Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

Het algemene doel van deze procedure is om de dissociatieconstante voor een eiwit-ligandeninteractie te schatten. Dit wordt bereikt door eerst mengsels van het eiwit met verschillende concentraties van de ligand samen met een indicatorkleurstof te bereiden. De tweede stap is om deze monsters te verwarmen terwijl de fluorescentie van de indicator wordt geregistreerd om het ontvouwen van het eiwit te volgen.

Vervolgens worden de eiwit-ontvouwingscurven omgezet in een reeks smelttemperaturen. De laatste stap is om deze gegevens aan een geschikt model aan te passen om de dissociatieconstante te schatten. Uiteindelijk wordt differentiële scanning fluorometrie gebruikt om de interactie van een eiwit met zijn liganden beter te begrijpen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals isotherme, titratie, calorimetrie en oppervlakteplasmaresonantie is dat deze methode binnen enkele uren kan worden voltooid met behulp van slechts matige hoeveelheden monster in een instrument dat al in de meeste instituten beschikbaar is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van eiwitchemie, zoals de affiniteit van liganden voor eiwitten en de relatieve sterkte van interacties. Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de keuze van de te gebruiken monsters en de analyse van de gegevens beide moeilijk kunnen zijn.

Voordat u met deze procedure begint, bereidt u de volgende oplossingen voor. Een mengsel dat de in deze tabel gedetailleerde reagentia bevat en voorraden van de geïnteresseerde ligand op de hoogste beschikbare concentratie, evenals zes tienvoudige verdunningen van deze concentratie. Als er een geschatte dissociatieconstante bekend is uit eerdere gegevens, bereidt u ten minste twee concentraties boven en onder de kd voor.

Een voorbeeldtabel wordt hier getoond. Pipetteer 18 microliter van het mengsel in elk van de acht putjes. In de A-Q-P-C-R-plaat voegt u twee microliter oplosmiddel toe aan de eerste put en aan elk van de overige zeven putjes, voegt u twee microliter van elk lid van de ligandverdunningsreeks toe.

Plaats de A-Q-P-C-R-afdichting over de plaat om een goede afdichting van de plaat te verkrijgen. Plaats een handapplicator in het midden van de plaat, strijk de afdichting naar één kant en herhaal dit dan aan de andere helft van de plaat. Centrifugeer de plaat bij 500 keer G gedurende twee minuten om luchtbellen te verwijderen.

Plaats vervolgens de plaat in een stap één QPCR-instrument. Selecteer de smeltcurve-optie, de filters en kies de snelle ramp-snelheid. Voer een thermische denaturatie uit aan het einde van de instrumentrun.

Klik op de analyse-knop op het scherm. Sla het resultaatbestand op. Open de eiwitthermische verschuivingssoftware.

Maak een nieuwe studie in het eigenschappentabblad. Geef het een naam en detailleer in het tabblad voorwaarden de liganden. Ga naar het tabblad experimentbestanden en importeer het opgeslagen resultatenbestand.

Stel de inhoud van elk. Putje. Ga naar het analysetabblad en druk op de analyse-knop om de resultaten te analyseren. Controleer of het eiwit in aanwezigheid van alleen oplosmiddel een resultaat geeft dat vergelijkbaar is met dat in deze figuur wordt getoond.

Onderzoek vervolgens de smelttemperaturen die in de resultaten in de replicaatpijn worden waargenomen. Zorg ervoor dat dit een duidelijke toename van de smelttemperatuur laat zien met toenemende ligandconcentratie. Deze gegevens zullen worden gebruikt om een ​​benadeerde waarde voor de dissociatieconstante te verstrekken zoals beschreven in het bijbehorende artikel.

Deze oplossingen zijn vereist voor de procedure om de dissociatieconstante te bepalen, een mastermix zoals beschreven in deze tabel en voorraden van de ligand in 15 verschillende concentraties, die tienvoudig zullen worden verdund. In het laatste experiment. Bevat idealiter ligandconcentraties, ten minste twee ordes van grootte boven en onder de geschatte kd, en centreer de concentraties op de geschatte kd.

Een voorbeeldverdunningsreeks wordt hier getoond. Richt u op zeven van de punten binnen een orde van grootte van de geschatte KD met nog eens vier punten aan beide kanten hiervan. Als er een keuze is, neem dan meer punten op waarden die verzadigend zijn.

Voeg 120 microliter van de mastermix toe aan elk van de acht putjes in een U-bodem 96-putjesplaat om als reservoir te dienen voor gemakkelijk doseren van de mastermix. Gebruik vervolgens een achtkanaals pipet om 18 microliter van de mastermix in één kolom van een PCR-plaat te doseren. Herhaal dit voor nog eens vijf kolommen om een ​​totaal van 48 gevulde putjes te geven in een zes bij acht patroon op de plaat.

Voeg vervolgens 20 microliter van de ligandstammen of het oplosmiddel toe aan elk van de acht putjes. In een andere U-bodem 96-putjesplaat. Gebruik een achtkanaals pipet om twee microliter van acht verschillende ligandvoorraden of oplosmiddelen te aspireren en voeg deze toe aan één kolom van de PCR-plaat die was gevuld met de mastermix. Herhaal dit met dezelfde acht ligand- of oplosmiddelvoorraden.

Voor nog twee kolommen aspireert u twee microliter van de resterende acht ligand- of oplosmiddelvoorraden en voegt u deze toe aan een vierde kolom in de plaat. Herhaal dit voor nog twee kolommen. Dit geeft driemaal monsters voor alle 16 ligand- en oplosmiddelmonsters.

Plaats de A-Q-P-C-R-afdichting over de plaat. Centrifugeer de plaat bij 500 keer G gedurende twee minuten. Plaats de plaat in het QPCR-instrument en voer een thermische denaturatie uit met behulp van de eerder opgegeven parameters aan het einde van de instrumentrun.

Klik op de analyse-knop op het scherm. Sla het resultaatbestand op. Open de eiwitthermische verschuivingssoftware.

Maak een nieuwe studie in het eigenschappentabblad. Geef dit een naam en detailleer in het tabblad voorwaarden de liganden. Ga naar het tabblad experimentbestanden, importeer het opgeslagen resultatenbestand en stel de inhoud van elk.

Putje. Ga naar het analysetabblad en druk op de analyse-knop. Kies de replicaat-tab uit het menu aan de linkerkant van het