Name: Hydrogel Nanoparticle Oogsten van plasma of urine voor het opsporen van Low Overvloed Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer hoe hydrogel-nanodeeltjes laag-abundante biomarkers uit plasma of urine concentreren voor verbeterde eiwitdetectie. Deze methode verhoogt de gevoeligheid van diagnostische assays aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Michael Henry, Dublin City University, vriendelijk geholpen met het verzamelen en analyseren van gegevens weergegeven in figuur 5. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door (1) George Mason University, (2) de Italiaanse IstitutoSuperiore di Sanita &#39;in het kader van het Italië / VS samenwerkingsovereenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid en Human Services, George Mason University, en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid, (3) NIH, IMAT programma subsidies 1R21CA137706-01 en 1R33CA173359-01 naar LAL, en (4) Ceres nanowetenschappen, Inc .

Menselijk plasma en urine werd verzameld van gezonde vrijwillige donoren, met schriftelijke informed consent, na George Mason University Institutional Review Board goedgekeurde protocollen. Donoren werden gelijk verdeeld tussen blanke mannen en vrouwen tussen de leeftijden van 25 en 42 monsters werden afzonderlijk geanalyseerd en werden niet samengevoegd. 1 Nanoparticle Verwerking van Serum of plasma Potentiële laag overvloedige biomerkers in plasma worden gevangen, in oplossing, met hydrogel nanodeeltjes. De deeltjes worden toegevoegd aan het plasma, geïncubeerd, afgescheiden door centrifugeren, gewassen, en de gevangen eiwitten geëlueerd. De geëlueerde eiwitten werden gedroogd onder een stikstofstroom voor downstream massaspectrometrie sequentiebepaling en identificatie. <ol><li> Verdun 500 pi serum 1: 2 met 50 mM Tris-HCl pH 7 (500 pi serum + 500 pl Tris-HCl) in een microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 500 ul van poly (NIPAm / AAC) kern nanopartikelen. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 500 ul natriumthiocyanaat (25 mM) aan de pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. </li><li> Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 500 ul van MilliQ water om de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. </li><li> Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Bereid vers elutiebuffer Voeg 700 ul acetonitril 300 gl ammoniumhydroxide in een schone buis. Let op: Ammoniumhydroxide is corrosief. Gebruik met geschikte ventilatie. Opmerking: De elutie buffer moet prep zijnared direct voor gebruik. Laat de elutie buffer opslaan. </li><li> Voeg 300 ul elutiebuffer de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Draai het monster bij 16.100 xg, 25 ° C gedurende 10 minuten in een centrifuge met vaste hoek rotor. Verwijder en bewaar het eluaat op in een schone, gelabeld microcentrifugebuisje. </li><li> Herhaal de stappen 1,9-1,10. Combineer twee eluaten in een microcentrifugebuis. </li><li> Droog de ​​eluaten onder een stikstofstroom in een stikstof verdamper verdeelstuk bij 42,1 ° C, met luchtstroom ingesteld op 8 (figuur 2F). </li><li> Bewaar de gedroogde eluaat bij KT O / N opslag of bij -20 ° C voor lange termijn opslag, voorafgaand aan massaspectrometrie, western blotting of ELISA assays (optioneel). </li></ol> 2 Nanoparticle Verwerking van Urinemonsters Normale urine bevat minder dan 30 mg / dl eiwit enminder dan 1 + bloed. Veel ziekten / aandoeningen kan de normale niveaus van urine-eiwit en bloed veranderen. Om te helpen bij het bepalen van de optimale hoeveelheid nanodeeltjes te voegen aan het urinemonster wordt urineonderzoek voor nanodeeltjes oogsten uitgevoerd. Urine biomarkers kunnen in zeer lage concentraties die aanleiding kunnen optimale verhouding nanodeeltjes urinevolume. Deze procedure beschrijft nanodeeltjes verzamelen van urine monsters voor downstream western blot analyse. <ol><li> Verzamel urine in een schone, droge plastic beker. Een 22 ml minimaal volume gewenst. Bewaren urine monsters bij -80 ° C tot klaar om te analyseren. </li><li> Ontdooi de bevroren urine bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N. Meng kort op een vortex mixer. Giet minstens 22 ml urine in een 50 ml conische bodem polypropyleen buis. </li><li> Spin de urine in een centrifuge met een swing-out rotor bij 3700 xg gedurende 15 minuten. Schenk de urine, zonder de pellet te verstoren, in een schone 50 ml conische bodem polypropeenopylene buis. Gooi de pellet. </li><li> Uitvoeren urineonderzoek behulp van een multi-analyt &quot;urinepeilstok&quot; reagens strip. Let op: bewaar de reagens strips in een goed gesloten verpakking uit de buurt van direct zonlicht en vocht 17, 18. <ol><li> Leg de reagens strip, face-up, op een schone, droge tissue. </li><li> Gebruik een wegwerp pipet 1 ml van de volgens stap 2.3 urine zuigen. </li><li> Stel een timer voor 2 min, maar niet starten. Snel afzien 1-2 druppels urine op elke test pad van het reagens strip. Onmiddellijk start de timer. Opmerking: Het reagens strip niet direct onderdompelen in de urine container. De kleurstof / chemische indicatoren in de reagens strip kan mogelijk uit de reagens strip lekken in de urine container. </li><li> Ten tijde van de reagens strip houder aangegeven, nemen de kwalitatieve resultaten voor de verschillende analyten de reagens strip door vergelijking van de kleur van de afzonderlijke reagens strips de overeenkomstige gekleurde indicaren op het reagensreservoir. Typische normale urine resultaten zijn: (normaal of negatief) voor bloed, eiwit, leukocyten, nitriet, glucose, ketonen, bilirubine, en urobilinogeen; Urine pH (5,5-7,0); soortelijk gewicht (1,001-1,020). Opmerking: Hoge eiwitgehalten in een urinemonster kan concurreren met het eiwit van interesse voor bindingsplaatsen op de nanodeeltjes. Om eiwit oogsten met nanodeeltjes maximaliseren, kunnen de nanodeeltjes volume / volume-verhouding urine worden aangepast om ofwel grens concurrentie van de abundantie proteïnen, of kan worden geoptimaliseerd om eiwitten die bestaan ​​in zeer lage concentraties oogsten. Als de urine eiwit waarde is 1 + of hoger, voeg 2x volumes van nanodeeltjes in stap 2.5. Als de analyt van belang een laag overvloedige eiwitten, kan het nodig zijn om het volume van nanodeeltjes te verhogen tot 2 ml (figuur 3). </li></ol></li><li> Breng 20 ml van de geklaarde urine uit stap 2.3 in een schone 50 ml conische bodem polypropyleen buis. Nietstoren vuil / pellet die mogelijk in de bodem van de urinebuis. Voeg 200 ul van nanodeeltjes aan de 20 ml urine monster. Meng kort op een vortex mixer. Opmerking: Als de urine eiwit waarde is 1 + of hoger, voeg 400 ul van nanodeeltjes tot 20 ml urine. </li><li> Incubeer de urine / nanodeeltjes mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur, zonder schokken / mixing. </li><li> Spin de urine / nanodeeltjes suspensie in een centrifuge uitgerust met een swing-out rotor bij 3700 xg gedurende 10 minuten. Opmerking: Als de pellet niet zichtbaar na centrifugatie, draaien de monsters voor nog eens 2-7 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof. Voeg 500 ul MilliQ water de nanodeeltjes pellet. </li><li> Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Breng de oplossing nanodeeltjes een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Spin de nanodeeltjes in een centrifuge met vaste hoek rotor bij 16.100 xg gedurende 10 minuten. Opmerking: Als een pellet is niet zichtbaar folgende centrifugatie, draaien de monsters voor nog eens 2-7 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof. </li><li> Herhaal stap 2.8 en 2.11 (tweemaal) met 200 ul 18 MilliQ water om de nanodeeltjes te wassen. </li><li> Bereid vers elutiebuffer Voeg 970 ul acetonitril 30 gl ammoniumhydroxide in een schone buis. Let op: Ammoniumhydroxide is corrosief. Gebruik met geschikte ventilatie. Opmerking: De elutie buffer moet onmiddellijk voor het gebruik worden bereid. Laat de elutie buffer opslaan. </li><li> Voeg 20 ul elutiebuffer de nanodeeltjes pellet. Resuspendeer de nanodeeltjes door krachtig pipetteren en neer meerdere keren. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Draai het nanodeeltje monsters bij 16.100 xg gedurende 10 minuten. Verwijder en bewaar het supernatant in een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Niet verstoren de nanodeeltjes pellet. Gooi de pellet in het biologisch afval. </li><li> Plaats de monsters in een rek in een zuurkast. Haal de doppen en meerderUbate bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Alternatief plaats de monsters onder een stikstofstroom bij 40 ° C te drogen (1 - 2 uur). </li><li> Voeg 15 pl Tris-glycine SDS monsterbuffer (2x) de monsters. Heat 100 ° C in een droge verwarmingsblok gedurende 5 min met de doppen geopend of totdat de hoeveelheid nog in de buis niet meer dan 20 pl. Let op: niet een bad met kokend water niet te gebruiken. De vochtigheid van het waterbad wordt verdamping van de buffer te voorkomen. </li><li> Plaats de dop op de buizen. Haal de buizen uit het verwarmingsblok. Het monster kan bij -80 ° C bewaard of onmiddellijk voor downstream western blot analyse. </li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside%3A+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li>
<li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+low-abundance%2C+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li>
<li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li>
<li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li>
<li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li>
<li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li>
<li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine%2C+such+as+Human+Growth+Hormone+%28hGH%29%2C+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogel+particles%3A+biomarker+harvesting%3A+one-step+affinity+purification%2C+size+exclusion%2C+and+protection+against+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li>
<li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li>
<li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+core-shell+nanoparticles%3A+discovery+of+previously+invisible+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Test+Anal%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+particles+harvest%2C+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763(2009).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sports+Med+Doping+Stud%22%5BJournal%5D)">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264(2007).</li>
<li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+%28hGH%29+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li>
<li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li>
<li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li>
<li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li>
<li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29%3A+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li>
<li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li>
<li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li>
<li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2%2C6-sialyltransferase+secretion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li>
<li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARC%2FCCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li>
<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina is een werknemer van Ceres Nanosciences, Inc. die reagentia produceert die in dit artikel worden gebruikt. Lance Liotta, Alessandra Luchini en Virginia Espina hebben octrooien (VS octrooi 7.935.518 en/of 8.497.137) op de nanotechnologie die in dit artikel wordt gebruikt. Als universiteitsmedewerkers hebben ze volgens de universiteitsbeleid recht op royalty's van deze octrooien. Lance Liotta en Alessandra Luchini zijn aandeelhouders in Ceres Nanosciences en zijn lid van de Wetenschappelijke Adviesraad.

Klinische relevantie Een serum of plasma monster wordt gedacht lage abundantie circulerende eiwitten en peptiden die een rijke bron van informatie over de toestand van het gehele organisme kan bieden bevatten. Ondanks de belofte van serum proteomics, zijn er drie fundamentele en ernstige fysiologische barrières tegenwerken van de ontdekking van biomarkers en vertalen naar klinisch voordeel 10, 11, 16, 25. 1 Belangrijke diagnostische bi...

Ondanks de voltooiing van het menselijk genoom, heeft aanzienlijke vooruitgang niet is gemaakt in het identificeren van biomarkers voorspellend vroeg stadium van de ziekte, of die correleren met therapeutisch resultaat, of prognose 1. Een reden voor dit gebrek aan vooruitgang is dat veel potentieel belangrijke biomarkers bestaan ​​in een concentratie onder de detectiegrens van conventionele massaspectrometrie en andere biomarkers platforms. Massaspectrometrie (MS) en Multiple Reaction Monitoring (MRM) een detectiegevoeligheid typisch groter dan 50 ng / ml terwijl de meerderheid van de analyten gemeten immunoassays in een klinisch laboratorium daling in het traject van 50 pg / ml en 10 ng / ml . Dit betekent dat veel biomarkers, vooral in het vroege stadium van een ziekte niet kan worden gedetecteerd door conventionele MS en MRM 2. Ook de aanwezigheid van hoge-abundantie proteïnen zoals albumine en immunoglobuline in complexe biologische vloeistoffen vaak masker miljard maal excess lage abundantie laagmoleculaire eiwitten en peptiden 3, 4. daarom verschillende monsters voorbereidende stappen zijn voor massaspectrometrie sequentiebepaling en identificatie vereist. Een dergelijke voorbereidende stap gebruikt de uitputting van high-abundantie proteïnen in de handel verkrijgbare uitputting kolommen 5-8. Helaas deze stap leidt tot vermindering van de opbrengst aan kandidaat biomarkers omdat zij vaak niet-covalent geassocieerd met dragereiwitten die worden verwijderd. Een ander probleem wordt vertegenwoordigd door de stabiliteit van kandidaat biomerkers ex-vivo wanneer de monsters worden genomen. Eiwitten zijn onderhevig aan afbraak door endogene of exogene proteasen 9. Hydrogel nanodeeltjes kunnen deze kritische problemen overstijgen door het amplificeren van het vermoedelijke biomarker concentratie een niveau binnen het bereik van de assay, en beschermt het eiwit degradatie 10-13. Het is belangrijk om ste merkenbij LMW eiwitten in bloed een mengsel van kleine intacte eiwitten en fragmenten van grote eiwitten. Weefsel afgeleide eiwitten groter dan 60 kDa te groot passief in de bloedstroom door het vasculaire basale membraan, maar ze kunnen in bloed peptiden of eiwitfragmenten 14 vertegenwoordigd. Ons doel is om nieuwe circulerende biomarkers die kandidaat zijn voor de vroegtijdige opsporing van de ziekte, de patiënt stratificatie voor therapie, en het bewaken van de respons op de therapie kan meten. Onze nanodeeltjes zijn gemaakt om selectief te sluiten hoge overvloed immunoglobulinen en albumine, terwijl tegelijkertijd het vastleggen van kleinere eiwitten en peptiden en concentreren ze tot 100 keer, afhankelijk van het uitgangspunt volume. De fractie leverde een set kleine organische kleurstoffen die met succes kan fungeren als hoge affiniteit voor moleculaire lokaas eiwitten en peptiden. Eiwit-dye binding is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van hydrofobe interacties en elektrostatisches. De aromatische ringen op de kleurstof interleave met eiwitten via hydrofobe zakken op het eiwit oppervlak 11. De lokmiddelen, afhankelijk van hun chemie, tonen een bijzondere affiniteit voor bepaalde klassen van analyten. De lokmiddelen concurreren met de dragereiwitten, zoals albumine, voor de eiwitten of peptiden. De laagmoleculaire eiwitten / peptiden worden gevangen in het deeltje. Hoogmoleculaire eiwitten zoals albumine en immunoglobuline verhinderd het deeltje door het zeven vermogen vanwege de restrictieve poriën van de hydrogel 11 (figuur 1). Hydrogel nanodeeltjes worden gesynthetiseerd door precipitatie polymerisatie geïnitieerd door ammoniumpersulfaat 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), zijn co-monomeren van acrylzuur (AAc) en allylamine (AA) en vernetter N, N&#39;-methyleenbisacrylamide (BIS) liet reageren bij 70 ° C gedurende 6 uur in verdunde omstandigheden 11, 13. Eiwitrijke bindingsaffiniteit van poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylzuur) (poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis bereikt door covalent integratie-amino bevattende kleurstoffen (dwz., Sulfonatedanthraquinonetriazine kleurstoffen) in de nanodeeltjes door een amideringsreactie uitgevoerd in waterige of organische oplosmiddelen, afhankelijk van de hydrofiele / hydrofobe eigenschappen van de kleurstoffen 11, 13. Nucleofiele substitutie van de aminegroepen in de nanodeeltjes met het chlooratoom van een anthraquinonetriazine kleurstof wordt gebruikt om kleurstof bevattende poly (NIPAm creëren -co- allylamine) (AA) nanodeeltjes 11, 12. een tweestaps polymerisatiewerkwijze wordt gebruikt om hydrogel nanodeeltjes die de buitenzijde van vinylsulfonzuur (VSA) 11, 13 te creëren. Hydrogel nanodeeltjes kan op verschillende biologische vloeistoffen, zoals volbloed, plasma, serum, cerebrospinale vloeistof, zweet en urine. In een stap, in oplossing, de nanoparticles voeren een snelle (binnen minuten) sekwestratie en concentratie van laagmoleculaire analyten 10, 11, 13, 15-18. Eiwitten worden vervolgens geëlueerd van de nanodeeltjes en gedetecteerd met Western blotting 19-21, massaspectrometrie 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​of omgekeerde fase eiwit microarray 16, 24 assays. Nanodeeltjes gefunctionaliseerde met chemische aas, en het presenteren van een kern of kern shell architectuur, afvang en concentreer proteïnen, op basis van het aas / shell fysisch-chemische eigenschappen. Verschillende kleurstoffen opgenomen in de nanodeeltjes ook verschillende subsets van eiwitten vastleggen met verschillende efficiëntie op basis van de kleurstof affiniteit, pH van de oplossing en de aanwezigheid / afwezigheid van concurrerende high-overvloedige eiwitten 13. Bovendien zal de hoeveelheid nanodeeltjes in verband met het volume van de oplossing het eiwit opbrengst van de nanodeeltjes beïnvloeden. Deze aspecten vanhydrogel nanodeeltjes oogsten worden gedemonstreerd met behulp van drie verschillende nanodeeltjes aas voor het oogsten eiwitten uit plasma monsters die grote hoeveelheden van eiwit en urine monsters die doorgaans geen grote hoeveelheden eiwit. In dit protocol tonen we oogsten en concentreren tumornecrosefactor alfa (TNFa) van plasmamonsters met poly (NIPAm-co-AAc), Poly (NIPAm / kleurstof) en kern-shell nanodeeltjes (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / kleurstof) nanodeeltjes worden aangetoond dat Mycobacterium species antigeen die werd toegevoegd aan de menselijke urine monsters, concentreren om na te bootsen Mycobacterium tuberculosis geïnfecteerde individuen.

<table><tbody><tr><td>Hydrogel nanodeeltjes</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP deeltjes</td></tr><tr><td>18 MΩ-cm water</td><td></td><td></td><td>Type 1 reagentkwaliteit water</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Beschikbaar bij VWR</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Beschikbaar bij VWR, getest op 28-30% NH3</td></tr><tr><td>Natriumthiocyanaat 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Voor serum/plasma monsters</td></tr><tr><td>Multi-analyt Urine Reagensstrips</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Voor urine monsters</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Monsterbuffer (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Gebruik bij kamertemperatuur om precipitatie van SDS te voorkomen</td></tr><tr><td>Droogincubator (100 oC) met verwarmingsblok</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Geen vervanging door een kokend waterbad</td></tr><tr><td>Stichtheidsmeter</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Voor serum/plasma monsters</td></tr><tr><td>Centrifuge, schommelkop</td><td>Sorvall</td><td>Legend serie</td><td>50 ml buiscapaciteit, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Centrifuge, vaste hoekrotor</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>1,7 ml microcentrifugecapaciteit, rcf 16.000 x g</td></tr><tr><td>50 ml kegelcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Met schroefdop voor urine monsters</td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Seconden/minuten</td></tr></tbody></table>

hydrogel nanoparticle oogsten van plasma of urine voor het opsporen van low overvloed eiwitten

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Nieuwe biomarker discovery speelt een cruciale rol in het leveren van meer gevoelige en specifieke ziekten opsporen. Er is nog veel low-abundantie biomarkers die bestaan ​​in biologische vloeistoffen niet gemakkelijk worden gedetecteerd met massaspectrometrie of immunoassays omdat ze in zeer lage concentratie, zijn labiel en vaak gemaskeerd door high-abundantie proteïnen zoals albumine en immunoglobuline. Aas die poly (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) op basis van nanodeeltjes in staat zijn om deze fysiologische barrières te overwinnen. In een stap zij kunnen vangen, concentreren en bewaren biomarkers van lichaamsvloeistoffen. Laag moleculair gewicht analyten Voer de kern van de nanodeeltjes en weergegeven door verschillende organische chemische kleurstoffen, die fungeren als hoge affiniteit eiwitlokaas. De nanodeeltjes kunnen de eiwitten van belang te concentreren door verscheidene orden van grootte. Deze concentratie factor voldoende is om het eiwit te verhogen zodanig dat de eiwitten in dedetectielimiet van huidige massaspectrometers, western blotting en immunoassays. Nanodeeltjes kunnen worden geïncubeerd met een overvloed aan biologische vloeistoffen en zij kunnen sterk verrijken de concentratie van laagmoleculaire eiwitten en peptiden met uitsluiting albumine en andere hoogmoleculaire eiwitten. Onze gegevens tonen aan dat een 10.000-voudige amplificatie in de concentratie van een analyt kan worden bereikt, zodat massaspectrometrie en immunoassays eerder detecteerbare merkers opgespoord.

Hydrogel Nanoparticle Maat en Uniformiteit Poly (NIPAm-AAC) deeltjes zijn geproduceerd met zeer hoge opbrengst en reproduceerbaarheid tussen en binnen partijen. De deeltjes hebben zeer goede colloïdale stabiliteit bij kamertemperatuur gedurende de tijd die nodig is voor het vastleggen, opslaan, en elutie van eiwitten (tenminste 48 uur), en nanodeeltjes neerslag is niet waargenomen (figuur 1) 11. De colloïdale stabiliteit kan zeer belangrijk zijn v...

Verschillende pathologische biomarkers kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd door huidige technieken vanwege hun lage concentratie in biologische vloeistoffen, de aanwezigheid van degraderende enzymen en grote hoeveelheden eiwitten met een hoog molecuulgewicht. Chemisch gefunctionaliseerde hydrogel-nanodeeltjes kunnen eiwitten met een lage abundantie verzamelen, bewaren en concentreren, waardoor de detectie van voorheen ondetecteerbare biomarkers mogelijk wordt.

Hydrogel Nanoparticle Oogsten van plasma of urine voor het opsporen van Low Overvloed Eiwitten

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Het algemene doel van deze procedure is om biomarkers met een lage abundantie en laag moleculair gewicht te oogsten, concentreren en bewaren uit biologische vloeistoffen bij geschikte concentraties. Voor standaard eiwittests wordt dit bereikt door eerst chemisch gefunctionaliseerde hydrogel-nanodeeltjes toe te voegen aan de biologische vloeistof, laag moleculair gewicht. Analyten komen binnen in de kern van het nanodeeltje en worden gevangen door verschillende organische chemische kleurstoffen, die als eiwitlokstoffen met hoge affiniteit fungeren.De tweede stap is om de deeltjes te scheiden van de biovloeistof door centrifugeren. De nanodeeltjes concentreren de eiwitten van belang met meerdere ordes van grootte. De nanodeeltjes worden vervolgens met water gewassen om overtollige eiwitten te verwijderen.De laatste stap is om de gevangen eiwitten van de nanodeeltjes te elueren. Uiteindelijk worden westerse blotting, massaspectrometrie of amino-assays gebruikt om de aanwezigheid en/of concentratie van de eerder ondetecteerbare biomarkers met een lage abundantie die zijn geoogst, aan te tonen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de nanodeeltjes moeten worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd.Zonder de pipettip te verstoppen, schorsen de nanodeeltjes niet zo gemakkelijk op als een cel P. U moet dus krachtig op en neer pipetten om de nanodeeltjes na de eerste incubatie voldoende op te schorsen. Bij nanodeeltjes is het belangrijk om de wanden van de buis te spoelen om eventuele restanten van nanodeeltjes die mogelijk aan de buis hebben geadheerd, te verzamelen. Om nanodeeltjesverwerking van serummonsters uit te voeren, verdunt u 500 microliter menselijk serum één tot twee met 50 millimolair tris, HCL pH zeven in een microcentrifugebuis.Voeg 500 microliter poly- en isopropylacrylamide of poly nipam co-monomeren van acrylzuurkernnanodeeltjes toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Draai vervolgens het monster 16.100 keer G en 25 graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder en gooi de SUP natin weg voordat u 500 microliter natriumthiocyanaat toevoegt aan de pellet, schors de nanodeeltjes opnieuw door meerdere keren krachtig op en neer te pipetten.Draai het monster weer als voorheen en gooi het supernatant weg voordat u 500 microliter milli Q water toevoegt aan het nanodeeltjespellet. Schros opnieuw de nanodeeltjes op door meerdere keren krachtig op en neer te pipetten. Nadat het monster opnieuw is gedraaid, had ik 300 microliter vers elucian, buffer en schors met behulp van de gedemonstreerde techniek.Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na een laatste draai van het monster en bewaar de EIT in een schone gelabelde microcentrifugebuis. Elueer een tweede keer en combineer de twee EIT's in één microcentrifuge.Twee.Droog vervolgens de EIT's onder stikstofstroom en een stikstofverdamper-manifold bij 42,1 graden Celsius met luchtstroom ingesteld op zes. Bewaar de gedroogde EIT bij kamertemperatuur voor overnachtopslag of voeg negentig graden Celsius toe voor langdurige opslag vóór massaspectrometrie, westerse blotting of EISA-assays om nanodeeltjesverwerking van urinemonsters uit te voeren. Verzamel een minimaal volume van 22 milliliter en bewaar de monsters bij negentig graden Celsius totdat u klaar bent om te analyseren.Ontdooi de bevroren urine bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Eenmaal ontdooid, even kort mengen op een vortexmixer. Giet vervolgens ten minste 22 milliliter urine in een polypropyleen buis met conische bodem van 50 milliliter.Spin vervolgens de urine in een centrifuge met een draaibare rotor bij 3.700 keer G gedurende 15 minuten zonder het pellet te verstoren. Decanteer de urine in een schone polypropyleen buis met conische bodem van 50 milliliter en gooi het pellet weg. Voer een urine-analyse uit met behulp van een multi-analytisch urine-dipstick reagenstrookje.Leg de reagenstrook met de zijde naar boven op een schone, droge papieren handdoek. Gebruik een wegwerppipet om een milliliter van de urine af te zuigen. Spuit snel een tot twee druppels urine op elk testveld van de reagenstrook.Start onmiddellijk een timer die eerder was ingesteld op twee minuten op het tijdstip dat op de reagenstrookcontainer is aangegeven. Noteer de kwalitatieve resultaten voor de verschillende analyten in de reagenstrook door de kleur van de individuele reagenstroepjes te vergelijken met de overeenkomstige kleurgecodeerde indicatoren op de reagent container. Typische normale urineresultaten worden gekenmerkt door een pH van 5,5 tot 7,0 en een specifiek gewicht van 1,001 tot 1,020.De urine moet negatief zijn voor bloedeiwit, leukocyten, nitriet, glucose, keton, bilirubine en urobilinogeen. Breng vervolgens 20 milliliter van de opgehelderde urine over in een schone polypropyleen buis met conische bodem van 50 milliliter. Verstore geen eventueel troebel pellet dat zich mogelijk op de bodem van de urinebuis bevindt, waaruit u de urine verwijdert.Voeg 200 microliter nanodeeltjes toe aan het urinemonster van 20 milliliter en meng kort op een vortexmixer. Incubeer vervolgens het urine-nanodeeltjesmengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden of te mengen. Draai de urine-nanodeeltjessuspensie in een centrifuge uitgerust met een draaibare rotor bij 3.700 keer G gedurende 10 minuten.Na het verwijderen en weggooien van het supernatant, voegt u 500 microliter Milli Q water toe aan het nanodeeltjespellet. Schros de nanodeeltjes opnieuw op door meerdere keren krachtig op en neer te pipetten. Breng de nanodeeltjesoplossing over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Spin vervolgens de nanodeeltjes in een centrifuge uitgerust met een vaste hoekrotor bij 16.100 keer G gedurende 10 minuten. Verwijder en gooi het supernatant weg voordat u deze stappen herhaalt met water. Om de nanodeeltjes te wassen, voegt u 20 microliter vers elutiebuffer toe aan het nanodeeltjespellet en schors de nanodeeltjes opnieuw op door meerdere keren krachtig op en neer te pipetten.<

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het isoleren van exosomen uit menselijke urine met behulp van een gemodificeerde precipitatietechniek.

Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Dit protocol toont hoe femto molaire detectiegevoeligheid van eiwitten in 10 µL vol bloed binnen 30 minuten kan worden bereikt. Dit kan worden bereikt door het gebruik van elektrogesponnen nanovezelmatten geïntegreerd in een lab-on-a-disc, die een groot oppervlak biedt evenals effectief mengen en wassen voor een verbeterde signaal-ruisverhouding.

Volautomatische centrifugale microfluïdische apparaat voor Ultragevoelige Protein Detection uit volbloed

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.

Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde serummonsters, geïllustreerd met de biomarker progastrine-releasing peptide (ProGRP). Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden gebruikt voor de selectieve reiniging en verrijking van een proteotypisch ProGRP-peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geanalyseerd met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor de isolatie, karakterisering en kwantificering van humane plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV) en presenteert een workflow voor labelvrije analyse van het EV-proteoom met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS).

Isolatie, karakterisering en proteomische analyse van plasma-afgeleide extracellulaire blaasjes voor de ontdekking van cardiovasculaire biomarkers

Dit protocol standaardiseert SDS-PAGE-analyse voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering op nanodeeltjes, waardoor reproduceerbare, schaalbare en goedkope detectie van kankerspecifieke signaturen mogelijk is. Ontworpen voor vroege diagnose van pancreasductaal adenocarcinoom, biedt het een praktisch, GERUSTGESTELD alternatief voor complexe proteomische methoden in zowel onderzoek als klinische omgevingen.

Gestandaardiseerde SDS-PAGE workflow voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering bij vroege kankerdetectie

Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Leer hoe hydrogel-nanodeeltjes laag-abundante biomarkers uit plasma of urine concentreren voor verbeterde eiwitdetectie. Deze methode verhoogt de gevoeligheid van diagnostische assays aanzienlijk.

Hydrogel Nanoparticle Oogsten van plasma of urine voor het opsporen van Low Overvloed Eiwitten

Meer video's verkennen