Name: Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Leer differentiële scanning fluorimetrie voor het bepalen van eiwit-ligand interacties en dissociatieconstanten. Deze methode biedt een snelle en betrouwbare analyse met matige hoeveelheden monster.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de BBSRC (subsidienummer BB/H019685/1 en BB/E527663/1) aan de Universiteit van Exeter.

1 Bepaling van een benaderende waarde voor de dissociatieconstante (dwz binnen een orde van grootte) <ol><li> Bereid het mengsel in tabel 1. </li><li> Bereid de voorraden van het ligand van de belangstelling op de hoogst beschikbare concentratie, en dan om zes decimale verdunningen van dit. Wanneer een geschatte Kd is bekend uit eerdere gegevens, gericht aan ten minste twee concentraties boven en onder de Kd hebben. </li><li> Aliquot 18 ul van het mengsel in acht putjes in een qPCR plaat. Voeg 2 pi van oplosmiddel tot het eerste putje. Voeg 2 pi van elk lid van het ligand verdunningsreeks (stap 1.2) een goed elk van de zeven putjes. </li><li> Plaats een qPCR afdichting over de plaat. Om een ​​goede afdichting van de plaat, plaatst een handapplicator (zie tabel specifieke reagentia) in het midden van de plaat. Gladstrijken van de afdichting aan de ene kant, en herhaal aan de andere helft van dede plaat. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 500 xg gedurende twee minuten om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Plaats de plaat in een StepOne qPCR instrument. Selecteer de optie &quot;Melt curve &#39;, de ROX filters, en kiezen voor de snelle helling snelheid (dit levert een 2 minuten pauze bij 25 ° C, gevolgd door een helling tot 99 ° C in 40 min, en dan een 2 minuten pauze). Voer een thermische denaturatie. OPMERKING: Script-bestanden voor het uitvoeren van een run zijn online beschikbaar op http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Aan het einde van het instrument lopen, klik op de &quot;Analyze&quot; knop op het scherm. Sla het resultaat bestand. </li><li> Open de Protein Thermal Shift software. <ol><li> Maak een nieuwe studie; in het tabblad eigenschappen, geef deze een naam, en in het tabblad Voorwaarden, detail van de liganden. </li><li> Ga naar het tabblad Experiment Files, en importeer de opgeslagen resultaten bestand (XXX.eds), en zet de inhoud van elk putje (template files zijn verkrijgbaar bij de auteurs). </li><li> Ga naar het tabblad Analyse, en druk op de knop &quot;Analyseren&quot;. OPMERKING: Dit zal de resultaten te analyseren. Het is mogelijk om de resultaten van verder onderzoek met Excel via het tabblad Export exporteren. De resultaten worden uitgevoerd in een tab afgebakend formaat. Het beste is om het geëxporteerde bestand in Excel te openen en direct op te slaan in Excel-formaat. </li></ol></li><li> Controleer dat het eiwit in aanwezigheid van alleen oplosmiddel tot een resultaat soortgelijk aan die getoond in figuur 1A. Vervolgens onderzoekt de smelttemperatuur waargenomen in de resultaten in het &quot;repliceren&quot; venster. Zorg ervoor dat dit toont een duidelijke verhoging van de smelttemperatuur met toenemende concentratie ligand. OPMERKING: Idealiter zal een duidelijk maximum smelttemperatuur (aangenomen dat het eiwit volledig ligand gebonden) en een geschatte Kd verstrekken indien de smelttemperatuur ligt halverwege tussen de ligand-vrij proteïne enhet maximum. </li></ol> 2 experimentele opstelling voor het bepalen van de dissociatieconstante <ol><li> Bereid het mengsel in tabel 2 als een master mix. </li><li> Bereid voorraden van de ligand vijftien verschillende concentraties, die wordt verdund tienvoudig in het laatste experiment. Idealiter bevatten concentraties ten minste twee orden van grootte boven en onder de geschatte Kd en centreren de concentraties op de geschatte Kd. Focus op zeven van de punten in een orde van grootte van de geschatte Kd, met nog vier punten aan weerszijden van; als er een keuze bevatten meer punten waarden verzadigen. OPMERKING: Indien nodig is het mogelijk om de experimentele condities zodanig dat het ligand van bestanden in twee experimentele concentratie, waarbij ligand oplosbaarheid beperkend veranderen. </li><li> Voeg 120 ul van de masterMeng acht putjes in een U-bodem plaat met 96 putjes, om als een reservoir voor gemakkelijke afgifte van de master mix. Gebruik een 8 kanaals pipet tot 18 pi afzien in een kolom van een PCR-plaat. Herhaal met vijf kolommen, in totaal 48 gevulde putjes geven in een 6 x 8 patroon op de plaat. </li><li> Voeg 20 ul van de ligand bestanden of het oplosmiddel afzonderlijke putjes in een U-bodem plaat met 96 putjes. Met een 8 kanaals pipet aspiratie 2 ui acht verschillende ligand bestanden (of oplosmiddel). Voeg deze aan een kolom van de PCR-plaat, dat was gevuld met master mix in stap 2.3. Herhaal dit met dezelfde acht ligand / oplosmiddel voorraden voor twee extra kolommen. Zuig 2 ui van de resterende acht ligand of oplosmiddel bestanden en voeg deze een vierde kolom van de plaat. Herhaal dit voor de twee andere kolommen. Dit drievoudige monsters geven voor alle 16 ligand en oplosmiddel monsters. </li><li> Plaats een qPCR afdichting over de plaat (zie stap 1.4). </li><li> Centrifugeer de plaat bij 500 xg gedurendetwee min. </li><li> Plaats de plaat in de qPCR instrument. Voer een thermische denaturatie met behulp van de parameters die zijn opgegeven in stap 1.6. </li><li> Aan het einde van het instrument lopen, klik op de &quot;Analyze&quot; knop op het scherm. Sla het resultaat bestand. </li><li> Open de Protein Thermal Shift software. Maak een nieuwe studie; in het tabblad eigenschappen, geef deze een naam, en in het tabblad Voorwaarden, detail van de liganden. </li><li> Ga naar het tabblad Experiment Files, en importeer de opgeslagen resultaten bestand (XXX.eds), en zet de inhoud van elk putje. OPMERKING: template bestanden zijn online beschikbaar op http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Ga naar het tabblad Analyse, en druk op de knop &quot;Analyseren&quot;. <ol><li> Kies het tabblad &quot;repliceert&quot; uit het menu aan de linkerkant van het scherm om de resultaten als triplicaten tonen. Beoordelen van de betrouwbaarheid van de gegevens op basis van hoe strak de triplo zijn. Should de triplo slechte reproduceerbaarheid, nauw onderzoekt de ruwe data. </li><li> Analyseer de gegevens zowel met de Boltzmann of derivaat methoden om de smelttemperatuur beoordelen. Selecteer de &quot;resultaten repliceren&quot; tab, en in de &quot;Repliceer resultaten plot&quot;, schakelt de &quot;Plot door:&quot; knop tussen &quot;Tm - Boltzmann&quot; en &quot;Tm - Afgeleide&quot;. Kies de methode die het grotere reproduceerbaarheid van het monster geeft. De resultaten voor verder onderzoek met Excel via het tabblad Export exporteren. OPMERKING: Voor monsters die meerdere overgangen vertonen, is het bijna altijd het beste om de Afgeleide methode in meerdere smelt-modus te gebruiken. De resultaten worden uitgevoerd in een tab afgebakend formaat. Het beste is om het geëxporteerde bestand in Excel te openen en direct op te slaan in Excel-formaat. </li><li> Herhaal het experiment ten minste tweemaal, met een herhaling op een afzonderlijke dag reproduceerbaarheid van de resultaten. Moet data-analyse (zie stap 3 hieronder)geven aan dat de waarde van Kd aanzienlijk verschillen van de oorspronkelijke raming weg ligand concentraties daarvan (zie stap 2.2) op een ruime waarden ongeveer Kd waarborgen. </li></ol> 3 Data Analysis aan de Dissociation Bepaal Constant onder Thermal Denaturatie <ol><li> Een tabel in Excel van de ligand concentraties en smelttemperatuur. </li><li> Open de GraphPad Prism software, en maak een XY tafel. Voer de gegevens via de kolom X voor de ligand concentraties en de kolom Y smelttemperatuur resultaten. OPMERKING: Een voorbeeld toont figuur 1B. Een script met vergelijkingen voorgeladen, en alternatieve instructies voor het gebruik van de SPSS statistische pakket, zijn online beschikbaar op http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> In het tabblad Analyse selecteert u de optie om te analyseren parameter veranderens (Ctrl + T). Om het juiste model in te voeren, selecteert u &quot;Nieuw&quot; en &quot;Maak een nieuwe formule&quot;. Steek de vergelijking in tabel 3 als &quot;Single website ligand binding&quot;. OPMERKING: Een voorbeeld van deze stappen is weergegeven in figuur 1C. Bij het gebruik van het script met vergelijkingen voorgeladen, kunnen de relevante vergelijking worden gericht gekozen uit de lijst in plaats van ingevoerd. Afleiding van deze vergelijking is te vinden in een appendix. </li><li> Selecteer de &quot;Regels voor Initial Waarden&quot; en voer de regels voor de oorspronkelijke waarden zoals beschreven in tabel 3. </li><li> Beperk de parameter P, als &quot;Constant gelijk&quot; en voert de uiteindelijke eiwitconcentratie (in dezelfde eenheden als de ligand in). </li><li> Selecteer OK om de analyses uit te voeren. OPMERKING: Een voorbeeld van deze stappen is weergegeven in figuur 1D. De grafische software produceert een figuur die de gegevens en de pasvorm van het model. Voorbeelden van teze analyses worden weergegeven in de representatieve gegevens. </li></ol> 4 Montage van gegevens aan Cooperative Modellen Om gegevens aanpassen aan een coöperatief model, kiezen tussen een eenvoudige coöperatieve model, of een model waarbij twee afzonderlijke dissociatie constanten worden gedefinieerd. De eerste benadering de voorkeur in het geval van negatieve coöperativiteit of als een eerste onderzoek. In principe is het beter in geval van positieve coöperativiteit model twee verschillende dissociatieconstanten 18. In dit geval kunnen modelleren doorgaan, uitgaande van een sequentiële binding van liganden, of onafhankelijke binding van liganden. <ol><li> Volg dezelfde eerste stappen als in protocol 3 Echter, bij stap 3.3, plaatst u een van de vergelijkingen in tabel 3 vermeld als &quot;Simple coöperatief model&quot;, &quot;Sequential binding van twee liganden&quot;, of &quot;Onafhankelijk binding van twee liganden&quot; 18. </li><li> Selecteer de relevante regels voor de beginwaardenaan ieder van deze vergelijkingen in tabel 3. </li><li> Onderzoek de aanpassing van het model aan de data. Mochten de gegevens past slecht, overweeg een ander model. NB: het is ook belangrijk om zorgvuldig de montage van de smelttemperatuur van de gegevens door de Protein Thermal Shift software (stap 2.9): soms is het nodig om de parameters te veranderen hier om de beste resultaten te krijgen. Een andere overweging is of het bereik van gegevenspunten is ideaal, en of er abnormale punten: ofwel een beperkte reeks gegevens aan weerszijden van Kd of een abnormale point (vooral bij de hoogste concentraties ligand), kunnen beïnvloeden de resultaten. </li><li> Herhaal het experiment ten minste tweemaal (zie stap 2.12) om reproduceerbaarheid te waarborgen. </li></ol> 5 Montage van gegevens naar Curves tonen Binary Verschuivingen in Melting Temperature Soms, in plaats van geleidelijk op ligand, eiwitten zijnwaargenomen dat een binaire respons, waarbij gebonden monster duidelijk gescheiden van ongebonden monster vast. Een voorbeeld wordt gegeven in de representatieve resultaten (figuur 4). In dit geval het aanbrengen van de smelttemperatuur zal geen goede pasvorm voor K d. <ol><li> De ruwe data output van de Protein Thermal Shift-software te exporteren. Voor elke temperatuurmeting punt, berekent het gemiddelde fluorescentie van de nul ligand en hoogste ligand concentraties. Een tabel met de resultaten van elk gegevenspunt naast deze. OPMERKING: De fout hier gemaakt is dan de fout in gemonteerde smelttemperaturen. </li><li> Open het SPSS statistisch pakket. Kopieer de temperaturen, de twee gemiddelde datasets, en gegevens voor elk experiment om een ​​data-venster in SPSS. In het tabblad variabele, stel de gemiddelde dataset voor geen ligand als &quot;laag&quot;, en de gemiddelde dataset voor de hoogste ligandconcentratie als &quot;high&quot;. </li><li> Download het syntax-bestand beschikbaaronline op http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selecteer &quot;Run → Run all&quot;. </li><li> Kopieer de verhouding gebonden resultaten naar een nieuwe Excel-werkmap, met de relevante ligand concentraties. </li><li> Open de Graphpad software, en het creëren van een XY tafel. Voer de gegevens via de kolom X voor de ligand concentraties en de kolom Y smelttemperatuur resultaten. In het tabblad analyse, selecteer &quot;change analyse parameters&quot;. Om het juiste model in te voeren, selecteert u &quot;Nieuw&quot; en &quot;Maak een nieuwe formule&quot;. Voer de vergelijking gegeven in tabel 3 vermeld als &quot;analyse van binaire verschuivingen in smelttemperatuur&quot;. </li><li> Selecteer het vakje &quot;Regels voor Initiële waarden&quot;, en regels voor de oorspronkelijke waarden in tabel 3 in te voeren. Beperk de parameter P, zoals &quot;Constant gelijk aan&quot; en voer de uiteindelijke concentratie van het eiwit (in dezelfde eenheden als de ligand wordt gegeven in). OPMERKING: voorbeelden van het invullen van deze vakken voor het protocol in hoofdstuk 3 zijn weergegeven in figuur 1C, D. </li><li> Als er een goede pasvorm, kunnen de resultaten verbeterd worden door extrapolatie van het verwachte resultaat oneindige ligand concentratie. Uit het model van het percentage gebonden bij elke ligand concentratie, onderzoekt de waarde van de hoogste waarde van ligand concentratie. Als dit 0,99 of hoger, verder onderzoek waarschijnlijk resultaten te verbeteren. </li><li> Als de hoeveelheid kleiner is dan 0,99, is een extra stap nodig te corrigeren voor het effect van de niet-gebonden eiwit in de hoogste concentratie ligand monster. In stap 5.2, schrijf de hoeveelheid ligand gebonden aan de hoogste ligand concentratiepunt (uit stap 5.7) in cel R2 (een andere cel kan worden gebruikt, en R2 vervangen passend in de vergelijking in tabel 3). Een extra kolom na het gemiddelde van de hoogste concentratie ligand resultaten. In de sparrenT-cel, kopieert u de formule in tabel 3 vermeld als &quot;Extrapolatie naar ligandconcentratie oneindig&quot;. Kopieer de volgende formule om de resterende cellen in deze kolom. NB: Deze berekening verwijdert het effect van niet-gebonden eiwit in de hoogste ligandconcentratie. Het verschil tussen de ligand vrij proteïne en de hoogste concentratie ligand wordt vermenigvuldigd met de reciproke van het percentage gebonden ligand bij de hoogste concentratie de verwachte verschil tussen volledig gebonden en ongebonden eiwit toestanden bij elke temperatuur onder verschaffen. Dit verschil wordt toegevoegd of afgetrokken van de ongebonden toestand het verwachte fluorescentie van volledig ligand gebonden eiwit geven. </li><li> Vervang de kolom voor maximale ligand concentratie in de SPSS datasheet met deze nieuwe kolom en herhaal de data fitting. OPMERKING: De stappen van 5,7-5,9 moet mogelijk worden herhaald als het model suggereert een verdere significante verandering in het aandeel gebonden aan de maximale ligand concentrati(indien dit het geval is, zou het waarschijnlijk ideaal zijn om het experiment met een hogere ligand concentratiepunt herhalen en). </li><li> Wanneer het eiwit toont een binaire verschuiving en toont coöperatief gedrag, de vergelijking voorgesteld in stap 5.5 worden gesubstitueerd die uit stap 4.1. De &quot;Top&quot; en &quot;Bottom&quot; parameters moeten vervangen door respectievelijk 1 en 0. </li><li> Herhaal het experiment ten minste tweemaal (zie stap 2.12) om reproduceerbaarheid te waarborgen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li>
<li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry%2C+thermal+shift+%28ThermoFluor%29+assay%2C+and+multiangle+or+static+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
<li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li>
<li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+our+mistakes%3A+the+%27unknown+knowns%27+in+fragment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li>
<li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li>
<li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li>
<li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase%3A+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li>
<li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li>
<li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation+revisited%3A+uses+and+misuses%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li>
<li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li>
<li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li>
<li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980(2003).</li>
<li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+WcbI%2C+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22IUCr+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li>
<li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li>
<li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans%3A+a+screening+test+for+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li>
<li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li>
<li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li>
<li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.

Differentiële scanning fluorimetrie heeft zijn kracht bewezen als een robuuste en veelzijdige methode voor het karakteriseren van eiwitten, en het identificeren van potentiële eiwitliganden. De goed gedocumenteerde successen in bespoedigen eiwitstabilisatie, drug discovery (vooral in minder goed gefinancierde laboratoria) en kristallisatie 10,23-25 ​​hebben het een aantrekkelijke methode voor de eerste screening van verbindingen gemaakt. Verbindingen toegevoegd aan eiwitten een duidelijke dosis-afhankelijke toename in de schijnbare smelttemperatuur 7,9. Er zijn echter weinig pogingen om de resultaten van deze experimenten tegen duidelijk bindingsconstanten op steun als verbindingen op hun affiniteit was bepaald. Hier presenteren we een werkwijze voor het systematisch bepalen van een schijnbare dissociatieconstante voor eiwitten in aanwezigheid van een ligand. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat DSF snel en stevig kunnen schattingen van de dissociatie constante vooreen eiwit-ligand combinatie. De waargenomen gegevens kunnen worden gemanipuleerd met commercieel beschikbare hulpmiddelen een snelle bepaling van Kd verschaffen, zonder aannames betreffende de waarschijnlijke waarde van parameters maken. De werkwijze heeft een belangrijk voordeel ten opzichte van een vergelijkbare methoden door spaarzaam in zowel eiwitten en doorlooptijd. De hier beschreven experiment verbruikt 0,13 mg eiwit per experiment (ongeveer 0,4 mg voor experimenten in drievoud herhaald). Dit steekt gunstig af bij isothermische titratie calorimetrie (ITC), waar een enkel experiment met een gemiddelde 40 kDa eiwit een vergelijkbaar bedrag verbruikt. De volledige reeks van experimenten die nodig zijn voor dit protocol zou rond 4 uur, inclusief voorbereiding verbruiken, voor een enkele set van experimenten. Nogmaals, dit is waarschijnlijk aanzienlijk sneller dan methoden zoals ITC of oppervlak plasmon resonantie, die, hoewel krachtige vereist vaak aanzienlijke optimalisatie beste data bereiken. Onze resultaten tonen aan dat er nog een eis om de ruwe gegevens zorgvuldig onderzoeken, de pasvorm van deze gegevens aan de smelttemperatuur te bepalen, en de pasvorm van de smelttemperatuur gegevens aan de dissociatieconstante te bepalen. Een eerste probleem is de vorm van de ruwe data die in het eiwit smelten. In sommige gevallen kan de vorm niet nader aan dat van figuur 1A. Veelvoorkomende problemen zijn lage temperatuurveranderingen op ligandbinding, hoge achtergrond fluorescentie, en ongewone meerdere overgangen in temperatuur. Lage temperatuur verschuivingen worden gezien op binding een aantal liganden. Voor deze werkwijze de meest kritische parameter is de fout in de Tm meting vergeleken met de temperatuurverandering. De data kan gewoonlijk redelijk zijn gemonteerd bij de standaardafwijking van drievoudige metingen niet meer dan 10% van de smelttemperatuur verschuiving tussen gebonden en volledig gebonden eiwit. Onze ervaring is dat wanneer dergelijke temperatuur verschuivingen zijn slechts 2 ° C, dit kan voldoende zijn voor de montage van de gegevens, als de individuele gegevens punten zijn zeer nauwkeurig. Een tweede probleem is ongewoon gevormde rondingen. Deze vaak verschillend voor vrij proteïne en ligand gebonden vormen, zoals de ligand binding beïnvloedt ontvouwing vormen van het eiwit. In die gevallen moet de gebruiker nagaan of de gegevens kunnen worden gebruikt met de juiste behandeling van de modellen worden gebruikt om de smelttemperatuur en de dissociatieconstante. Een ander veel voorkomend probleem is dat toevoeging van een cofactor aan het eiwit (bijvoorbeeld MgCl2 in ons voorbeeld met hexokinase) is vereist om de meest betrouwbare gegevens te verkrijgen. Onze ervaring is dat een zorgvuldige afweging van alle mogelijke factoren in het experiment in het stadium van het nemen beginwaarden essentieel voor het verkrijgen van de beste resultaten. Bovendien kunnen alternatieve behandelingen theoretische eigenschappen van deze gegevens 15,17 onthullen. Tenslotte is het niet ongewoon voor sommige eiwitten die contain native hydrofobe gebieden blootgesteld aan hoge achtergrond fluorescentie vertonen. Er zijn een aantal oplossingen voor deze problemen, die uitvoerig elders 6,9 hebben beoordeeld. In het bijzonder moet de gebruiker nagaan of de Boltzmann of derivaat modellen (bijvoorbeeld figuur 4) en bij gebruik van derivaten of meerdere smelten gemodelleerd moet worden gebruikt. De twee methoden van modelleren thermische ontvouwing verschillen dat de Boltzmann methode past bij de experimentele gegevens aan de Boltzmann vergelijking, uitgaande van bijvoorbeeld een sigmoïdale vorm van de curve ontvouwen. Daarentegen neemt de derivatenmethode de eerste afgeleide van de experimentele gegevens op elk punt (onderste paneel in figuur 1A), en beschouwt de smelttemperatuur tot het beginpunt aflopend derivaat. De afgeleide werkwijze retourneert algemeen een hogere smelttemperatuur van ongeveer 2-3 ° C. De meeste eiwitten zal terugkeren een meer consistenteresultaat (dat wil zeggen, de standaardfout van de smelttemperatuur van experimenten in drievoud lager) voor een van de twee methoden. Meestal is nauw verbonden met de precieze vorm van het eiwit ontvouwen curve en moet empirisch bepalen van de beste methode deelneemt. Wanneer de afgeleide model wordt gebruikt, is het ook belangrijk om te overwegen meerdere smelten events. Sommige gegevens duidelijk bewijs voor meerdere overgangen, en in deze gevallen de resultaten waarschijnlijk gemakkelijker te interpreteren wanneer deze meerdere smelten gebeurtenissen gemodelleerd. In het kader van dit protocol is het vaak het geval dat de toevoeging van ligand kan leiden tot een eiwit om van het hebben van meerdere smelten overgangen naar een overgang (bijvoorbeeld door het stabiliseren van de thermisch meest kwetsbare subdomein), of vice versa. We zouden dan ook pleiten dat de ruwe data samen alvorens te overwegen welke aanpak het beste te gebruiken zal worden onderzocht. Naar aanleiding van de modelling van de individuele smelttemperatuur, kunnen verdere problemen ontstaan ​​bij het aanbrengen van deze aan de in de sectie protocol modellen. Het is noodzakelijk om zorgvuldig de fit aan de dissociatie constante vergelijking met behulp van een logaritmische schaal, omdat deze analyse wijst vaak verschillen tussen de geobserveerde data en het model (e .g., Figuur 3). Terwijl de verkregen resultaten zijn algemeen robuust, zorg interpretatie biedt de mogelijkheid om betere resultaten te extraheren en de betekenis van de data. Een specifieke vraag van deze gegevens is de interpretatie die op eiwitten die cooperativiteit tonen, of meerdere bindende gebeurtenissen moeten worden geplaatst, in DSF. We hebben tot nu toe alleen waargenomen dit verschijnsel in eiwitten die naar verwachting meerdere specifieke binding gebeurtenissen (bijvoorbeeld WcbM een proteïne waarvan best homoloog is een multimeer 26, en dient als een multimeer van grootte-uitsluitingschromatografie [gegevens nietgetoond]). Het is helemaal niet duidelijk dat de negatieve cooperativiteit waargenomen in DSF denaturatie geeft aan dat het enzym uiteindelijk zal blijken negatieve cooperativiteit: plaats, dit kan een indicatie zijn van complexe binding die grondiger moeten worden onderzocht met behulp van een breder scala aan methoden. Dit suggereert ons echter dat meer uitgebreide studies van dergelijke eiwitten waarschijnlijk interessante effecten te identificeren. De waarden voor de dissociatieconstante deze methode algemeen van dezelfde orde als die van andere methoden, zoals isothermische titratie calorimetrie en oppervlakte plasmon resonantie. De absolute waarden liggen vaak hoger dan waargenomen met behulp van deze werkwijzen. Dit is ten dele een gevolg van het feit dat de dissociatieconstante is waargenomen bij de smelttemperatuur van het eiwit met ligand. Dit Kd algemeen hoger dan die bij fysiologische temperaturen. De dissociation constante is gerelateerd aan de temperatuur van de reactie door de vergelijkingen: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (C waarbij θ de standaard referentieconcentratie, Δ r G de Gibbs vrije energie verandering van het reactiemengsel, R de molaire gasconstante, Δ H is de enthalpie verandering in de reactie en Δ S de entropie verandering in het reactiemengsel .) Reacties met dissociatieconstanten in het meetbare bereik van deze werkwijze zal in het algemeen een negatieve Δ r G, en dus het effect van een stijging van de temperatuur op vergelijking [1] wordt de dissociatieconstante verhogen. Zowel de Δ H en Δ S termen die de Gibbs vrije energie vormen (vergelijking [2]) zijn temperature afhankelijke 27, en het effect op de dissociatie constante zal afhangen van de grootte en het teken van deze temperatuur afhankelijkheden, verschijnt interactie afhankelijk noodzakelijkerwijs. Bijgevolg is het niet onverwacht dat de dissociatie constanten bepaald volgens deze methode soms groter zijn dan die bepaald door werkwijzen die werken bij kamertemperatuur. Temperatuurafhankelijkheid is uiteraard ook een nadeel van vele andere methoden, die trachten het dissociatieconstante leveren bij temperaturen lager dan de fysiologische temperatuur. Een ander nadeel van de DSF werkwijze is dat het een label methode tegenstelling ITC. De fluorescerende label gebruikt (SYPRO Orange) is hydrofoob, en dus in sommige gevallen kan concurreren met de binding van hydrofobe liganden aan eiwitten. Derhalve is het waarschijnlijk dat in sommige gevallen, de dissociatieconstante verkregen worden opgespoten door concurrentie met het label. Voor de vergelijking van verschillende liganden, (het primaire gebruik vanDSF), de verschillen waarschijnlijk voldoende belangrijk om de classificatie van verbindingen beïnvloeden door affiniteit te zijn. Een mogelijk nadeel van deze methode is de detectiegrens kan worden bereikt. In beginsel zou het niet mogelijk zijn een waarde voor Kd die lager is dan 50% van de eiwitconcentratie, en zelfs waarden in dit gebied zullen waarschijnlijk van twijfelachtige nauwkeurigheid correct te meten. Hoewel de detectielimiet in dit marktsegment iets worden verlengd dat de concentraties van eiwit en kleurstof, de gevoeligheid van het instrument te voorkomen verdere verlaging eiwitconcentratie. Evenzo zal het boveneinde van de gevoeligheid wordt bepaald door de oplosbaarheid van het ligand. Een mathematisch robuuste schatting voor Kd verkrijgen is het meest belangrijk voor gegevens 90% van het eiwit in de ligand-gebonden vorm, die ligand concentraties vereist approximate te verkrijgenly tien keer K d (ervan uitgaande dat er geen cooperativiteit). De detectiegrens zal dus noodzakelijkerwijs een tiende van de oplosbaarheid van het ligand in de desbetreffende buffer. Dit betekent dat de detectielimieten van de werkwijze zal typisch liggen tussen 1 uM en 1 tot 100 mM, afhankelijk van het eiwit en ligand. Concluderend, differentiële scanning fluorimetrie is een veelzijdige techniek voor een groot aantal eiwitten. De hier voorgestelde methode is het mogelijk om snel en goedkoop bepalen van de affiniteit van een proteïne voor verschillende liganden. Dit heeft een groot potentieel voor toepassing in eiwitzuivering en stabilisering ophelderen van de functie of specificiteit van enzymen uit metagenomes en in drug discovery, vooral in kleine laboratoria.

Alle eiwitten binden, met verschillende affiniteiten, om een ​​breed scala aan andere moleculen uit eenvoudige ionen met andere grote macromoleculen. In veel gevallen, eiwitten binden aan kleine moleculen partners als onderdeel van de normale functie (bijvoorbeeld een kinase binding aan ATP). Andere interacties kunnen los van functie, maar experimenteel zijn nuttig als hulpmiddelen (bijvoorbeeld kleine moleculen die eiwitten stabiliseren verbeteren kristallisatie succes of het behoud eiwitten in oplossing); terwijl kleine moleculen die binden aan actieve plaatsen en allosterische gebieden van eiwitten kunnen fungeren als remmers, enzovoort moduleren de activiteit van enzymen. Er zijn diverse technieken die kunnen worden gebruikt om de affiniteit van eiwitten voor partner moleculen te bepalen. Isothermische titratie calorimetrie 1 wordt algemeen beschouwd als een &quot;gouden standaard&quot;, omdat het rijke informatie over reacties is labelvrije en heeft beperkte kansen eenrtifacts van het experiment. Ondanks recente verbeteringen in de gevoeligheid van de instrumentatie en automatisering van experimentele set-up, is het nog steeds relatief duur qua eiwitbehoefte is hoogstens een lage tot middelgrote doorvoer en het best bij interacties met matige tot hoge affiniteiten (10 nM tot 100 uM K d) 2. Andere label-free methoden zoals oppervlakteplasmonresonantie of tweelaags interferometrie 3 aanbieding hoger doorzet, en de gevoeligheid hebben bereikt om kleinere moleculen zo laag als 100 Da detecteren. Echter, high throughput instrumenten voor deze methoden zijn relatief duur, alleen gerechtvaardigd indien er een continue doorstroming van relevante projecten zal zijn, en dus waarschijnlijk ontoegankelijk voor veel academische laboratoria. Differentiële scanning fluorimetrie (DSF of thermofluor) werd eerst beschreven in 2001 4 als een werkwijze voor geneesmiddelenonderzoek. In deze method worden eiwitten geïncubeerd met een fluorescente kleurstof (aanvankelijk naftaleen-sulfonzuur kleurstoffen gebruikt), waarvan de fluorescentie na binding aan de hydrofobe gebieden van het eiwit verandert. De eiwit-kleurstof monster wordt vervolgens verwarmd en de fluorescentie gecontroleerd als de hitte stijgt. Het ontvouwen van het eiwit en blootstelling van hydrofobe delen van het eiwit, geeft aanleiding tot een karakteristiek patroon in de fluorescentie als een functie van de temperatuur (Figuur 1A). Het experiment kan worden uitgevoerd in kleine volumes bij commerciële kwantitatieve PCR instrument, en dus in een enkel experiment, kan een groot aantal monsters tegelijkertijd getest (gewoonlijk 48, 96 of 384 monsters, afhankelijk van het model instrument). Experimenten kan meestal worden uitgevoerd in ongeveer een uur, de mogelijkheid biedt high throughput analyse van de monsters 5. Verdere verbeteringen in de methodologie hebben de goedkeuring van kleurstoffen gezien met betere spectrale eigenschappen 6,7 </sup&gt;, generieke instrumenten voor data-analyse, en stelde protocollen voor de eerste screening 8,9. Het aantal toepassingen van de methode is uitgebreid, met een bijzondere aandacht voor de ontwikkeling optimale omstandigheden voor de bereiding en de opslag van eiwitten 10, en op het identificeren van potentiële bindende partners om te helpen kristallisatie 11. De relatief hoge doorvoersnelheid van de werkwijze relatief lage kosten in proteïne (-2 ug per reactie), en de toepasbaarheid te bestuderen zwak bindende moleculen heeft DSF erg waardevol hulpmiddel fragment based drug design, vooral in een academische context 12-14. Ondanks de brede toepassing van DSF aan de studie eiwit-ligand interacties zijn enkele studies beschreven bepaling van dissociatieconstanten van deze studies. Echter, deze hebben de neiging om gedetailleerde vergelijkingen die het ontvouwen van het eiwit, met een aantal parameters die de schaarse gegevens of in sommige gevallen e moet voorzien producerenstimated 7,15-17. Deze methoden zijn van bijzonder belang in moeilijke gevallen, zoals strak bindende verbindingen, of eiwitten tonen van ongewone overgangen. Echter, voor veel laboratoria, deze gedetailleerde analyses zijn te omslachtig voor routinematig gebruik. Daarom alternatieve behandelingen voorgesteld voor verschillende scenario&#39;s en tonen hoe deze kan worden gebruikt om gegevens uit verschillende eiwit-ligand interacties passen. Onze werkwijze gebruikt StepOne qPCR instrument waarvoor maat gegevensanalyse software beschikbaar; Hoewel dit versnelt de data analyse kan resultaten van andere instrumenten worden verwerkt met eerder gepubliceerde werkwijzen 9 en dezelfde downstream analyse kan worden uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>StepOne real time PCR instrument</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF kan worden uitgevoerd met veel andere instrumenten. Het StepOne instrument heeft zeer handige software voor data-analyse.</td></tr><tr><td>Protein thermal shift software v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast optical 48-well plates&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optical sealing tape&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad part no. 223-9444 is een alternatieve leverancier</td></tr><tr><td>U-bottomed 96-well plates</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>Voor een leverancier met een kleiner volume, gebruik Sigma part no. S5692</td></tr><tr><td>SPSS statistics version 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Andere statistiekpakketten zullen vergelijkbare functionaliteit bieden</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Andere statistiekpakketten zullen vergelijkbare functionaliteit bieden</td></tr><tr><td>Hand applicator (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken differential scanning fluorimetrie

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Een breed scala aan werkwijzen zijn beschikbaar voor het bepalen van de dissociatieconstante tussen een eiwit en interactie kleine moleculen. De meeste van deze toegang tot gespecialiseerde apparatuur vereisen vaak een zekere mate van deskundigheid betrouwbare experimenten en effectief te analyseren. Differentiële scanning fluorimetrie (DSF) wordt steeds meer gebruikt als een robuuste methode voor de eerste screening van eiwitten voor interactie kleine moleculen, zowel voor het identificeren van fysiologische partners of voor hit ontdekking. Deze techniek heeft het voordeel dat het slechts een PCR machine voor kwantitatieve PCR, en dus geschikte instrumentatie is in de meeste organen vereist; een groot scala aan protocollen zijn reeds beschikbaar; en er sterke precedenten in de literatuur voor meerdere doeleinden van de werkwijze. Laatste werk voorgesteld verscheidene berekeningswijze dissociatieconstanten van DSF data, maar die mathematisch veeleisend. Hier, we demonstrate een werkwijze voor het schatten van dissociatieconstanten van een matige hoeveelheid DSF experimentele gegevens. Deze gegevens kunnen doorgaans worden verzameld en in een enkele dag geanalyseerd. We zien hoe verschillende modellen kunnen worden gebruikt om gegevens vanuit eenvoudige bindinggebeurtenissen past en wanneer coöperatieve binding of onafhankelijke bindingsplaatsen aanwezig zijn. Tenslotte geven we een voorbeeld van data-analyse in een geval waarin standaardmodellen niet gelden. Deze methoden worden geïllustreerd met gegevens die zijn verzameld op commercieel beschikbare controle-eiwitten, en twee eiwitten uit ons onderzoeksprogramma. Over het algemeen, onze methode biedt een eenvoudige manier voor onderzoekers om snel krijgen meer inzicht in eiwit-ligand interacties met behulp van DSF.

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dissociatieconstante voor een eiwit-ligandeninteractie te schatten. Dit wordt bereikt door eerst mengsels van het eiwit met verschillende concentraties van de ligand samen met een indicatorkleurstof te bereiden. De tweede stap is om deze monsters te verwarmen terwijl de fluorescentie van de indicator wordt geregistreerd om het ontvouwen van het eiwit te volgen.Vervolgens worden de eiwit-ontvouwingscurven omgezet in een reeks smelttemperaturen. De laatste stap is om deze gegevens aan een geschikt model aan te passen om de dissociatieconstante te schatten. Uiteindelijk wordt differentiële scanning fluorometrie gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn liganden beter te begrijpen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals isotherme, titratie, calorimetrie en oppervlakteplasmaresonantie is dat deze methode binnen enkele uren kan worden voltooid met behulp van slechts matige hoeveelheden monster in een instrument dat al in de meeste instituten beschikbaar is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwitchemie, zoals de affiniteit van liganden voor eiwitten en de relatieve sterkte van interacties. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de keuze van de te gebruiken monsters en de analyse van de gegevens beide moeilijk kunnen zijn.Voordat u met deze procedure begint, bereidt u de volgende oplossingen voor. Een mengsel dat de in deze tabel gedetailleerde reagentia bevat en voorraden van de geïnteresseerde ligand op de hoogste beschikbare concentratie, evenals zes tienvoudige verdunningen van deze concentratie. Als er een geschatte dissociatieconstante bekend is uit eerdere gegevens, bereidt u ten minste twee concentraties boven en onder de kd voor.Een voorbeeldtabel wordt hier getoond. Pipetteer 18 microliter van het mengsel in elk van de acht putjes. In de A-Q-P-C-R-plaat voegt u twee microliter oplosmiddel toe aan de eerste put en aan elk van de overige zeven putjes, voegt u twee microliter van elk lid van de ligandverdunningsreeks toe.Plaats de A-Q-P-C-R-afdichting over de plaat om een goede afdichting van de plaat te verkrijgen. Plaats een handapplicator in het midden van de plaat, strijk de afdichting naar één kant en herhaal dit dan aan de andere helft van de plaat. Centrifugeer de plaat bij 500 keer G gedurende twee minuten om luchtbellen te verwijderen.Plaats vervolgens de plaat in een stap één QPCR-instrument. Selecteer de smeltcurve-optie, de filters en kies de snelle ramp-snelheid. Voer een thermische denaturatie uit aan het einde van de instrumentrun.Klik op de analyse-knop op het scherm. Sla het resultaatbestand op. Open de eiwitthermische verschuivingssoftware.Maak een nieuwe studie in het eigenschappentabblad. Geef het een naam en detailleer in het tabblad voorwaarden de liganden. Ga naar het tabblad experimentbestanden en importeer het opgeslagen resultatenbestand.Stel de inhoud van elk. Putje. Ga naar het analysetabblad en druk op de analyse-knop om de resultaten te analyseren. Controleer of het eiwit in aanwezigheid van alleen oplosmiddel een resultaat geeft dat vergelijkbaar is met dat in deze figuur wordt getoond.Onderzoek vervolgens de smelttemperaturen die in de resultaten in de replicaatpijn worden waargenomen. Zorg ervoor dat dit een duidelijke toename van de smelttemperatuur laat zien met toenemende ligandconcentratie. Deze gegevens zullen worden gebruikt om een ​​benadeerde waarde voor de dissociatieconstante te verstrekken zoals beschreven in het bijbehorende artikel.Deze oplossingen zijn vereist voor de procedure om de dissociatieconstante te bepalen, een mastermix zoals beschreven in deze tabel en voorraden van de ligand in 15 verschillende concentraties, die tienvoudig zullen worden verdund. In het laatste experiment. Bevat idealiter ligandconcentraties, ten minste twee ordes van grootte boven en onder de geschatte kd, en centreer de concentraties op de geschatte kd.Een voorbeeldverdunningsreeks wordt hier getoond. Richt u op zeven van de punten binnen een orde van grootte van de geschatte KD met nog eens vier punten aan beide kanten hiervan. Als er een keuze is, neem dan meer punten op waarden die verzadigend zijn.Voeg 120 microliter van de mastermix toe aan elk van de acht putjes in een U-bodem 96-putjesplaat om als reservoir te dienen voor gemakkelijk doseren van de mastermix. Gebruik vervolgens een achtkanaals pipet om 18 microliter van de mastermix in één kolom van een PCR-plaat te doseren. Herhaal dit voor nog eens vijf kolommen om een ​​totaal van 48 gevulde putjes te geven in een zes bij acht patroon op de plaat.Voeg vervolgens 20 microliter van de ligandstammen of het oplosmiddel toe aan elk van de acht putjes. In een andere U-bodem 96-putjesplaat. Gebruik een achtkanaals pipet om twee microliter van acht verschillende ligandvoorraden of oplosmiddelen te aspireren en voeg deze toe aan één kolom van de PCR-plaat die was gevuld met de mastermix. Herhaal dit met dezelfde acht ligand- of oplosmiddelvoorraden.Voor nog twee kolommen aspireert u twee microliter van de resterende acht ligand- of oplosmiddelvoorraden en voegt u deze toe aan een vierde kolom in de plaat. Herhaal dit voor nog twee kolommen. Dit geeft driemaal monsters voor alle 16 ligand- en oplosmiddelmonsters.Plaats de A-Q-P-C-R-afdichting over de plaat. Centrifugeer de plaat bij 500 keer G gedurende twee minuten. Plaats de plaat in het QPCR-instrument en voer een thermische denaturatie uit met behulp van de eerder opgegeven parameters aan het einde van de instrumentrun.Klik op de analyse-knop op het scherm. Sla het resultaatbestand op. Open de eiwitthermische verschuivingssoftware.Maak een nieuwe studie in het eigenschappentabblad. Geef dit een naam en detailleer in het tabblad voorwaarden de liganden. Ga naar het tabblad experimentbestanden, importeer het opgeslagen resultatenbestand en stel de inhoud van elk.Putje. Ga naar het analysetabblad en druk op de analyse-knop. Kies de replicaat-tab uit het menu aan de linkerkant van het

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

This video demonstrates differential scanning calorimetry — a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Eiwit interacties vormen de kern van de functie van een cel. Calorimetrische en spectroscopische technieken worden gewoonlijk gebruikt om ze te karakteriseren. Hier beschrijven we fluorescentie anisotropie als middel om de interactie tussen het eiwit gemuteerd in de Shwachman-Diamond Syndroom (SBDS) en elongatiefactor-1 achtige GTPase (EFL1) te bestuderen.

Fluorescentie anisotropie als een instrument om eiwit-eiwit interacties te bestuderen

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

De differentiële radiale capillaire werking van Ligand Assay (DRaCALA) kan worden gebruikt om kleine ligandbindende eiwitten van een organisme te identificeren met behulp van een ORFeome-bibliotheek.

Identificatie van de bindende eiwitten van kleine liganden met de differentiële radiale capillaire werking van ligandtest (DRaCALA)

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.

Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie

Dit protocol benadrukt de principes en praktische toepassingen van Fase en differentieel interferentie contrast (DIC)...

Phase Contrast en differentieel interferentie contrast (DIC) Microscopie

Leer differentiële scanning fluorimetrie voor het bepalen van eiwit-ligand interacties en dissociatieconstanten. Deze methode biedt een snelle en betrouwbare analyse met matige hoeveelheden monster.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Meer video's verkennen