Name: Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer hoe u buisvormige membraannetwerken analyseert in boezem- en kamerhartspiercellen van muizen. Deze methode combineert celisolatie, fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk ontving ondersteuning via Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojecten A05 en B05 voor S.E.L.) en KFO 155 (subproject 4 voor S.E.L.), een Halbach Foundation-award voor S.E.L. die E.W. ondersteunt; een subsidie van de Duitse Cardiologische Vereniging voor S.B.; en een DAAD-uitwisselingsprogramma dat T.K. ondersteunt als bezoeker aan de Universiteit van Maryland. Het onderzoek dat tot deze resultaten heeft geleid, heeft financiering ontvangen uit het Zevende Kaderprogramma van de Europese Gemeenschap FP7/2007-2013 onder subsidieovereenkomst nr. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (voor S.E.L.). S.E.L. is een hoofdonderzoeker van het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK).

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat.

Hoewel cardiale myocyten al decennialang zijn geïsoleerd en bestudeerd32, concludeerde een recente review dat consistente isolaties van hoge kwaliteit van myocyten nog steeds een uitdaging zijn27. Dit weerspiegelt relatief complexe protocollen voor het isoleren van primaire cardiale myocyten ten opzichte van een gebrek aan gemeenschappelijke standaard benaderingen, gedeelde metadata en transparante documentatie over de kwaliteit van cellen. Protocollen voor celisolatie worden meestal aangepast door individuele groepen, produceren variabele resultaten van celisolaten, zijn afhankelijk van individuele modelinstellingen (bijv. soort, leeftijd, bestaande hartaandoeningen) en worden meestal aangepast voor specifieke experimentele omstandigheden. Binnen de context van de kwantitatieve TATS membraanstudies en protocollen die hier worden gepresenteerd, betreft een essentieel niveau van kwaliteitsbeoordeling en documentatie de confocale of superresolutie microscopie van individuele celmembraanstructuren die vatbaar zijn voor metabolische en isolatieprotocolafhankelijke veranderingen, zowel in AM als in VM. Belangrijk is dat, zelfs als hoge opbrengsten van celisolaten op gezonde intacte myocyten duiden, onderzoekers elke individuele cel zorgvuldig moeten documenteren en kritisch moeten beoordelen op morfologische criteria van oppervlakte en TATS-membraanintegriteit versus niet-specifiek schade door isolatieprocedures versus specifieke veranderingen door verschillende soorten interventies in vergelijking met controleomstandigheden. Een belangrijke variabele tijdens de isolatie van hartcellen is de specifieke activiteit van een bepaalde collagenase batch. Om een nieuwe batch collagenase te selecteren, moet de enzymatische activiteit van verschillende collagenasemonsters tegen elkaar worden getest door de opbrengst en kwaliteit van cardiale myocyten te evalueren, en volgens de instructies van de fabrikant. Idealiter wordt een nieuwe batch collagenase geïdentificeerd met een collagenase-activiteit die vergelijkbaar is met eerder succesvol gebruikte batches (voor uitgebreide evaluatie van mogelijke enzymactiviteiten verwijzen naar de “collagenase batch selectietool” in de tabel met materialen en methoden). Gezamenlijk afhankelijk zijn kwantitatieve benaderingen van TATS-membraanvisualisatie van de kwaliteit van celisolatie en omgekeerd moeten hartcelisolaties die leiden tot onspecifieke membraanschade, zoals gedocumenteerd door TATS-microscopie, een kritische herziening en correctie van de isolatieprocedures veroorzaken. Aangezien de kwaliteit van celisolatie en TATS-membraanvisualisatie en -kwantificering intrinsiek met elkaar verbonden zijn, bestrijken de protocollen die in dit artikel worden besproken alle belangrijke aspecten als een continue strategie.
Een extra uitdaging en veelvoorkomend probleem in hartstudies, celschade en/of celverlies, treedt op als gevolg van metabolisch belastende interventies, bijv. na een hartinfarct9, maar moet worden beoordeeld tegen potentiële onbedoelde schade, bijv. na een onopgemerkte luchtembolie tijdens celisolatie. Isolatie van cardiale myocyten uit zieke harten kan leiden tot aanvullende, significante celverliezen en verminderde celopbrengsten. Daarom kan vergelijking van het totale aantal geïsoleerde intacte cellen tussen controle- en zieke harten zinvol zijn als celisolatie en -telling consistent worden toegepast via gestandaardiseerde protocollen. Bijgevolg is het van cruciaal belang om de celintegriteit te beoordelen aan de hand van een geschikte controlegroep, die de best mogelijke kwaliteit van myocytencelisolatie weerspiegelt. Belangrijk is dat de kwaliteit van individuele cellen en levende celmicroscopie van gezonde versus zieke versus myocyten die onbedoeld zijn beschadigd door de isolatieprocedure de analyse van TATS-membraannetwerken aanzienlijk kunnen beïnvloeden. De hier gepresenteerde protocollen benadrukken daarom de integriteit en stabiliteit van fysiologische membraancomponenten tijdens celisolatie en levende celmicroscopie van intacte membranen. De volledige workflow is ontworpen als een continue strategie om intacte TATS-membraancomponenten te bereiken en te behouden, terwijl beschadigde cellen worden uitgesloten, omdat deze isolatieafhankelijke membraanartefacten zoals verbroken membraanbuisjes, membraanblaasjes en veranderde TATS-netwerken onterecht onder controleomstandigheden zullen vertonen en verdere kwantitatieve analyse zullen beïnvloeden. Vice versa zijn dezelfde strategieën cruciaal voor interventiestudies met het potentieel om TATS-membranen te verstoren, die kritisch afhankelijk zijn van zinvolle vergelijkingscontroles tussen echte gezonde versus echte zieke cellen met TATS-membraanveranderingen.
Daarnaast richten we ons op procedures om de technisch veel uitdagendere isolatie van AM-cellen te bereiken. Ondanks vooruitgang en verbeterde protocollen, is het belangrijk om te benadrukken dat het niet triviaal is om hoogwaardige celisolaties van VM's te reproduceren en zelfs minder betrouwbaar voor AM's. Dit komt door de algemeen lagere opbrengst van AM-cellen waarbij zelfs kleine fouten of variaties tijdens celisolatie kunnen leiden tot volledig falen van AM-celisolatie, terwijl een lichte mate van VM-celbeschadiging minder duidelijk kan zijn in celsuspensie vanwege relatief hoge celaantallen vergeleken met AM. Aangezien AM-cellen na isolatie gekromd kunnen raken, kan analyse via meerdere ROI's voordelig zijn zoals beschreven onder stap 4.3. Na een gedetailleerd proces van celisolatie stappen, bieden we een protocol voor directe integrale membraankleuring en confocale of STED superresolutie beeldvorming van TATS-netwerken voor zowel VM's als AM's. Deze protocollen maken zowel kwantitatieve analyse als differentiatie van selecte componenten van TATS-membranen mogelijk via eerder gevestigde parameters. In vergelijking met VM's, zijn de 3D-organisatie en functionele gedragingen van het atriale TATS-netwerk in AM's momenteel minder begrepen.
De procedures om TATS-membranen in levende cellen te beeldvormen (stappen 3.1 tot 3.7) zijn ontwikkeld met commerciële confocale (Tabel met materialen/apparatuur) en op maat gemaakte STED-fluorescentiemicroscopen9. Om de microscoopinstellingen te optimaliseren voor fluorescente beeldgeneratie en kwantitatieve TATS-analyse, zijn de volgende punten van algemeen belang:
<ul>
	<li>Objectief 
	Om kleine details van TATS-membra

In gezonde dwarsgestreepte spiercellen, buisvormige membraan structuur met &quot;dwars&quot; oriëntaties (T-tubuli) loodrecht op de hoofdleiding cel as zijn overvloedig. Dientengevolge hebben T-tubuli gekenmerkt als continue uitbreidingen van de spiercel main &quot;lateraal&quot; oppervlak membraan (sarcolemma), die diep doordringen in de cytosol naar het celcentrum. De fysiologische rol van T-tubuli continu met het buitenoppervlak membraan snelle elektrische koppeling van externe intracellulaire compartimenten gevormd door SER organel contact domeinen gehele relatief grote hartspiercel volume nanometrische nabijheid koppeling van voltage-geactiveerde L-Ca2 + kanalen (Cav1.2) naar binnen (I Ca) activeren van aangrenzende ryanodinereceptor (RyR2) SER Ca 2 + releases. In hartspiercellen (VM&#39;s), de niet-continue membraan contacten (&quot;knooppunten&quot;) tussen de junctionele SER domeinen en T-tubules wordt gedacht dat duizenden individuele intracellulaire Ca2 + afgifte nanodomains controle in elke cel 1. Voor elk contact domein, de naast elkaar geplaatste gedeelten membraan elk van de T-tubuli en perifere (junction) SER ongeveer 15 nm dicht bij elkaar, dus gedefinieerd als nanodomain. Daarbij worden zeer kleine individuele cytoplasma deelruimten gescheiden die quasi-cel-autonome compartiment gedrag mogelijk te maken. Bij een inkomende actiepotentiaal activeert Cav1.2 kanalen in de T-tubuli van VM&#39;s, een relatief kleine Ca 2 + naar binnen lopende zal snel toenemen de deelruimte Ca 2 +-concentratie [Ca 2 +] S in de attoliter formaat nanodomain 1. Vervolgens wordt de [Ca 2 +] S toename activeert Ca 2 + -Gated ryanodine receptoren (RyR2) binnen nanometer nabijheid in het naast elkaar SER membraan knooppunt, en deze koppeling proces gebeurt in alle elektrisch paard myocyte nanodomains. RyR2s voorkomen als dichte multikanaals clusters voor een stoïchiometrie van 1 Cav1.2 kanaal 5-10 RyR2 kanalen 2. Aangezien de SER naar cytosol [Ca2 +] gradiënt zeer steil (10 verhouding 4: 1) en RyR2s gefunctioneerd als high-geleiding Ca2 + afgifte kanalen functioneel gekoppelde clusters, RyR2 activatie resulteert in een kwantitatief grote Ca2 + los stroom van T-tubulus gekoppeld junctional SER domeinen toenemende lokale deelruimte [Ca 2 +] S tot 100 uM of hoger binnen 1-2 msec 3,4. Dit cardiale signaal amplificatie gedrag wordt ook wel Ca2 + geïnduceerde Ca2 + afgifte (CICR). Samen genomen, de T-tubuli zijn essentieel membraan structuur die snel activeren Ca 2 + vrijlating signalen via junctional nanodomain SER contacten en cel-breed CKP tijdens excitatie-contractie (EC) koppeling. Naast T-tubuli axiaal buisjes (A-tubules) met een significant verschillende oriëntatie parallel aan de hoofd (langs) as cellen werden gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM), confocale en 2-foton microscopie studies. Bijvoorbeeld, een cel gehele continue rooster van A-tubules tussen myofibrils verbonden met T-tubuli dichtbij sarcomeer Z-lijnen werd getoond door extracellulaire tracers en EM beeldvorming van vaste cavia VM 5. Met behulp van extracellulaire-dextran gekoppeld fluoresceïneverkleuring en live 2-foton beeldvorming van rat VM&#39;s, werd een complex reticular 3D tubulus netwerk gevisualiseerd bestaande uit ~ 60% T-tubuli en ~ 40% A-buisjes 6. Deze studie niet alleen geleid tot 3D visualisatie van overvloedige A-tubules, maar ook tot het besef dat snijden voor EM visualisatie is inherent beperkt de analyse van complexe en dynamische membraan netwerken zoals de dwarse coaxiale tubulus systeem (TATS). Bijgevolg confocale live cell imaging van TATS membranen direct gekleurd met di-8-ANNEPS werd ontwikkeld. Als levende cellenTATS netwerken worden geanalyseerd door Fourier transformatie, wordt de regelmatige verschijning van T-tubulus componenten in de ruimte in de buurt van sarcomeer Z-lijnen weerspiegeld door het ensemble vermogensspectrum van een regio van dwarsgestreepte signalen 7. Deze indirecte analyse strategie werd gebruikt om cel-grote regionale veranderingen in TATS component regelmatigheid detecteren ziektemodellen 7. Zo shRNA gemedieerde junctophilin-2 afbraakprijzen veroorzaakt hartfalen en de isovorm specifiek eiwit tekort resulteerde in T-tubulus reorganisatie met nanodomain Ca 2 + vrijlating dysfunctie 8. We hebben onlangs uitgebreid de analyse van TATS membraan netwerken door middel van directe kwantitatieve benaderingen en verder door levende cellen superresolutiemicroscopie van individuele TATS componenten in de muis VM&#39;s met behulp van gestimuleerde emissie uitputting (STED) nanoscopie 9. Nanometrische beeldresolutie toegestaan ​​voor een directe analyse van kleinere individuele TATS componenten, die een 50:50 verdeling van transversale benaderingversus axiale tubulus oriëntaties, kwantitatief bevestigen twee overvloedige nog verschillend georiënteerde individuele TATS componenten in gezonde muizen harten 9. Deze strategieën zullen verder worden beschreven in de rubriek onderstaande protocol. Terwijl de fysiologische rol van de overvloedige A-tubulus componenten in het volwassen hart raadselachtig is gebleven, hebben EM studies SER membraan structuren geassocieerd met A-buisjes suggereert endogene Ca 2 + vrijlating nanodomains in cavia en rat VMs 5,10 gedocumenteerd. Confocale analyse van Cav1.2 en RyR2 vond een hoge colocalization op A-tubulus kruispunten 10. Aangezien ~ 20% spontane Ca2 + vonken in rat VM ontstaan ​​relatief ver van Z-lijn strepen waarbij T-tubuli typisch voorkomen, is een argument is dat A-tubulus geassocieerde nanodomains inderdaad bestaan ​​en functioneren als Ca 2 + versieplaatsen 11,12. Interessant is dat T-tubulus vorming en rijping occurs pas na de geboorte en loopt parallel met de groei van cardiale cellen, bijvoorbeeld door het kiemen van voorloper sarcolemmale invaginations op P5 en onvolwassen vertakt TATS netwerk samenstellingen bij een P10 bij muizen 13. Het blijkt dat Junctophilin-2 is bijzonder belangrijk voor postnatale maturatie TATS netwerk aangezien shRNA neerhalen verhinderde de verankering van T-tubuli membranen SER knooppunten leidt tot vertraagde Ca2 + afgifte en pathologische TATS organisatie overeenstemming met onrijpe A-tubulus gedomineerd architecturen VM 13. Deze waarnemingen kunnen uiteindelijk leiden tot proof-of-concept dat T-buisjes te vormen door middel van membraan invaginatie processen, terwijl A-buisjes kan morph door aanvullende of zelfs alternatieve intracellulaire mechanismen 14. Karakterisering van TATS membraan veranderingen in hart-en vaatziekten is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied voor pathofysiologische vragen. De eerste berichten in een hond model van pacing-geïnduceerde hart failure toonde een verlies van T-tubuli en Cav1.2 (I Ca) 15. Een varken van ischemische cardiomyopathie vertoonden verminderde T-tubulus dichtheden en een verminderd synchronie van intracellulaire Ca 2 + los 16. Met behulp van een spontaan hypertensieve rat (SHR) van hartfalen, een verlies van T-tubuli werd geassocieerd met een verminderde nanodomain koppeling van Cav1.2 en RyR2 door het voorgestelde mechanisme van &quot;RyR2 orphaning&quot; 7. Een verlies van T-tubuli is ook aangetoond in humane VM ischemische, verwijde, en hypertrofische cardiomyopathie monsters 17. Bovendien, een toename A-buisjes werd gerapporteerd in weefselcoupes van menselijke gedilateerde cardiomyopathie 18. Na een myocardinfarct, toonden we een differentiële mechanisme van TATS reorganisatie in muis VM&#39;s met een significante afname van de T-tubuli in tegenstelling tot een toename van de A-tubulus onderdelen 9. Belangrijker nog, verbeterde lokale membraan contrast bereikt door levende cellen superreoplossing STED microscopie ingeschakeld gedetailleerde kwantitatieve elementanalyse door directe metingen, die aanzienlijke proliferatie van de A-tubuli met de algemene toename van de TATS netlengte en vertakking complexiteit 9 is. Bovendien werd aangetoond dat de training mag de T-tubulus remodeling in ratten te keren na een hartinfarct 19 en dat cardiale resynchronisatietherapie kan leiden tot een herinrichting van de T-tubuli te keren bij honden met atriale tachypacing geïnduceerd hartfalen 20. Samen genomen, zullen studies zowel in de zieke mens en dier VMs alsook mogelijke therapeutische interventies misschien wel profiteren van hoge kwaliteit celisolatie procedures en gedetailleerde kwantitatieve analyse strategieën zoals beschreven in het protocol en de resultaten hieronder secties. Zoals onlangs aangetoond door mantelvlak versus TATS membraantransport van KATP kanaal isovormen 21, is het belangrijk om atriale m overwegenyocytes (AMS) als biologisch te onderscheiden, alsmede vergelijkende cardiale cel model versus VM&#39;s. T-buisjes werden onlangs gedocumenteerd bij schapen en menselijke AMs 22. Huidige gegevens wijzen erop dat enkele T-tubuli bestaan ​​in AM cellen en meestal in grotere zoogdieren als schapen en mensen, maar niet in de kleine knaagdieren 23. In tegenstelling tot VM, in AMs intracellulaire Ca2 + afgifte blijkt plaats te vinden van het celoppervlak teeltmateriaal door diffusie naar het celcentrum waardoor aangegeven ruimtelijke en temporele Ca2 + gradiënten 23. In dit kader lijkt het van belang om de mechanismen van intracellulaire Ca 2 + signalering instabiliteit voor veel voorkomende ziekte vormen verhelderen zoals atriumfibrilleren 24. Samengevat, zijn zowel AM VM celisolatie en elk voor gezonde en zieke harten algemeen gebruikt protocollen. Alleen als celisolatie goed uitgevoerd zoals beoordeeld door microscopische documentatie voldoende cel kwaliteit, moet AM en VM monsters ca zijnrried voorwaarts voor kwantitatieve TATS analyse. Bijgevolg is de volgende protocol secties sterk afhankelijk zijn van hoge kwaliteit mobiele isolaten van muis of andere soorten, gevolgd door live-cell microscopie intact TATS membranen te analyseren. Zoals reeds eerder op gewezen, karakterisering van TATS membranen is een uitdagend onderzoeksgebied met een neiging tot fixatie en voorbereiding artefacten 6, membraan veranderingen als gevolg van osmotische veranderingen, en resolutie beperkingen van conventionele lichtmicroscopie 9. We merken op dat de recente state-of-the-art-protocollen voor de isolatie van de mens AMs voor Ca 2 + imaging en patch-clamp en rat VMs voor celkweek zijn eerder gepubliceerd in dit tijdschrift 25,26.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemicals and Enzymes</td></tr><tr><td>2,3-Butanedione monoxime</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Bovine calf serum</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>SH30073</td><td>Triple 0.1 &micro;m sterieel gefilterd.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>21115</td><td>Verdund 1:10 in MQ-water om 100 mM CaCl2 voorraadconcentratie te verkrijgen.</td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany</td><td>op aanvraag</td><td>Enzymatische activiteit is afhankelijk van individuele collagenase-batches. Collagenase II en andere enzymactiviteiten (Caseinase, Clostripain, Tryptic) kunnen worden beoordeeld in de "collagenase lot selection tool". Bepaal de celopbrengst en kwaliteit individueel voor elke nieuwe batch collagenase.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Rotexmedica, Trittau, Germany</td><td>PZN-03862340</td><td>Verdund in 0,9% NaCl en subcutaan geïnjecteerd in de buikhuid.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, USA</td><td>B506</td><td>Actief ingrediënt: isofluraan, 250 ml. Gebruik ongeveer 2 Vol% in lucht/zuurstof dispenser instrument.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminine (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>354232</td><td>Laminering wordt beschreven onder stap 2.1.</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot;7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>D-3167</td><td>Stockoplossing 2 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td><td>T8154</td><td>Trypanblauw wordt voorzichtig 1:1 gemengd via tip-cut 1 ml plastic pipet met celsuspensie voorafgaand aan celtelling in Neubauer cytometer.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Perfusie Setup</td></tr><tr><td>Circulatiethermostaat</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml;nigshofen, Germany</td><td></td><td>Zie Louch et al. (JMCC 2011). Thermostaat en buffers in perfusieslang verwarmen tot 37 &deg;C 15 min voor gebruik.</td></tr><tr><td>Flexibele siliconen slang Tygon voor peristaltische pomp</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>224-2252</td><td>Slang moet regelmatig worden vervangen.</td></tr><tr><td>Flexibele siliconen slang Tygon voor thermostaat</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsspiraal om perfusieslang</td><td>Rettberg, G&ouml;ttingen, Germany</td><td>op maat</td><td>Verwarmingsspiraal en slang moeten na gebruik grondig worden gereinigd met MQ-water. Gebruik geen detergenten. Glascomponenten moeten regelmatig worden geweekt in 10 mM NaOH.</td></tr><tr><td>Peristaltische pomp</td><td>Ismatec, Wertheim, Germany</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Drieweg stopcock Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>Drieweg stopcock Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Switzerland</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrumenten</td></tr><tr><td>42 mm glazen dekglasjes</td><td>Menzel Gl&auml;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>op aanvraag</td><td>0,13-0,16 mm dikte</td></tr><tr><td>Canule 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td><td>304432</td><td>Op lengte van ~5 mm gesneden, ruw gemaakt met schuurpapier.</td></tr><tr><td>Dekglasjes voor Neubauer cytometer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml;ser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany</td><td>op aanvraag</td><td>0,38-0,42 mm dikte</td></tr><tr><td>Graefe pincet, 0,5 mm tips, licht gebogen</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td><td></td><td>63X 1,4 NA olie objectief</td></tr><tr><td>Neubauer verbeterde cytometer</td><td>Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany</td><td>1100000</td><td>Tellprocedure: Veeg cytometer en dekglas met de meetkamer met 70% ethanol. Druk het dekglas voorzichtig op de meetkamer zodat de twee glasoppervlakken in contact zijn en Newton's ringen kunnen worden waargenomen. Vervolgens kan 10-20 &micro;l celsuspensie worden aangebracht op de rand van het dekglas om het door capillaire actie in het lege te zuigen. Tel de intacte versus defecte myocyten met behulp van de vierkantjes van het cytometer raster dat 100 nl reflecteert. Herhaal de telprocedure op het tweede raster dat op de cytometer wordt geleverd. Bereken de dichtheid van cellen in uw oorspronkelijke celsuspensie door rekening te houden met eventuele verdunnings- en telverkortingen.</td></tr><tr><td>POC-R2 Imaging Chamber</td><td>Pecon, Erbach, Germany</td><td></td><td>Celsuspensievolume: 800 &micro;l; gewenste plateringdichtheid: ~1.000 AM en ~10.000 VM</td></tr><tr><td>Verenschaar, 8 mm bladen recht, stomp</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Student dumont #7 pincet, inox</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Student iris schaar, gebogen, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>91461-1

analyse van buisvormig membraan netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In hartmyocyten bestuurt een complex netwerk van membraanbuizen - het transversaal-axiale tubulussysteem (TATS) - diepe intracellulaire signaalfuncties. Hoewel het buitenoppervlak van het membraan en de bijbehorende TATS-membraancomponenten continu lijken te zijn, zijn er aanzienlijke verschillen in lipide- en eiwitgehalte. In ventriculaire myocyten (VM's) zijn bepaalde TATS-componenten zeer overvloedig en dragen ze bij aan rechtlijnige tubulusnetwerken en regelmatige vertakkingen van 3D-architecturen. Er wordt aangenomen dat perifere TATS-componenten actiepotentialen voortplanten van het celoppervlak naar duizenden verre intracellulaire sarco-endoplasmatisch reticulum (SER) membraancontactdomeinen, waardoor intracellulaire Ca2+-afgifte-eenheden (CRU's) worden geactiveerd. In tegenstelling tot VM's is de organisatie en functionele rol van TATS-membranen in atriale myocyten (AM's) aanzienlijk anders en veel minder begrepen. Samengevat is kwantitatieve structurele karakterisering van TATS-membraannetwerken in gezonde en zieke myocyten een essentiële voorwaarde voor een beter begrip van functionele plasticiteit en pathofysiologische herorganisatie. Hier presenteren we een strategische combinatie van protocollen voor directe kwantitatieve analyse van TATS-membraannetwerken in levende VM's en AM's. Hiervoor begeleiden we primaire celisolaties van muis VM's en/of AM's met kritieke kwaliteitscontrolestappen en directe membraansteekproeven voor fluorescentiebeeldvorming van TATS-membranen. Met behulp van een geoptimaliseerd werkstroom voor confocale of superresolutie TATS-beeldverwerking, worden gebinariseerde en geskeletoniseerde gegevens gegenereerd voor kwantitatieve analyse van het TATS-netwerk en zijn componenten. In tegenstelling tot eerder gepubliceerde indirecte regionale aggregate beeldanalysestrategieën, maken onze protocollen directe karakterisering van specifieke componenten mogelijk en leiden ze complexe fysiologische eigenschappen van TATS-membraannetwerken in levende myocyten af met hoog doorvoer en open access softwaretools. Samenvattend kan de gecombineerde protocolstrategie gemakkelijk worden toegepast voor kwantitatieve TATS-netwerkstudies tijdens fysiologische myocytaanpassing of ziekteveranderingen, vergelijking van verschillende cardiale of spierceltypen, fenotypering van transgene modellen en farmacologische of therapeutische interventies.

In hartspiercellen vormen tubulaire membraanstructuren intracellulaire netwerken. We beschrijven geoptimaliseerde protocollen voor i) isolatie van myocyten uit muizenhart inclusief kwaliteitscontrole, ii) live celkleuring voor state-of-the-art fluorescentiemicroscopie, en iii) directe beeldanalyse om de componentcomplexiteit en de plasticiteit van intracellulaire membraannetwerken te kwantificeren.

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de tubulaire membraannetwerken in atriale en ventriculaire myocyten te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst atriale en ventriculaire myocyten te isoleren van een volwassen muizenhart. In de tweede stap wordt het transversale axiale tubulussysteem of tats gekleurd in de intacte, levende, geïsoleerde hartmyocyten.Vervolgens wordt het tats-membraannetwerk gevisualiseerd door confocale of stabiele fluorescentiemicroscopie, en vervolgens worden de componenten van het netwerk kwantitatief geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen de verschillen tussen de membraannetwerken van verschillende celtypen of tussen sham en behandelingsgroepen worden onthuld door de kwantitatieve tats-beeldanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze celisolatie- en analysetechniek is dat een uitgebreide workflow van het isolatieproces leidt tot directe fluorescentiebeeldvorming van de myocyten, waardoor kwantitatieve gegevensanalyse van het aanraakmembraannetwerk mogelijk is.Deze methode kan inzicht geven in de organisatie van complexe membraannetwerken in levende gezonde cardiomyocyten, maar kan ook worden toegepast op myocyten van zieke of transgene dieren. Nieuwkomers in dit protocol zullen baat hebben bij aanvullende inleidende training om consistente isolatie van hoge kwaliteit hartmyocyten te bereiken en belangrijke voorwaarde voor het uitvoeren van de techniek. Om de myocyten te isoleren, begint u met het perfunderen van het hart van een muis van 12 weken of ouder met 37 graden Celsius zuurstofrijk perfusiebuffer gedurende vier minuten zo snel mogelijk na de extractie van het orgaan. Bezoek vervolgens het hart met 37 graden Celsius verteringsbuffer gedurende acht tot 10 minuten, terwijl u de voortgang van de weefseldigeratie controleert op toenemende opaciteit, zachtheid en zuurgraad over het gehele zichtbare hartoppervlak.Na de vertering, vouw de rechter atriale appendage om en ontleed het rechter atrium net boven de atriale ventrikelkleppen. Ga verder met de dissectie met het linker atrium en ontleed vervolgens en gooi het vezelige klepapparaat weg. Voltooi de dissectie door de linker en rechter vrije ventrikelwanden en het septum en kleinere weefseldelen vrij te maken zoals nodig.Vervolgens brengt u het volledige ventrikelweefsel over naar een 60 millimeter petrischaal die 2,5 milliliter verteringsbuffer bevat, en snijdt u het weefsel vervolgens in stukken van ongeveer één millimeter kubus. Neem de weefselstukken langzaam met een overdrachtspipet om de ventrikelmyocyten voorzichtig te dissociëren in een enkele celsuspensie, waarbij u ervoor zorgt dat u bellen of schade door vloeistofstraal vermijdt. Voeg vervolgens 7,5 milliliter stopbuffer toe aan de celsuspensie.Tegelijkertijd snijdt u het verteerde atriale weefsel in stukken van ongeveer één millimeter kubus in één milliliter verteringsbuffer in een 60 millimeter petrischaal en tritureer vervolgens de atriale myocyten voorzichtig zoals zojuist is aangetoond. Na de mechanische agitatie, voegt u vier milliliter stopbuffer toe om de resterende collageenase-activiteit in de atriale myocytsuspensie te stoppen. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 15 milliliter conische buis en laat de resterende weefselstukken 15 seconden sedimenteren voordat u de geïsoleerde myocyten ophaalt met de supernatansfractie.Na één wasstap, schors u de atriale myocyten voorzichtig in vijf milliliter perfusiebuffer en verdeelt u de celsuspensie in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes in ongeveer één keer 10 tot de derde cel aliquoten om de tat-membranen van de ventriculaire myocyten te kleuren. Laat de cellen eerst zwaartekracht voor acht minuten en een 1,5 milliliter reactiebuis om in de atriale myocyten te kleuren, weiger de cellen gedurende twee minuten bij 20 keer G bij kamertemperatuur voor beide celtypen. Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatans en zorg ervoor dat u onnodige agitatie van het cellenpellet vermijdt.Vervolgens resuspendeert u de cellen voorzichtig in 800 microliter van de membraanspecifieke tyle verf verf acht en eps en brengt u de myocyten onmiddellijk over op laminine gecoate dekglasjes in een beeldvormingskamer na een 15 minuten incubatie in het donker. Was de dekglasjes eenmaal en bedek ze vervolgens met één milliliter perfusiebuffer. Neem een monsterbeeld van een centrale intracellulaire myocytsectie en gebruik vervolgens de cropfunctie om het cropvenster en de uiteindelijke pixelgrootte aan te passen tot 100 bij 100 nanometer.Gebruik om het laatste beeldvlak te selecteren, enkele beeldframes om handmatig het meest geschikte beeldvlak in de Z-richting te kiezen. Bevestig dat het TAs-membraannetwerk zowel tubiale als a tubiale componenten omvat en visueel duidelijk is in het focale vlak. Merk op dat een typisch intracellulair beeldvlak een nucleus kan omvatten als een centrale intracellulaire referentiepunt.Om het tats-membraannetwerk en zijn componenten te analyseren, opent u nu het beeldbestand met de juiste beeldanalysesoftware. Gebruik het polygoonselectiegereedschap om het gebied van belang af te bakenen terwijl u het buitenoppervlakmembraan uitsluit en intracellulaire delen van het tats-membraannetwerk insluit, zoals gedemonstreerd in dit beeld. Gebruik vervolgens de bewerk en buitenkant wissen-opdrachten om het geselecteerde ROI te genereren, zodat het geselecteerde intracellulaire gebied alleen de intracellulaire membraandelen van het tats-netwerk bevat, maar geen delen van het oppervlaktemembraan.Klik nu op proces en trek achtergrond af en stel de rolbalkradius in op vijf pixels. Selecteer vervolgens proces en verbeter lokaal contrast. En stel de blokgrootte in op 49, de histogrambins op 256, de maximale helling op drie en de masker op geen.Klik op proces en glad onder plug-ins, selecteer segmentatie en statistische region mergen en stel de parameter in op Q 100. Klik vervolgens op gemiddelden weergeven. Selecteer vervolgens op afbeeldingstype en acht bits, en selecteer vervolgens afbeelding aanpassen en drempel, beginnend met een drempel van 40.Merk op dat de juiste keuze van de drempel alleen specifieke tats-membraanstructuren moet produceren en geen valse positieve signalen als gevolg van acht

analysis-tubular-membrane-networks-cardiac-myocytes-from-atria

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Mutaties die leiden tot aangeboren hartafwijkingen profiteren van in vivo onderzoek van de hartstructuur tijdens de ontwikkeling, maar hoogwaardige structurele studies in het embryonale muishart zijn technisch uitdagend. Hier presenteren we een robuuste immunofluorescentie- en beeldanalysemethode om cardiomyocyt-specifieke structuren in het zich ontwikkelende muishart te beoordelen.

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om te maken een ruimtelijk gedetailleerde eindige elementen-model van de intracellulaire architectuur van cardiomyocytes van elektronenmicroscopie en confocale microscopie afbeeldingen. De kracht van dit ruimtelijk gedetailleerd model wordt aangetoond door middel van case-studies in calcium signalering en Bioenergetica.

Creëren van een structureel realistische eindige elementen geometrische Model van een Cardiomyocyte te bestuderen van de rol van cellulaire architectuur in Cardiomyocyte systeembiologie

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

De vorming van een goed sarcomerenetwerk is belangrijk voor de rijping van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een super resolutie-gebaseerde aanpak die het mogelijk maakt voor de kwantitatieve evaluatie van de structurele rijping van stamcel afgeleide cardiomyocyten, ter verbetering van de cultuuromstandigheden ter bevordering van de ontwikkeling van het hart.

Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

Hier beschrijven we een eenvoudig te gebruiken methodologie om 3D zelfgeassembleerde cardiale microtissue-arrays te genereren die zijn samengesteld uit vooraf gedifferentieerde door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen. Deze gebruiksvriendelijke en laagcellige techniek die nodig is om cardiale microtissues te genereren, kan worden geïmplementeerd voor ziektemodellering en vroege stadia van medicijnontwikkeling.

Fabricage van 3D cardiale microtissue arrays met behulp van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten, cardiale fibroblasten en endotheelcellen

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Leer hoe u buisvormige membraannetwerken analyseert in boezem- en kamerhartspiercellen van muizen. Deze methode combineert celisolatie, fluorescentiemicroscopie en kwantitatieve beeldanalyse.

Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

Meer video's verkennen