke tijdsinterval (Δ t) beschouwd, berekent het gemiddelde kwadraat verplaatsing (MSD) met de volgende formule: <img align="middle" alt="Vergelijking 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> waarbij Δ t het tijdsinterval in frames, N is het aantal stappen geanalyseerd x en y x en y de coördinaten deeltje op het door de index frame. Gebruik MSD tijd percelen het type beweging van een bepaald deeltje evalueren: Lineair verhoudingengeven gratis verspreiding (dwz., Brownse beweging), een positieve kromming (dwz., de curve ziet eruit als een parabool) suggereert gerichte beweging, een negatieve kromming is een indicatie van beperkte beweging 14. Bij vrij diffunderende deeltjes, berekent de diffusiecoëfficiënt (D) van elk deeltje door het aanbrengen van de MSD-gegevens verkregen met de volgende vergelijking: <img align="middle" alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li> Berekening van de deeltjesgrootte met Gaussian pasmethode Opmerking: Als de intensiteitsverdeling ijkmonsters (enkele fluoroforen op glas en / of fluorescerend gemerkte monomere receptoren) bekend is, een gemengde Gaussiaanse passen op de verdeling van deeltjes intensiteiten begin van een sequentie van beelden om de grootte van receptorcomplexen bepalen (dwz. het aantal receptoren per deeltje) 10. Het uitvoeren van deze analyses met behulp van Matlab of similar software. <ol><li> Bereken de intensiteit van elk deeltje van de gemiddelde intensiteit van de deeltjes van het eerste frame aan het frame voor de eerste verandering in intensiteit opgetreden (meestal een daling door fotobleken). </li><li> Voer een gemengde Gaussische fitting volgens de volgende vergelijking: <img align="middle" alt="Vergelijking 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> waarbij φ (i) is de frequentie van deeltjes met intensiteit I, n het getal component, α n is een parameter die bijdraagt ​​aan de hoogte van bestanddeel n, μ en σ zijn het gemiddelde en de standaardafwijking van de intensiteit van de referentie enkele fluoroforen . (berekend zoals beschreven in stap 3) OPMERKING: Bepaal thij maximale aantal componenten (nmax) voor elke reeks afbeeldingen door geleidelijk toenemende n max tot de toevoeging van een component ofwel niet langer produceert een statistisch beter vallend, zoals beoordeeld door een F-test. </li><li> Optioneel: (. Bijvoorbeeld de laatste 60 frames van een 400 framereeks) Voer een gemengde Gaussiaanse passen op de intensiteitsverdeling opgehaald op de laatste frames van de film. Vervang μ en σ met de waarden verkregen na deze montage, die geraffineerd schattingen voor de parameters te verstrekken, en herhaal stap 4.3.2. </li><li> Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) van elke component van de gemengde Gaussische fit. Bereken de relatieve abundantie van receptor deeltjes van verschillende grootte (bijvoorbeeld monomeer, dimeer, trimeer, etc.) door de AUC waarde van elke component te delen door de AUC van de volledige distributie. </li><li>Optioneel: Gegevens uit verschillende cellen en de bijbehorende deeltjesdichtheden (berekend zoals beschreven in 4.2.6) te plaatsen waarin de verdeling van deeltjes met verschillende grootte is gecorreleerd met deeltjesdichtheid 10 genereren. </li></ol></li><li> Berekening van de deeltjesgrootte met stap montage methode OPMERKING: Gebruik een stap fitting analyse als een alternatieve methode om de grootte van receptorcomplexen 10 bepalen. De basis voor deze analyse is dat de licht-geïnduceerde vernietiging (fotobleken) van een fluorofoor resulteert in de onmiddellijke verdwijnen - dus partikels die n fluoroforen verwachting geleidelijk bleekmiddel produceren een intensiteit profiel met n trappen. <ol><li> Extract intensiteit profielen van elk deeltje van de mat bestand. Gegenereerd door u-track of soortgelijke detectie / tracking software (zie 4.2.6). </li><li> Gebruik een stap fitting algoritme, zoals die gepresenteerdin ref. 10, het aantal bleken stappen voor elk deeltje tellen. </li><li> Optioneel: gebruik de resultaten verdelingen die de relatieve abundantie van receptor deeltjes van verschillende grootte te genereren en correleren met deeltjesdichtheid zoals eerder beschreven voor de resultaten van de gemengde Gaussische fitting (zie 4.3). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%3A+an+emerging+concept+for+G+protein-coupled+receptor+ontogeny+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).</li>
<li>Ferré, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+new+conceptual+framework+for+receptor+heteromers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a new conceptual framework for receptor heteromers.</a> Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).</li>
<li>Milligan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+hetero-dimerization%3A+contribution+to+pharmacology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function.</a> Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).</li>
<li>Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+in+GPCR+mobility+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dimerization in GPCR mobility and signaling.</a> Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nat Methods. 4, 319-321 (2007).</li>
<li>Triller, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+synaptic+biology+derived+from+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging.</a> Neuron. 59, 359-374 (2008).</li>
<li>Hern, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+M1+muscarinic+receptor+dimers+seen+by+total+internal+reflection+fluorescence+imaging+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).</li>
<li>Kasai, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+characterization+of+GPCR+monomer-dimer+dynamic+equilibrium+by+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging.</a> J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).</li>
<li>Calebiro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+fluorescently+labeled+G-protein-coupled+receptors+reveals+complexes+with+distinct+dynamics+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chem Biol. 15, 128-136 (2008).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De beschreven protocol maakt analyse van de ruimtelijke ordening, mobiliteit en grootte van celoppervlak receptor-complexen bij individuele molecuul. Vergeleken met het gebruik van fluorescente proteïnen, labeling met kleine organische fluoroforen, die helderder en fotostabiel zijn, heeft het voordeel van het toestaan ​​uitgebreide visualisatie van een enkele receptor deeltjes. Aangezien extreem lage expressieniveaus worden verkregen (&lt;0,45 receptor deeltjes / um 2) de eigenschappen van receptoren en ander...

Receptoren op het celoppervlak zin de extracellulaire omgeving en reageren op verschillende stimuli, zoals geurstoffen, ionen, kleine neurotransmitters en hormonen groot eiwit. De vloeibare aard van cellulaire membranen maakt bewegingen van receptoren en andere membraaneiwitten. Dit is essentieel voor de vorming van eiwitcomplexen en het optreden van transiënte eiwit-eiwit interacties, zoals die gebruikt door receptoren te assembleren in functionele eenheden en transduceren signalen in de cel interieur. Bijvoorbeeld, G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s), die de grootste familie van celoppervlak receptoren 1 vormen, zijn voorgesteld om di-/oligomers, die lijkt te worden betrokken bij de fijnafstemming regulatie van signaaltransductie en vorm belangrijke fysiologische en farmacologische gevolgen zou kunnen hebben 2-5. Single-molecule microscopie heeft het grote potentieel van direct visualiseren met een hoge spatiotemporale oplossing het dynamische gedrag van individuele receptoren op het oppervlak van levende cellen, met inbegrip van hun associatie met dimeren en hogere orde moleculaire complexen 6-10 vormen. Dit biedt verschillende voordelen ten opzichte van standaard biochemische en microscopie methoden, die gewoonlijk rapporteren de gemiddelde gedrag van duizenden of miljoenen moleculen. Eiwit labeling met een voldoende heldere en fotostabiel fluorofoor is essentieel voor single-molecule microscopie. Dit protocol maakt gebruik van de onlangs geïntroduceerde SNAP-tag 11 covalent hechten kleine en lichte organische fluoroforen aan celoppervlak receptoren. SNAP is een 20 kD eiwit tag afkomstig van het menselijk DNA-reparatie-enzym O 6-alkylguanine-DNA alkyltransferase, die onomkeerbaar kunnen worden gelabeld met fluorofoor-geconjugeerde benzylguanine (fluorofoor-BG) derivaten. CLIP, een verder ontwikkeld tag afgeleid van SNAP, kan in plaats daarvan worden gelabeld met fluorofoor-conjugated benzylcytosine derivaten 12. Het protocol beschreven in dit manuscript uitgelegd hoe transfecteren en label SNAP-11 receptoren gelabeld met kleine organische fluoroforen en gebruik totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie enkele receptoren of receptor complexen zichtbaar op het oppervlak van levende cellen 10. De gerapporteerde resultaten protocol in&gt; 90% labelingsefficiëntie een extracellulair SNAP-gelabeld eiwit van het celoppervlak 10. Nadere informatie over individuele molecuul gegevens gebruiken om de omvang en de mobiliteit van receptor complexen te analyseren, evenals transient receptor-receptor-interacties te vangen, is voorzien. Een schematische werkstroom van het gehele protocol is gegeven in figuur 1. Als voorbeeld, de transfectie van Chinese hamster ovarium (CHO) cellen met SNAP-gemerkte G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), gevolgd door het merken met een fluorofoor-BG derivaat als alsmede de toepassing ervan op quantify en de monitor receptor di-/oligomerization worden beschreven. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere cel-oppervlakte-eiwitten en fluorescerende labels (bijv.. CLIP), alsmede andere transfectie en etikettering methoden.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1585</td><td>VOORZICHTIG: giftige en irriterende stof evenals een mogelijk carcinogeen</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>VOORZICHTIG: sterke base en zeer corrosief reagens</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglas&nbsp;</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111640</td><td>24 mm diameter, 0.13-0.16 mm dikte</td></tr><tr><td>0.2 mm steriele filter</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>CHO cellen</td><td>ATCC, USA</td><td>ATCC CCL-61</td><td>Chinese hamster ovarium cel lijn</td></tr><tr><td>6-well celkweekplaat</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Fenol-rood vrij medium</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline - streptomycine&nbsp;</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P06-07 100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P10-23100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Fluorofoor-geconjugeerd benzyiguanine&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>S9136S</td><td>SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Maak een 1 mM stam oplossing in DMSO. Bewaar bij -20&deg;C.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvorming buffer:</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; NaCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1371</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; KCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; CaCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; MgCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; HEPES</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingskamer</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A-7816</td><td>Attofluor Cell Chamber, voor microscopie</td></tr><tr><td>TIRF-M</td><td>Leica</td><td></td><td>Model: DMI6000B</td></tr><tr><td>TIRF objectief</td><td>Leica</td><td>11 506 249&nbsp;</td><td>HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&nbsp;</td></tr><tr><td>EM-CCD camera&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>Photometrics Cascade 512B</td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar</td><td>Pecon</td><td></td><td>Tempcontrol 37-2 digitaal</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH, USA</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>u-track software</td><td>Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td><td></td><td>http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>The MathWorks, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie spatiotemporal analyse van receptor dynamics door single-molecule fluorescentie microscopie

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopie is in opkomst als een krachtige aanpak van het gedrag van signaalmoleculen, in het bijzonder met betrekking tot die aspecten (bv.., Kinetiek, naast elkaar bestaan ​​van verschillende staten en bevolkingsgroepen, voorbijgaande interacties), die typisch zijn verborgen in ensemble-metingen, zoals analyseren die verkregen met standaard biochemische methoden of microscopie. Aldus thermische, zoals receptor-receptor-interacties, kunnen worden gevolgd in real time in een levende cel met hoge resolutie spatiotemporal. Dit protocol beschrijft een methode waarbij merken met kleine en lichte organische fluoroforen en totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie direct visualiseren enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om precies receptoren lokaliseren, meten van de grootte van de receptor complexen, en vangen dynamische evenementen zoals transient receptor-receptor interacties. Het protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe u perform een ​​single-molecule experiment, inclusief monstervoorbereiding, beeldacquisitie en beeldanalyse. Als voorbeeld, de toepassing van deze methode twee G-eiwit-gekoppelde receptoren te analyseren, dwz., Β 2-adrenerge en γ-aminobutyric acid type B (GABA B) receptor, wordt gerapporteerd. Het protocol kan worden aangepast aan andere membraaneiwitten en verschillende celmodellen, transfectie en etikettering strategieën.

De beschreven protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van andere membraaneiwitten. Als voorbeeld, worden representatieve resultaten verkregen met β 2-adrenerge en GABA B-receptoren gemeld 10. Aangezien fluorescente signalen van enkele moleculen zwak, minimalisering van de achtergrond fluorescentie is de eerste cruciale stap succesvolle resultaten. Derhalve is het belangrijk om uitgebreid gereinigd dekglaasjes (Figuur 2A) gebruikt als monster autofluorescenti...

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en hun locatie, beweging en dynamische associatie in supramoleculaire complexen te analyseren. Dit wordt bereikt door snap-getagde receptoren op zeer lage niveaus op het oppervlak van levende cellen te exprimeren en ze te labelen met heldere organische fluoroforen om detectie van enkele moleculen mogelijk te maken. Als tweede stap worden cellen gevisualiseerd door totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie, die het mogelijk maakt om een snelle beeldsequentie van individuele receptordeeltjes te verkrijgen die zich op het celoppervlak bewegen.Vervolgens worden geautomatiseerde detectie- en volgalgoritmen toegepast op de beeldsequentie om de positie en intensiteit van elk receptordeeltje in de loop van de tijd te verkrijgen. Resultaten worden verkregen die een nauwkeurige analyse laten zien van de grootte van receptorcomplexen in dit voorbeeld, bèta-twee adrenerge receptoren op basis van een gemengde Gaussische fitting van de intensiteitsverdeling van de deeltjes aan het begin van de beeldsequentie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celbiologie, zoals hoe onze receptoren zich organiseren in domeinen van het oppervlak van levende cellen.Hoe ze met elkaar interageren om dimeren en oligomeren te vormen, en hoe dynamische gebeurtenissen aan de basis van receptorsignalering daadwerkelijk plaatsvinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven standaard biochemische en microscopiemethoden is dat het het gedrag van enkele receptoren in de natuurlijke omgeving onderzoekt, waardoor we belangrijke aspecten kunnen bestuderen die typisch verborgen zijn in ensemblemetingen. De deksels voor de monsters moeten grondig worden gereinigd om achtergrondfluorescentie te minimaliseren. Tijdens het beeldvormen, gebruik schone pincetten om een diameter van 24 millimeter te plaatsen.Glazen deksels in een dekselhouder die afzonderlijke deksels scheidt. Doe de houder met deksels in een beker en voeg chloroform toe totdat de deksels bedekt zijn. Bedek de beker met aluminiumfolie om verdamping te verminderen en soniceer in een bad.Soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Haal na een uur de dekselhouder uit de beker en laat de deksels drogen. Plaats vervolgens de houder met de deksels in een andere beker en voeg vijf molaire natriumhydroxideoplossing toe totdat de deksels bedekt zijn.Zoals eerder, bedek de beker met folie en soniceer gedurende een uur bij kamertemperatuur, breng de dekselhouder over in een nieuwe beker en was drie keer met gedestilleerd water. Leg ten slotte de gereinigde deksels in een glazen celkweekschaal gevuld met 100% ethanol. Hier worden deksels voor en na het schoonmaken getoond, geïmageerde door totale interne reflectiefluorescentie of turf-microscopie.Cal-kalibratiemonsters worden gebruikt om de intensiteit van enkele fluorescerende moleculen tijdens turf-microscopie te schatten. Om de monsters voor te bereiden, lost u de fluorescerende kleurstof op in het juiste oplosmiddel. Bereid een een-op-tien serieverdunning van de fluorescerende kleurstof variërend van één picaMolar tot één ano molair.In filtergesteriliseerde water. Was de eerder gereinigde deksels door ze over te brengen naar een celkweekschaal gevuld met filtergesteriliseerde water. Plaats vervolgens elke deksel in een putje van een zes-putjes celkweekplaat en wacht tot ze drogen. Spot 20 microliters van elke fluorescente kleurstofverdunning op een aparte gereinigde deksel.Laat de deksels drogen onder een steriele kap. Bescherm de deksels tegen licht en stof tot gebruik voorafgaand aan transfectie. Bereid een zes-putjes celkweekplaat voor. Was de gereinigde deksels met steriele PBS en plaats één deksel in elk putje van de zes-putjes celkweekplaat.De CHO-cellen die voor dit onderzoek worden getransfecteerd, worden gekweekt bij 37 graden Celsius in 5% CO2 in één, een-op-één ECCOs gemodificeerd arendskruitkweekmedium F 12 aangevuld met 10% foetaal runderserum penicilline en streptomycine na trypsinisatie en het tellen van de cellen volgens standaardmethoden gezaaid bij een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per putje. In de zesde celkweekplaat met deksels, laat de cellen 24 uur groeien in een incubator om ongeveer 80% confluentie te bereiken, wat de optimale celdichtheid is. Voor transfectie.Het moeilijkste aspect van dit protocol is om een extreem laag expressieniveau van membraanreceptoren op het celoppervlak te bereiken om succes te garanderen. De transfectievoorwaarden. Bijvoorbeeld, de hoeveelheid plus media NA en tijd na transfectie moet worden geoptimaliseerd Op de dag van transfectie.Bereid de transfectiereagentia voor voor elke zal twee microgram van de gewenste plaid DNA verdunnen in 500 microliters optimum medium in een andere buis. Voor elke put verdun zes microliters van Lipectomy 2000 in 500 microliters van Optum medium. Incubeer beide buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Na vijf minuten, combineer beide oplossingen in één buis en meng om een transfectiemengsel te verkrijgen. Incubeer het transfectiemengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de CHO-cellen voor.Was de cellen twee keer met voorgewaarschuwde PBS Na de tweede wasbeurt, vervang PBS met één milliliter per putje van fenolroodvrij D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS, maar zonder antibiotica. Voeg één milliliter van het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan elke put en schud de plaat voorzichtig heen en weer om volledige menging te garanderen. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5% CO2 gedurende twee tot vier uur voordat u onmiddellijk doorgaat naar de eiwitlabeling.Om deze procedure te beginnen, verdun één microliter van de fluoro-vier geconjugeerde benzo guine derivaat- of fluoro-vier BG-stockoplossing In één milliliter van D-M-E-M-F 12 medium aangevuld met 10% FBS om een eindconcentratie van één micromolar te verkrijgen. Haal de getransfecteerde cellen uit de incubator en was twee ke

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

We beschrijven een techniek voor het gelijktijdig meten van kracht-gereguleerde enkele receptor-ligand bindingskinetica en real-time beeldvorming van calciumsignalering in een enkele T-lymfocyt.

Fluorescentie biomembraan Force Probe: Concurrent kwantificering van Receptor-ligand Kinetics en-Binding geïnduceerde intracellulaire signalering op een enkele cel

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Hier presenteren we een praktische gids voor het bouwen van een geïntegreerde microscopie-systeem, dat wordt samengevoegd conventionele epi-belichting fluorescerende imaging, single-molecuul detectie gebaseerde Super resolutie beeldvorming en Multi-Color single-molecuul detectie, met inbegrip van single-molecuul fluorescentie resonantie energieoverdracht imaging, in één set-up op een kostenefficiënte manier.

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

3D single-molecuul lokalisatie microscopie wordt gebruikt om de ruimtelijke posities en bewegings trajecten van fluorescently gelabelde eiwitten in levende bacteriële cellen te sonde. Het experimentele en data-analyse protocol dat hierin wordt beschreven, bepaalt het heersende diffusieve gedrag van cytosolische eiwitten op basis van gegroepeerde enkelvoudige molecuul trajecten.

Single-molecule tracking microscopie-een hulpmiddel voor het bepalen van de Diffusieve toestanden van cytosolische moleculen

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Verken single-molecule fluorescentiemicroscopie om receptordynamica op levende celoppervlakken te analyseren. Deze methode onthult mobiliteit, complexgroottes en tijdelijke interacties van receptoren in hun natuurlijke omgeving.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Meer video's verkennen