Name: Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer metabolomische analyse van rattenhersenen door hoogresolutie-NMR-spectroscopie op weefselextracten. Deze methode biedt inzicht in neurochemische veranderingen bij neurologische aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun van Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 en 7339) wordt dankbaar erkend.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

NMR spectroscopie is een efficiënte methode voor het meten van concentraties van chemische verbindingen in oplossing in een zeer reproduceerbare en accurate wijze. Echter, om kwalitatief hoogwaardige gegevens te verkrijgen is het nodig om zich te houden aan bepaalde voorschriften betreffende het monster voorbereiding en analyse. Bij het bepalen van metabolietconcentraties door NMR spectroscopie, noch de vorming of de ontvangst van het NMR signaal domineert de kwantificering fout, tenzij de intensiteit van een waargenome...

Muismodellen zijn uitgebreid gebruikt in hersenonderzoek 1. Genotype-fenotype correlaties zijn onderzocht bij muizen en ratten hersenen door het bestuderen van genexpressie op het RNA en / of eiwit niveaus enerzijds en morfologische, functionele, elektrofysiologische en / of gedragsmatige fenotypen anderzijds 2-6. Echter volledig begrijpen van de mechanismen link fenotype aan genotype, is het noodzakelijk om de moleculaire gebeurtenissen stroomafwaarts van eiwitexpressie ie onderzoeken. het metabolisme van de biochemische substraten waarop enzymen werken 7. Deze eis heeft geleid, in de afgelopen 10 tot 15 jaar, naar een renaissance van het metabool onderzoek in vele takken van de biologie 8,9. Terwijl klassieke metabole studies zijn vaak gericht op de details van specifieke studierichtingen, wordt de nieuwe metabolomic aanpak gericht op een allesomvattend onderzoek van de globale metabole profiel van het weefsel in kwestie.Een gevolg van dit concept is een duidelijke behoefte aan analytische tools die voorkeur voor specifieke metabole routes en / of klassen van verbindingen te minimaliseren. Echter een klassieke biochemische assay gebaseerd op een specifieke chemische reactie van een specifiek analyt dat moet worden bepaald voordat de test wordt uitgevoerd. Daarentegen worden spectroscopische technieken zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en massaspectrometrie (MS) (i) gebaseerd op specifieke moleculaire (fysische) eigenschappen van biochemische stoffen, die elk aanleiding geeft tot een of meer afzonderlijke signalen in een spectrum gedetecteerd in de loop van een experiment; en (ii) detectie een groot aantal verschillende verbindingen per experiment. Dus elk spectrum bevat de gecombineerde informatie van een hele reeks van metabolieten. Daarom spectroscopische methoden geschikte instrumenten voor metabolomics, als geen voorafgaande selectie moet worden gemaakt over de aard van de analyt te meten 8 </sup&gt;. Bijgevolg deze technieken nature lenen voor experimentele studies omdat zij zeer detectie van onverwachte metabole veranderingen vergemakkelijken. Hoewel NMR spectroscopie en MS uitwisselbaar worden gebruikt voor de analyse van vele metabolieten, elke methode bezit specifieke voordelen en nadelen die recentelijk hebben beoordeeld 10. In het kort kan NMR spectroscopie gewoonlijk uitgevoerd uit ruwe extracten en geen chromatografische scheiding van het monster verbindingen voor de analyse vereist. Daarentegen MS werkt met gas of vloeistof chromatografie (GC of LC) scheiding, behalve voor bepaalde recente ontwikkelingen, zoals massaspectrometrie imaging. In enkele speciale gevallen zoals de analyse van suikers, kunnen LC scheiding noodzakelijk voor NMR-spectroscopie en omdat de resonantie lijnen van verschillende suikers aanzienlijk overlappen in proton (1H)-NMR spectra. Niettemin, 1H NMR spectroscopie zonder chromatographic scheiding blijft de meest populaire, bijna universeel toegepaste metabolomic NMR-methode. In het algemeen, monstervoorbereiding is meer tijdrovend en complex voor MS dan voor NMR-spectroscopie. Ernstige problemen door matrixeffecten veel minder vaak in NMR spectroscopie dan in MS wanneer deze kunnen leiden tot aanzienlijk verzwakt signalen. Afbraakproduct kwantificatie kan worden bereikt met deze methoden. Er zijn echter meerdere standaard verbindingen die nodig zijn voor MS te wijten aan variaties in matrix-effecten en de ionisatie-efficiëntie tussen metabolieten. Daarentegen is slechts een standaard per monster nodig voor een NMR spectroscopische analyse omdat onder geschikte meetomstandigheden laatstgenoemde mogelijkheid intrinsiek kwantitatieve dankzij de strikt lineaire NMR reactie van de kernen waargenomen. Een belangrijk nadeel van NMR is de relatief lage gevoeligheid. MS, in het bijzonder LC-MS, is gevoeliger dan NMR door verscheidene orden van grootte; Daarom MS de voorkeur boven NMR voor deanalyse van verbindingen optreden bij zeer lage concentraties. Anderzijds, het destructieve karakter van de NMR experiment is een duidelijk voordeel ten opzichte MS; Zo kan NMR herhaaldelijk worden uitgevoerd op hetzelfde monster, bijvoorbeeld voor verschillende NMR-actieve kernen zoals 1H, fosfor-31 (31P), koolstof-13 (13C), fluor-19 (19 F) etc. als geen materiaal verbruikt door NMR tegenover MS metingen. Zowel NMR en MS kunnen worden toegepast in verschillende modi, elk optimaal is voor de detectie van verbindingen met bepaalde chemische eigenschappen. Bijvoorbeeld, 31P NMR vaak beter geschikt dan 1H NMR voor de analyse van matig geconcentreerd gefosforyleerde verbindingen, hoewel bijna alle gefosforyleerde metabolieten protonen bevatten. Toch kan hun 1H NMR signalen onzichtbaar door 1H NMR signalen van andere, niet-gefosforyleerde verbindingen, terwijl de laatsteuiteraard niet leiden achtergrond signalen in 31 P-NMR-spectra. In een analoge situatie, 19F NMR analyse de voorkeur voor fluorverbindingen, bijvoorbeeld gefluoreerde drugs (geen achtergrond signalen van endogene metabolieten), terwijl het bijzondere geval van 13 C NMR plaats bijna uitsluitend als het lot van 13 C gelabelde exogene metabole precursors moet worden gevolgd door de extreem lage natuurlijke abundantie van de 13C isotoop (ongeveer 1%). Veel massaspectrometers werken negatief ion mode of positieve ion modus. Daarom is het belangrijk om vóór de analyse of de ionen worden genomen negatief of positief geladen kent. We richten ons hier op een protocol voor de analyse van het hersenweefsel metabolome door 1H en 31P NMR spectroscopie omdat deze methode levert een groot aantal van de belangrijkste metaboliet concentraties tegen lage kosten in termen van (i) de tijd die nodig is voor de bereiding van de monsters eennd (ii) inspanning die nodig is voor de metaboliet kwantificatie. Alle experimenten worden uitgevoerd met behulp van de apparatuur van een standaard nat-chemisch laboratorium en een hoge-resolutie NMR spectroscopie faciliteit. Verdere eisen zijn beschreven in het onderstaande protocol.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Virbac</td><td>Vetflurane</td><td>Anestheticum voor dieren</td></tr><tr><td>Isoflurane verdamper</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Nieuwere model beschikbaar: Isotec 4</td></tr><tr><td>Scalpel, schaar, tang, klemmen</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>various various</td><td>Chirurgisch materiaal voor dieren</td></tr><tr><td>Freeze-clamp tool</td><td>homebuilt</td><td>n/a</td><td>Tang met aluminium platen, te plaatsen in vloeibare stikstof voor koeling</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stikstofgas</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stijkstof verdamper</td><td>Organomation Associates</td><td>N-EVAP 111</td><td>Kan worden vervangen door een zelfgemaakt apparaat</td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247472</td><td></td></tr><tr><td>Pistool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Weefselhomogenisator</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Met testbuisjes die passen op de homogenisatorschacht</td></tr><tr><td>Elektronische weegschaal</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Chlorooform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuisjes van glas</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml buis</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml buis; moet 'Eppendorf'-buis vervangen als deze compatibel is met de centrifugerotor</td></tr><tr><td>Polystyreen pipetten</td><td>Costar Corning</td><td>Stripettes</td><td>5 en 10 ml volumes</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>99,96% gedeutereerd</td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>99,96% gedeutereerd</td></tr><tr><td>Deuteriumchloride</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>20% in deuteriumoxide</td></tr><tr><td>Natriumdeuteroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>30% in deuteriumoxide</td></tr><tr><td>Lyofilisaat</td><td>Christ</td><td>Alpha 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Koude centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Eutech Cybernetics</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Cesiumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMR-buisjes</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR-stam coaxiaal inzetstuk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>Door Wilmad</td></tr><tr><td>NMR-pipetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>Met punten voor volumes van 0,5 tot 1.000 &mu;l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR-spectrometer</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td><td>inclusief sonde en andere accessoires</td></tr><tr><td>NMR-software</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>nieuwere versie beschikbaar: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>In water oplosbare standaardverbindingen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Standaardverbindingen voor fosfolipiden</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>various various various</td><td>Bron voor plasmalogenen, maar mogelijk <70 - 80% zuiverheid</td></tr><tr><td>Methylendifosfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolomic analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van tissue extracten

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

Studies van genexpressie op het niveau van RNA en eiwitten worden al lang gebruikt om biologische processen die ten grondslag liggen aan ziekten te onderzoeken. Meer recent zijn genomics en proteomics aangevuld met een uitgebreide kwalitatieve analyse van de metabolietpool die aanwezig is in biologische systemen. Deze strategie, metabolomics genoemd, streeft ernaar een globale karakterisering te geven van de kleine-molecuulcomplement betrokken bij de stofwisseling. Terwijl het genoom en het proteoom de taken definiëren die cellen kunnen uitvoeren, is het metaboloom onderdeel van het feitelijke fenotype. Onder de methoden die momenteel worden gebruikt in metabolomics, zijn spectroscopische technieken van bijzonder belang omdat ze het mogelijk maken om tegelijkertijd een groot aantal metabolieten te analyseren zonder voorafgaande selectie voor specifieke biochemische routes, waardoor een brede onbevooroordeelde aanpak mogelijk wordt. Hier wordt een geoptimaliseerd experimenteel protocol voor metabolomicsanalyse door hoog-resolutie NMR-spectroscopie gepresenteerd, wat de methode van keuze is voor efficiënte kwantificering van weefselmetabolieten. Belangrijke sterktes van deze methode zijn (i) het gebruik van ruwe extracten, zonder de noodzaak om het monster te zuiveren en/of metabolieten te scheiden; (ii) de intrinsiek kwantitatieve aard van NMR, die kwantificering van alle metabolieten mogelijk maakt die worden weergegeven door een NMR-spectrum met slechts één referentiecompound; en (iii) de niet-destructieve aard van NMR die herhaald gebruik van hetzelfde monster voor meerdere metingen mogelijk maakt. Het dynamische bereik van metabolietenconcentraties dat kan worden bestreken, is aanzienlijk vanwege de lineaire respons van NMR-signalen, hoewel metabolieten die voorkomen in extreem lage concentraties moeilijk te detecteren kunnen zijn. Voor de minst voorkomende verbindingen kan de zeer gevoelige massaspectrometriemethode voordelig zijn, hoewel deze techniek meer ingewikkelde monstervoorbereiding en kwantificeringsprocedures vereist dan NMR-spectroscopie. We presenteren hier een NMR-protocol aangepast voor rattenhersenanalyse; echter, hetzelfde protocol kan met kleine wijzigingen op andere weefsels worden toegepast.

De beste resolutie te verkrijgen in de metabole NMR-spectra van de hersenen en ander weefsel extracten, is het al lang gebruikelijk om masker metaalionen (belangrijker nog: paramagnetische ionen) te verwijderen of aanwezig in het extract oplossingen. Dit wordt bereikt hetzij door toevoeging van een chelerend middel zoals EDTA of CDTA het extract 19 of door het passeren van het extract door een ionenuitwisselingshars zoals Chelex-100 20. De in figuur 1 resultaten tonen aan dat deze ...

De neurochemie van het zoogdierbrein verandert bij vele neurologische en systemische ziekten. Karakteristieke profielen van cerebrale metabolieten kunnen efficiënt worden verkregen op basis van ruwe extracten van hersenweefsel. Hiervoor wordt hoge-resolutie NMR-spectroscopie gebruikt, wat een gedetailleerde kwantitatieve analyse van metabolietenconcentraties (metabolomics) mogelijk maakt.

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Het algemene doel van deze procedure is om metabolietprofielen met hoge resolutie te verkrijgen uit extracten van rattenhersenen. Dit wordt bereikt door eerst rattenhersenen te verzamelen en deze snel ingeslagen in vloeibare stikstof. De tweede stap is het extraheren van hersenmetabolieten door weefsel te homogeniseren in methanol chloroform water, gevolgd door verwijdering van gedenatureerde eiwitten en organische oplosmiddelen.Vervolgens worden de waterige monsters gelyofiliseerd en worden alle monsters opgelost in goed gedefinieerde oplosmiddelen. Voor optimale NMR-spectroscopische analyse is de laatste stap het zorgvuldig opzetten en optimaliseren van metabolische NMR-experimenten. Uiteindelijk zijn NMR-spectra vereist onder goed gedefinieerde experimentele omstandigheden en worden ze geëvalueerd met behulp van geoptimaliseerde gegevensverwerkingsprotocollen.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de hersenmetabolisme, kan het ook worden toegepast op andere zachte weefsels zoals tumoren, lever, nieren en andere organen. Verwijder eerst een eerder bereid bevroren hersenweefselmonster uit de min 80 graden Celsius vriezer. Breng het weefselmonster vervolgens onmiddellijk over in een mortel die gedeeltelijk gevuld is met vloeibare stikstof.Gebruik een koudbuis met vloeibare stikstof om het bevroren hersenweefsel in kleinere stukken te breken die gemakkelijk in de testbuizen passen die worden gebruikt voor weefselhomogenisatie. Na deze mix weegt u de kleine stukken bevroren hersenweefsel grondig af tot 250 tot 350 milligram en brengt u het over naar een testbuis gevuld met een totaal van vier milliliter ijskoud methanol. Elke keer dat er stukken bevroren weefsel aan de testbuis worden toegevoegd, homogeniseert u deze onmiddellijk met de weefselhomogenisator.Nadat het laatste stuk bevroren rattenhersenmonster in de testbuis is toegevoegd en gehomogeniseerd, brengt u het homogenaat over in een glasbuis van minimaal 20 milliliter. Sluit de schroefdop en plaats het homogenaat 15 minuten op ijs. Voeg vervolgens vier milliliter ijskoud chloroform toe aan het homogenaat en vortex grondig.Nadat u klaar bent, zet u het homogenaat 15 minuten op ijs. Voeg na grondig vortexen vier milliliter water toe aan het homogenaat en laat het homogenaat een nacht bij min 20 graden Celsius staan. Voor volledige fasescheiding brengt u de hersenweefselhomogenaat-oplossing over in een buis met een inhoud van minimaal 20 milliliter chloorvorm-resistente centrifugeerbuis en centrifugeert u het monster bij 13.000 G en vier graden Celsius gedurende 40 minuten.Na centrifugatie gebruikt u een pasterpipet om de bovenste fase over te brengen naar een geschikte 15 milliliter methanol-resistente buis. Gebruik vervolgens een nieuw pasterpipet om de onderste fase over te brengen naar een geschikte, minimaal 15 milliliter chloorvorm-resistente buis en plaats deze op ijs terwijl de buis met de water-methanolfase op ijs blijft. Laat het methanol verdampen door een droge stikstofstroom in de extractoplossing te richten.Beëindig het verdampingsproces wanneer stikstofbubbeling niet langer volumevermindering in de extractoplossing veroorzaakt. Nadat u de buis met de methanol-chloorvormfase op ijs hebt geplaatst, laat u het methanol verdampen door een droge stikstofstroom op het oppervlak van de extractoplossing te richten.Wanneer al het oplosmiddel is verdampt, sluit u de buis en bewaart u het monster op min 80 graden Celsius tot het klaar is voor NMR-analyse. Om de waterige fase voor lyofilisatie voor te bereiden, brengt u het waterige monster over naar een grondig gespoelde 50 milliliter centrifugeerbuis. Bevriest vervolgens de extractoplossing door de centrifugeerbuis in vloeibare stikstof te draaien, zodat de binnenkant van de buis geleidelijk bedekt wordt door de bevroren vloeistof.Wanneer al het vocht is bevroren, dek de buis af met een doorboord schroefdop om de damp te laten ontsnappen en plaats de buis in een wijdhals vacuümfilterfles. Nadat u de fles aan de vriesdroger hebt bevestigd, start u de lyofilisatie en beëindigt u het lyofilisatieproces. Wanneer het monster volledig droog is, bewaar het monster op min 80 graden Celsius in een gesloten buis tot het wordt gebruikt voor NMR-analyse.Voor fosfor-NMR-analyse van fosfolipiden lost u de gedroogdde lipiden op in 700 microliters van een vijf tot vier tot één mengsel van gedeutereerd chloroform methanol en een 200 millimolair waterige CDTA-oplossing. Breng het monster over naar een microcentrifugebuis met behulp van een direct verplaatsbare micropipet met een chloorvorm-resistente tip. Stel op dit punt de temperatuurregeling van de NMR-sonde in op de gewenste doelwaarde, die meestal 25 graden Celsius is.Spin de fosfolipide-extractoplossing bij vier graden Celsius en 11.000 G gedurende 30 minuten om de vaste residuen in het monster naar beneden te centrifugeren. Wanneer u klaar bent, brengt u 600 microliters van de supernatant over naar een hoogwaardige NMR-buis met een buitendiameter van vijf millimeter. Bereid de juiste coaxiale inzetstaaf voor die gevuld is met een waterige 20 millimolair methyleen-difosfaat-oplossing bij pH 7,0 voor chemische verschuivingsreferentie en kwantificering.Plaats deze inzet in de NMR-buis gevuld met de fosfolipide-extractoplossing. Pas vervolgens de juiste spinner aan de NMR-buis aan en breng deze over naar de NMR-magneet. Laat het monster draaien bij 15 tot 20 hertz nadat u hebt gewacht tot het monster zich heeft aangepast aan de ingestelde temperatuur.Minimaliseer zorgvuldig het magnetische veld in homogeniteit over het monster door de op-as en uit-as shim-spoelstromen aan te passen, stel de NMR-spectrumverwervingsparameters in op de optimale waarden, die kunnen variëren als functie van de magneetveldsterkte. Zodra de spectrumverwerving is voltooid, verwerkt u de vrije inductiedecay met geoptimaliseerde parameters om de beste resultaten voor het hele bereik van fosfolipideresonanties te verkrijgen. Herhaal de verwerking met ten minste twee verschillende filterprocedures.<p

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.

Concentratie van de metabolieten van Low-density Planktonische Gemeenschappen voor het milieu Metabolomics met behulp van nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

Een progressieve kolonisatie procedure wordt beschreven om nader te beoordelen de impact ervan op de host levermetabolisme. Colonization is gecontroleerd non invasief door het evalueren van de urinaire excretie van microbiële metabolieten door co-NMR-based metabool profiel, terwijl levermetabolisme wordt beoordeeld door de hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering van intact biopsie.

Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie

Dopamine is duidelijk geregeld in de middenhersenen kernen, die de cellichamen en dendrieten van de dopamine neuronen bevatten. Hier beschrijven we een dissectie en sample-handling aanpak om de resultaten te maximaliseren, en dus conclusies en inzichten, op dopamine regelgeving in de middenhersenen kernen van de substantia nigra (SN) en ventrale tegmentale gebied (VTA) bij knaagdieren.

Uitgebreide Profilering van Dopamine verordening in de substantia nigra en het ventrale tegmentale gebied

Source: Blanc, J., et al. Functional Magnetic Resonance Spectroscopy at 7 T in the Rat Barrel Cortex During Whisker Activation. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the method of analyzing metabolic changes in the rat barrel cortex using functional magnetic resonance spectroscopy during whisker stimulation. Baseline metabolite spectra are compared with stimulated spectra to detect lactate increase in the barrel cortex, confirming successful neuronal activation.

Functional Magnetic Resonance Spectroscopy of the Rat Barrel Cortex During Whisker Stimulation

Positron-emissietomografie voor kleine dieren maakt de beoordeling mogelijk van de twee belangrijkste energiesubstraten van de hersenen: glucose en ketonen. In de huidige methode worden 11C-acetoacetaat en 18F-fluorodeoxyglucose sequentieel in elk dier geïnjecteerd, en hun opname wordt kwantitatief gemeten in specifieke hersengebieden die zijn bepaald op basis van de magnetische resonantiebeelden.

Een dubbel Tracer PET-MRI Protocol voor de kwantitatieve meting van regionale opname van hersenenergiesubstraten bij de rat

Nadat u hebt gecontroleerd door bloed-zuurstof-niveau-afhankelijke functionele magnetische resonantie imaging (fMRI vet) thats het overeenkomstige vat Somatosensorische cortex gebied (genoemd S1BF) correct geactiveerd, de belangrijkste doel van deze studie is te kwantificeren lactaat inhoud schommelingen in de hersenen geactiveerd rat door gelokaliseerde proton magnetische resonantie spectroscopie (1H-mevrouw) bij 7 T.

Functionele magnetische resonantie spectroscopie op 7 T in de Rat vat Cortex tijdens de Whisker activering

Wij beschrijven procedures voor de verwerking van pasgeboren rat hersenweefsel te verkrijgen hoge-resolutie elektronen micrografen voor Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals. De met deze methoden verkregen micrografen kunnen ook gebruikt worden om de morfologie van een aantal andere cellulaire componenten en hun dimensionale structurele relaties te bestuderen.

Voorbereiding van pasgeboren rat hersenweefsel voor Ultrastructurele Morphometric analyse van de synaptische blaasje distributie bij zenuw terminals

Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen van stabiele resting-state functionele magnetische resonantie beeldvorming (rs-fMRI) gegevens van een rat met lage dosis isofluraan in combinatie met lage dosis dexmedetomidine.

Verwerving van resting-state functionele magnetische resonantie beeldvormingsgegevens in de rat

Dit artikel presenteert het gebruik van PSYCHE en SAPPHIRE-PSYCHE bij de metabole profilering van planten en bevat gedetailleerde procedures voor monstervoorbereiding en optimale Pure Shift NMR-spectraregistratie. Er worden voorbeelden besproken waarmee de resolutiewinst die wordt bereikt door homonucleaire ontkoppeling een uitgebreider begrip van het systeem mogelijk maakt.

Pure Shift nucleaire magnetische resonantie: een nieuw hulpmiddel voor plantmetabolomics

De verwerving van dynamische positronemissietomografie (PET)-gegevens en reconstructie in tijdsbestekken maakt analyse van metabole hersenconnectiviteit op het niveau van één persoon mogelijk. We beschrijven een methode om [18F]FDG dynamische PET-gegevens van de hersenen van de rat te verkrijgen en een connectiviteitsmatrix te verkrijgen door de extractie van tijd-activiteitscurven van interessante volumes.

Studie van metabole hersenconnectiviteit met behulp van 2-Deoxy-2-[18F]Fluoro-D-Glucose dynamische positronemissietomografie op het niveau van één proefpersoon

Leer metabolomische analyse van rattenhersenen door hoogresolutie-NMR-spectroscopie op weefselextracten. Deze methode biedt inzicht in neurochemische veranderingen bij neurologische aandoeningen.

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten (Video) | JoVE Journal

Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Meer video's verkennen