Name: Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer CARS-microscopie voor farmaceutische tabletontbinding met in situ-oplosanalyse. Deze methode visualiseert oppervlakteveranderingen in realtime en correleert beeldvorming met UV-absorptiespectroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF wordt ondersteund door de Nederlandse Technologiestichting STW, dat is de toegepaste wetenschap divisie van NWO, en de Technology-programma van het ministerie van Economische Zaken. (STW OTP 11114).

<img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Schematische illustratie van het CARS microscoop setup met de intrinsieke stroom door ontbinding setup. Is dit cijfer aangepast is Fussell et al. 13. 1. System Startup <ol><li> Zet de 20 psec puls 1064 nm laser en CARS zodat de laser opwarmen (ongeveer 1,5 uur). </li><li> Schakel de deuterium lamp UV-lichtbron en laat deze warm-up (ca. 10 min). </li><li> Open de sluiter op de deuterium lamp UV-lichtbron door de ontspanknop in de stand &quot;open&quot;. </li><li> Zet de microscoop besturings-pc en de microscoop besturingssoftware openen. </li><li> Zet de UV spectrometer PC en de spectrometer besturingssoftware openen. </li></ol> 2. Microscope Setup <ol><li> Selecteer de gewenste microscoop doelstelling. Gebruik een 20X/0.5 NA doelstelling om de informatie die in dit werk resultaten te bereiken. </li><li> Zet de filters in het filter set torentje om excitatie lasers zenden en weerspiegelen de CARS-signaal. Selecteer een 775 nm lange pas dichroic spiegel en een 650 nm band-pass 40 nm filter om de in dit werk resultaten repliceren. </li><li> Plaats de juiste filters voor de fotomultiplicatorbuis (PMT) detector die zenden CARS signaleren en filteren ongewenst licht. Filtreer het licht met een 750 nm korte-doorlaatfilter en een 650 nm band-pass 40 nm filter om de experimenten in dit werk te reproduceren. </li></ol> 3. Testen van het systeem <ol><li> Schakel de peristaltische pomp en de pomp oplossingsmedium enkele minuten door de Z-vormige UV-stroomcel voorgaande vloeistof te verwijderen uit de leidingen. </li><li> Bepaal het debiet van de pomp door het wegen van de hoeveelheid oplosmedium gepompt 2 minuten. Pas pompsnelheid until gewenste debiet bereikt is. Pomp oplosmedium met een stroomsnelheid van 5 ml / min de resultaten die in dit werk te bereiken. </li></ol> 4. UV Ontbinding Meting <ol><li> In het UV-spectrometer control software, klik op het menu &quot;Bestand&quot; en klik op &#39;Nieuwe absorptie meting &quot;om een ​​venster waarin alle beschikbare spectrometers lijsten openen. </li><li> Klik op de juiste UV-spectrometer, en klik vervolgens op &quot;Volgende&quot; om een ​​venster waarin de data-acquisitie parameters weergeeft openen. </li><li> Definieer zowel de integratie tijd en de spectrale middeling. Kies een integratie tijd van 150 msec met 200 gemiddelden om de in dit werk resultaten repliceren. </li><li> Klik op de knop &quot;Volgende&quot; om het scherm gebruikt om de referentie-spectrum opnemen brengen. </li><li> Klik op de knop die verschijnt als een gele gloeilamp om een ​​referentie spectrum op te nemen. Pomp oplosmedium continu tijdens deze meting. </li><li> Sluit de sluiter op de deuterium lamp UV-lichtbron door de schakelaar op &quot;gesloten&quot;. </li><li> Klik op de knop &quot;Volgende&quot; om het scherm aan het donker gewend spectrum opnemen brengen. </li><li> Klik op de knop die verschijnt als een grijze gloeilamp naar een donkere spectrum op te nemen. Pomp oplosmedium continu tijdens deze meting. </li><li> Klik op de knop die zegt &quot;Finish&quot; om de UV-absorptie metingen beginnen. </li></ol> 5. CARS Ontbinding Video <ol><li> In het CARS microscoop besturingssoftware klik op de knop die een &quot;XYT&quot; meting selecteert. </li><li> Klik op het drop-down box en selecteer de beeldgrootte in pixels. Selecteer een beeldformaat van 512 x 512 pixels om de beelden die in dit werk te reproduceren. </li><li> Sleep de belichtingssnelheid schuifregelaar om ofwel de &quot;snelle&quot;, &quot;gemiddeld&quot; of &quot;langzaam&quot; positie. Gebruik de snelle scansnelheid (1,12 sec per beeld) te bereikende in dit werk resultaten. </li><li> Klik op de pijlen met het label &quot;zoom&quot; om het zoomniveau aan te passen. Selecteer &quot;2x&quot; zoomen naar het niveau van de zoom en het gezichtsveld (350 x 350 micrometer) die voor deze resultaten te repliceren. </li><li> Klik op de keuzelijst en selecteer het doel gebruikt. </li><li> Klik op het invoerveld en typ het aantal beelden die nodig zijn voor de CARS ontbinding video (afhankelijk van de duur van het experiment). Voeren ontbinding om ongeveer 15 minuten door het opnemen van 900 frames met de in dit werk de resultaten te reproduceren. </li></ol> 6. CARS Golflengte Tuning <ol><li> De optische parametrische oscillator (OPO) controller stel de instellingen van de OPO zoals temperatuur, piëzo positie en Lyot filter positie tot maximaal laserprinten de gewenste Raman-frequentie wordt bereikt. Stem de OPO naar 2960 cm -1 tot dezelfde resultaten als die welke in dit artikel op te nemen. </li></ol> 7. De ontbinding Experiment<ol><li> Plaats een tablet in de monsterhouder van de custom-built CARS stromen cel, schroef de sample houder goed gesloten om lekkage te voorkomen. </li><li> Bevestig de leidingen op de CARS stromen cel aansluiten van de CARS stromen cel naar de beker die de ontbinding medium en de peristaltische pomp. </li><li> Plaats de CARS stroom cel met een tablet op de microscoop podium. </li><li> Controleer dat de CARS stroom cel is aangesloten op de oplosmedium beker, de peristaltische pomp, de Z-vormige UV stroom cel en de afvalinzameling beker. </li><li> Klik op de &quot;XY repeat&quot; knop om de scanning microscoop systeem starten in een functie continu-scan. </li><li> Pas de focus van de microscoop in door de doelstelling tot het oppervlak van de tablet in het gezichtsveld op het scherm microscoop controle. </li><li> Klik op de schuifbalk in de microscoop besturingssoftware label &quot;PMT&quot;. Pas de gevoeligheid van de detector door het verhogen / verlagen van PMT spanning totbevredigende beeldkwaliteit (noch te donker noch verzadigd) is zichtbaar op het scherm. OPMERKING: Zorg dat u de PMT niet overbelast door een hoog voltage. Voor dit werk, gebruikten we een PMT-spanning ongeveer 600 V, maar dit kan variëren naargelang de PMT gebruikt. </li><li> Klik op &quot;Stop&quot; in de microscoop besturingssoftware aan de continue scan te stoppen. </li><li> Tegelijkertijd (of zo dicht bij elkaar mogelijk) start pompen oplosmedium, opname start een XYT scan, en beginnen met het verzamelen UV absorptiespectra. </li><li> Tijdens de ontbinding experiment, toezicht houden op de video-opname uit en stel de microscoop nadruk te zorgen voor de tablet is voortdurend in focus. </li></ol> 8. Bericht Ontbinding <ol><li> Stop de peristaltische pomp door hem uit. </li><li> Klik op het menu &quot;Bestand&quot; en klik op &quot;Opslaan als video&quot; op de microscoop besturingssoftware aan de XYT scan wilt opslaan als een video. </li><li> Klik op het menu &quot;Bestand&quot; en klik op &#39;Opslaan &quot;en klik op&quot; Stop Export &quot;op de spectrometer besturingssoftware om de inzameling van UV-absorptie spectra te stoppen. </li><li> Verwijder de CARS stromen cel van de microscoop podium en verwijder de tablet uit de CARS stroom cel. </li><li> Was de CARS stromen cel met behulp van water en ethanol, en daarna droog met vloeipapier. </li></ol>

<ol><li>Ku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Biopharmaceutical+Classification+System+in+Early+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development.</a> The AAPS Journal. 10, 208-212 (2008).</li>
<li>The United States Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeial+Convention+32nd+ed%22">United States Pharmacopeial Convention 32nd ed</a>. , Rockville, MD. 1-8 (2009).</li>
<li>Florence, A. J., Johnston, A. Applications of ATR UV/vis spectroscopy in physical form characterisation of pharmaceuticals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlorence%2C+AJ+%22Spectrosc.+Eur%22">Spectrosc. Eur</a>. 4, John Wiley & Sons Ltd. (2004).</li>
<li>Aaltonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+solvent-mediated+phase+transformations+during+dissolution+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of solvent-mediated phase transformations during dissolution testing.</a> J. Pharm. Sci. 95, 2730-2737 (2006).</li>
<li>Savolainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+understanding+of+dissolution+behaviour+of+amorphous+drugs+by+in+situ+solid-state+analysis+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71, 71-79 (2009).</li>
<li>Slipchenko, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+of+tablets+by+epi-detected+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 135, 2613-2619 (2010).</li>
<li>Parekh, S. H., Lee, Y. J., Aamer, K. A., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Cellular+Imaging+by+Broadband+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Label-Free Cellular Imaging by Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Biophys. J. 99, 2695-2704 (2010).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Visualization+of+Paclitaxel+Distribution+and+Release+by+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Situ Visualization of Paclitaxel Distribution and Release by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 78, 8036-8043 (2006).</li>
<li>Kang, E., Robinson, J., Park, K., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+distribution+in+poly%28ethylene+glycol%29%2Fpoly%28lactide-co-glycolic+acid%29+blends+and+its+release+visualized+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel distribution in poly(ethylene glycol)/poly(lactide-co-glycolic acid) blends and its release visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J. Controlled Release. 122, 261-268 (2007).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy+to+image+the+changes+in+a+paclitaxel-poly%28styrene-b-isobutylene-b-styrene%29+matrix+pre-+and+post-drug+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Application of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy to image the changes in a paclitaxel-poly(styrene-b-isobutylene-b-styrene) matrix pre- and post-drug elution.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87A, 913-920 (2008).</li>
<li>Jurna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+to+monitor+drug+dissolution+in+different+oral+pharmaceutical+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy to monitor drug dissolution in different oral pharmaceutical tablets.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, 37-43 (2009).</li>
<li>Windbergs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Imaging+of+Oral+Solid+Dosage+Forms+and+Changes+upon+Dissolution+Using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical Imaging of Oral Solid Dosage Forms and Changes upon Dissolution Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 81, 2085-2091 (2009).</li>
<li>Fussell, A., Garbacik, E., Offerhaus, H., Kleinebudde, P., Strachan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissolution+analysis+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+and+hyperspectral+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In situ dissolution analysis using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectral CARS microscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85, 1141-1147 (2013).</li>
<li>Lua, Y. -Y., Cao, X., Rohrs, B. R., Aldrich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Spin-Coated+Films+of+Ethylcellulose+and+Hydroxypropyl+Methylcellulose+Blends.+%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Spin-Coated Films of Ethylcellulose and Hydroxypropyl Methylcellulose Blends. </a> Langmuir. 23, 4286-4292 (2007).</li>
<li>Skoog,, Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C++%22Principles+of+Instrument+analysis.+6+ed%22">Principles of Instrument analysis. 6 ed</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2007).</li>
<li>Rodríguez-Hornedo, N., Lechuga-Ballesteros, D., Hsiu-Jean, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+and+heterogeneous%2Fepitaxial+nucleation+of+hydrated+and+anhydrous+theophylline+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Phase transition and heterogeneous/epitaxial nucleation of hydrated and anhydrous theophylline crystals.</a> Int. J. Pharm. 85, 149-162 (1992).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Bij het uitvoeren van CARS microscopische oplossingsexperimenten zijn er enkele kritieke aspecten die tijdens het experiment moeten worden gemonitord. Ten eerste veroorzaakt het introduceren van het oplosmedium in de CARS flowcel dat de focus verplaatst. Dit betekent dat het beeld onmiddellijk verloren gaat en het enkele micrometer objectiefverstelling vergt om het oppervlak weer te vinden. Ten tweede bestaat er een risico op vloeistoflekkage uit de CARS flowcel als het glazen deksel tijdens het experiment breekt. Dit kan potentieel schade aan de optica veroorzaken, dus het is belangrijk om te luisteren naar elk krakend geluid dat zou kunnen betekenen dat het glas is gebroken. Ten slotte is er ook een kleine kans dat de leidingen geblokkeerd raken door deeltjes in het systeem tijdens het experiment, dit kan worden gezien als een plotselinge ongewone verandering in de UV-spectra en ook door periodiek de stroom tijdens het experiment te controleren.
Deeltjesblokkering van de leidingen is vooral een probleem bij tabletten die zijn ontworpen om tijdens het oplossen uiteen te vallen. Dit is een van de beperkingen van deze techniek, aangezien dit systeem vereist dat het oppervlak van de tablet intact blijft gedurende het gehele oplossingsproces om beeldvorming mogelijk te maken. Naast uiteenvallende tabletten, is het momenteel niet mogelijk om tabletten te beeld die zijn ontworpen om tijdens het oplossen te zwellen, aangezien dit kan leiden tot breuk van de CARS flowcel.
Het beeldvormen van tabletten tijdens het oplossen biedt een beter begrip van wat er op het oppervlak van een oplossende tablet gebeurt. Conventionele farmaceutische oplosmethoden richten zich alleen op het geneesmiddelgehalte dat in het oplosmedium is opgelost, wat kan aantonen of de tablet voldoet aan de vereiste norm. In het geval van een mislukte test is het echter moeilijk om te bepalen wat de oorzaak van het falen is. Het geval van een mislukte oplostest is mogelijk waar in situ oplosanalyse met behulp van CARS-microscopie antwoorden kan geven.
Toekomstige toepassingen voor in situ oplosanalyse met behulp van CARS-microscopie kunnen onderzoek omvatten met meer complexe tabletten die meer dan één geneesmiddel of vulstof bevatten, in het bijzonder niet-zwellende langdurige of gecontroleerde afgifte formulering tijdens formuleringsontwikkeling. Bovendien zou het mogelijk zijn om monsters te onderzoeken met biorelevante oplosmedia die voorwaarden creëren die nauwer gerelateerd zijn aan in vivo.
Kortom, dit werk toont aan dat CARS-microscopie in staat is tot snelle chemisch specifieke beeldvorming op basis van Raman-vibratiefrequenties, waardoor selectieve beeldvorming van het geneesmiddel in een tablet mogelijk is die zowel het geneesmiddel als het vulmiddel bevat. Bovendien is CARS-microscopie in combinatie met inline UV-absorptiespectroscopie een krachtig hulpmiddel dat in staat is om het oppervlak van tabletten tijdens het oplossen te monitoren en oppervlakteveranderingen die met CARS worden gezien, te correleren met veranderingen in de oplosnelheid.

Tijdens de ontwikkeling van orale farmaceutische doseringsvormen zoals tabletten en capsules er nadruk op oplossingstesten. Orale doseringsvormen moeten lossen voordat ze kunnen worden opgenomen voor therapeutische werkzaamheid. Slecht oplosbare geneesmiddelen hebben in het algemeen problemen het bereiken van een voldoende concentratie die oplostesten bijzonder belangrijk 1 maakt. Farmacopee ontbinding methoden worden het meest gebruikt voor ontbinding analyse. In de meeste gevallen vereist het bereiden van het geneesmiddel als tablet of capsule die vervolgens wordt geplaatst in een bekerglas van vloeiende oplosmedium. Het opgeloste geneesmiddel concentratie wordt dan bepaald door het analyseren van monsters van het oplosmedium met een standaard spectroscopische technieken zoals UV absorptie spectroscopie 2. Deze traditionele farmaceutische oplossing methoden geven geen directe analyse van het monster of veranderingen die opgetreden in het oplossen oppervlak van de doseringsvorm.Directe analyse van het monster tijdens het oplossen kunt meer informatie over het oplossen toedieningsvorm bieden en mogelijk problemen op te sporen waardoor dissolutietest mislukking. Directe analyse van oplossende doseringsvormen vereist het gebruik van in situ analysetechnieken die kan monitoren het oplossingsproces zijn. Opnemen in situ tijdens oplossen analytische techniek niet beïnvloed door de aanwezigheid van het oplosmedium en de techniek heeft een hoge tijdsresolutie betrouwbaar wijzigingen in het oplossende doseringsvorm in de orde van seconden gemeten. Verzwakte totale reflectie UV-spectroscopie is geschikt gebleken voor het meten van veranderingen tijdens oplossen te zijn maar mist ruimtelijke resolutie door beeldvormingstechnieken 3. Traditionele farmaceutische beeldvormingstechnieken zoals scanning elektronen microscopie (SEM) en spontane Raman mapping beide beperkende factoren voorkomen van het gebruiksitu tot ontbinding. SEM beeldvorming is een hoge-resolutie snelle beeldvormende techniek staat beeldvorming het oppervlak van farmaceutische doseringsvormen. Echter, SEM beeldvorming in het algemeen uitgevoerd onder vacuüm en vereist monster coating waardoor het niet geschikt voor in situ ontbinding beeldvorming. Vezel gekoppelde spontane Raman spectroscopie gecombineerd met een doorstroomcel en UV doorstroming absorptiespectroscopie, is uitgevoerd om verschillende drugs systemen in situ bewaken tijdens oplossen, zoals theofylline 4, carbamazepine en indomethacine 5. Raman spectroscopie in staat was om te identificeren oppervlak veranderingen die tijdens het oplossen, maar het gaf geen ruimtelijke informatie over waar het oppervlak veranderingen optraden. Spontane Raman mapping gebruikt Raman-spectra en geeft ruimtelijke informatie over het oppervlak van het monster maar beeldvorming neemt de orde van minuten tot uren afhankelijk van het gebied, waardoorhet niet geschikt voor in situ oplossen beeldvorming. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie is een snelle beeldvormende techniek en gecombineerd met inline UV-absorptie spectroscopie, heeft het ons toeliet om een techniek die in staat van ontbinding in situ analyse te ontwikkelen. CARS microscopie levert snelle chemisch selectieve beeldvorming die niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van oplosmedium waardoor het een geschikte techniek in situ oplossen analyse. CARS technieken worden grofweg verdeeld in twee groepen op basis van de pulsduur van de laser; een wezen smalband CARS (picoseconde gepulste lasers), en de andere is breedband CARS (femtoseconde gepulste lasers). Een typisch CARS microscoop bestaat uit twee gepulste laserbronnen en een omgekeerde microscoop. Een CARS signaal te produceren, een van de gepulste lasers moet afstembaar zijn zodat er een frequentieverschil tussen de twee lasers die een Raman trilling past. Bovendien,de twee lasers moeten overlappen in de ruimte (ruimte) en tijd (tijd), met pulsen van beide lasers die bij hetzelfde gebied van het monster tegelijk. Raman trillingen zijn chemisch specifieke en CARS signaal wordt alleen gegenereerd binnen het brandpunt volume van de microscoop, CARS microscopie is in staat om chemisch selectieve beeldvorming met een resolutie tot de diffractie limiet. Smalband CARS microscopie met behulp van een enkele Raman vibratie laat ongeveer 100x sneller beeldvorming ten opzichte van spontane Raman-mapping technieken 6. Breedband CARS microscopie beelden over een breder spectrum (600-3,200 cm -1 vs ~ 4 cm -1), maar heeft een lagere spectrale resolutie (ongeveer 10 cm -1 vs ~ 4 cm -1) en langzamer afbeeldingssnelheid (50 msec / pixel vs ~ 5 usee / pixel) in vergelijking met smalband CARS microscopie 7. Smalband CARS microscopie is gebruikt om het drug vrijlating van enkele farmaceutische systemen. Op het gebied van farmaceutische formuleringen, Kang et al.. 8-10 afgebeeld geneesmiddel geladen polymeerfilms. Aanvankelijk afgebeeld zij de verdeling van het geladen geneesmiddel, gevolgd door beeldvorming van de geneesmiddelafgifte uit een statisch oplosmedium. Jurna et al.. 11 en Windbergs et al.. 12 ging een stap verder en eerst afgebeeld de theofylline verdeling in lipide toedieningsvormen gevolgd door beeldvorming van de drug ontbinding met behulp van een dynamische oplosmedium. We hebben een nieuwe analytische methode om het oppervlak veranderingen op de tablet die een ontbinding met smalband CARS microscopie tijdens het opnemen van de opgeloste concentratie van het geneesmiddel met UV-absorptie spectroscopie tegelijk monitoren ontwikkeld. We illustreren het gebruik van deze methode beeldvorming tabletten die het modelgeneesmiddel theofylline gecombineerd met ethylcellulose ondergaan oplossen met water als oplosmedium.

<table><tbody><tr><td>Paladin 1,064 nm laser</td><td>Coherent</td><td></td><td>Prototype model not for sale</td></tr><tr><td>Levante Emerald Optical parametric oscillator</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX71 Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 300 scanning unit</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier tube R3896</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Free standing optics / filters</td><td>Thorlabs and Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reglo peristaltic pump</td><td>ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB2000+ spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DT-MINI-2-GS light source</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIA-Z-SMA-TEF Z shaped flow cell</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QP400-2-SR-BX optical fiber</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic piping</td><td>ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CARS dissolution tablet flow cell</td><td></td><td></td><td>Zelf gebouwd aan de universiteit - ontworpen om tablets met een diameter van 12 mm en een dikte van 3 mm te houden. De flowcell heeft een kanaaldiepte van ongeveer 0,5 mm.</td></tr><tr><td>Glass beakers</td><td>VWR</td><td>D108980</td><td></td></tr><tr><td>Theophylline anhydrate</td><td>BASF</td><td>30058079</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl cellulose</td><td>Colorcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coherent anti-stokes raman scattering (cars) microscopie visualiseert farmaceutische tabletten tijdens het oplossen

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

Traditionele farmaceutische oplossingstesten bepalen de hoeveelheid geneesmiddel opgelost in de tijd door het meten geneesmiddelgehalte in het oplosmedium. Deze methode geeft weinig directe informatie over wat er gebeurt op het oppervlak van de oplossende tablet. Het oppervlak tablet samenstelling en structuur tijdens oplossen kan veranderen, is het essentieel om te volgen tijdens oplossingstesten. In dit werk coherent anti-Stokes Raman scattering microscopie wordt gebruikt om het imago van de oppervlakte van de tabletten tijdens het oplossen terwijl UV-absorptie spectroscopie wordt gelijktijdig verstrekken inline analyse van opgeloste concentratie van het geneesmiddel voor tabletten met een mengsel van 50% van theofylline anhydraat en ethyl cellulose. De metingen toonden aan dat in situ CARS microscopie kan beeldvorming selectief theofylline in aanwezigheid van ethylcellulose. Daarnaast is de theofylline anhydraat omgezet in theofylline monohydraat tijdens oplossen, met naaldvormige huilenStals groeien op het tablet oppervlak tijdens oplossen. De omzetting van theofylline anhydraat tot monohydraat, gecombineerd met verminderde blootstelling van het geneesmiddel aan het stromende oplosmedium resulteerde in verminderde oplossnelheden. Onze resultaten tonen aan dat in situ CARS microscopie gecombineerd met inline UV absorptie spectroscopie kan bewaken Farmaceutische tablet oplossen en correleren oppervlak verandert met veranderingen in de oplossnelheid.

In situ ontbinding analyse met behulp van CARS microscopie werd uitgevoerd op tabletten (12 mm diameter, plat oppervlak) met een 50:50 mengsel van het model geneesmiddel theofylline anhydraat en ethylcellulose met gedestilleerd water gepompt met 5 ml / min als de ontbinding medium. CARS beelden (512 x 512 pixels) werden verzameld om 1,12 sec bij de Raman trillingsfrequentie 2960 cm -1 die selectief is voor de theofylline inhoud van het tablet gedurende de duur van het experiment ontbinding. Figuur 2 toont geselecteerde frames uit de ontbinding video. Aan het begin van oplossing (figuur 2, tijdstip 0 sec) er gebieden van groene tonen de theofylline inhoud van het tablet en zijn ook donkere gebieden waar slechts ethylcellulose op het oppervlak van het tablet. In de donkere gebieden op het oppervlak van de tablet is het mogelijk om de ethylcellulose inhoud vaag bekijken. Dit is omdat het is gemeld dat ethyl cellulose heeft Raman trillingsfrequenties met maxima rond 2930 en 2975 cm-1 14. Na ongeveer 60 seconden blijkt er begin theofylline monohydraat kristalgroei op het oppervlak kan worden gezien als smalle naaldvormige kristallen naar buiten groeien van ten minste een kristal kern in het midden van het beeld (figuur 2 keer 60 sec) worden . Het monohydraat kristalgroei kan veel duidelijker gezien na 130 seconden (Figuur 2, tijd 130 sec). Bovendien, op tijdstip 130 sec blijkt dat het monohydraat kristal niet geheel is verspreid over het oppervlak van het tablet. Het lijkt alsof de aanwezigheid van de ethylcellulose regio fysiek geblokkeerd heeft de verlenging van het monohydraat naalden. Na 250 seconden, kan men zien dat het monohydraat dekking van het oppervlak is niet zo prominent dat suggereert dat de monohydraat kristallen zich beginnen te ontbinden. Figuur 2. Frames van CARS ontbinding video. Geselecteerde CARS beelden (2960 cm-1) uit een ontbinding video voor een theofylline anhydraat met ethyl cellulose tablet. Het beeld 0 sec wordt opgenomen in een gebied van het monster, terwijl de 60, 130, en 250 sec beelden worden opgenomen op een ander gebied van het monster. De CARS video is beschikbaar als aanvullende informatie. Schaal bar is 50 micrometer. Ultraviolet (UV) spectroscopie is een vorm van absorptie spectroscopie met UV licht als de excitatiebron. UV-spectroscopie maatregelen elektron overgangen van de grondtoestand naar een aangeslagen toestand 15. Theofylline heeft een brede piek rond 270 nm terwijl ethylcellulose is vrijwel onoplosbaar in het oplosmedium wordt dus naar verwachting niet bijdragen aan het UV-spectrum opgenomen. Analyse van de dissolutie medium met de inline z-vormige UV-stroomcel kunnen we kwantitatief de hoeveelheid geneesmiddel opgelost tijdens oplossen. Figuur 3 toont de UV-oplossingsprofiel voor het oplossen van theofylline anhydraat met ethylcellulose tablet. De UV dissolutieprofiel (Figuur 3) laat zien dat de ontbinding van theofylline anhydraat begint het snel bereiken van een maximale concentratie van ongeveer 90 pg / ml binnen 120 seconden; na dit tijdstip de ontbinding tarief begint te dalen. De afname van de oplossnelheid kan door de aanwezigheid van de theofylline monohydraat (oplosbaarheid 6 mg / ml bij 25 ° C 16) kristallen op het oppervlak minder oplosbaar dan theofylline anhydraat (oplosbaarheid 12 mg / ml bij 25 ° C 16 zijn ) en duidelijk te zien in het CARS ontbinding video (figuur 2) op dit tijdstip. De geleidelijke verlaging dissolutiesnelheid kan ook gedeeltelijk worden verklaard bya vermindering theofylline blootstelling aan het stromende medium. Deze reductie treedt op omdat ethylcellulose is vrijwel onoplosbaar in water, zodat de theofylline lost de resterende ethylcellulose belemmert theofylline blootstelling aan het oplosmedium. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3. UV dissolutieprofiel. Concentratie vs tijd plot voor een theofylline anhydraat gecombineerd met ethyl cellulose tablet toont de concentratie van theofylline in het oplosmedium tijdens de ontbinding experiment.

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gecombineerd met een intrinsieke doorstroom ontbinding opstart om in situ en real-time visualisatie van het oppervlak van farmaceutische tabletten ondergaan oplossen. Met behulp van deze custom-built setup, is het mogelijk om auto&#39;s te correleren met drugs oplosprofielen opgenomen met inline UV-absorptie spectroscopie.

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen

Traditional pharmaceutical dissolution tests determine the amount of drug dissolved over time by measuring drug content in the dissolution medium. This ...

Het algemene doel van deze procedure is om chemisch selectieve beeldvorming uit te voeren op het oppervlak van een tablet die farmaceutische oplossing ondergaat met behulp van in situ car-oplossingsanalyse. Dit wordt bereikt door eerst het lasersysteem van de car af te stemmen op een frequentie die selectief is voor de belangrijke chemische stof in de tablet en het UV-absorptiespectrometer in te stellen om spectra op te nemen. De tweede stap is om een tablet in de oplossingsstroomcel van de car te plaatsen en deze stevig te sluiten.Vervolgens wordt de oplossingsstroomcel van de car op de microscooptafel geplaatst en worden de leidingen aangesloten op de pomp en het oplossingsmedium. De laatste stap is om tegelijkertijd een oplossingsvideo van de car op te nemen terwijl het oplossingsmedium wordt gepompt en UV-absorptiespectra worden geregistreerd. Uiteindelijk wordt in situ car-oplossingsanalyse gebruikt om aan te tonen dat oppervlakteveranderingen tijdens de oplossing kunnen worden gevisualiseerd en gecorreleerd met veranderingen in de oplosbaarheidssnelheid.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals farmacopee-oplossingsmethoden, is dat initiële car-oplossingsanalyse diepgaande informatie biedt over het oppervlak van een tablet, dat tijdens de oplossing kan veranderen. Om te beginnen, zet de laser van de car aan en de deuteriumlamp ultraviolette of UV-lichtbron aan en laat deze opwarmen. Open de sluiter op de deuteriumlamp UV-lichtbron door de sluiterschakelaar op open te zetten.Schakel vervolgens de besturings-PC van de microscoop in en open de microscoopbesturingssoftware. Schakel de UV-spectrometer-PC in en open de spectrometerbesturingssoftware. Selecteer het gewenste microscoopobjectief.Stel de filters in de filtersettorent in om excitatielasers door te laten en reflecteer het signaal van de car. Plaats geschikte filters voor de fotomultiplierbuisdetector om het signaal van de car door te laten en ongewenst licht te filteren. Voor systeemtesten, zet de peristaltiekpomp aan en pomp het oplossingsmedium door de V-vormige UV-stroomcel gedurende enkele minuten om eerder vloeistof uit de leidingen te verwijderen.Bepaal de stroomsnelheid van de pomp door het gewicht van het gepompte oplossingsmedium gedurende twee minuten te meten. Pas de pompsnelheid aan tot de gewenste stroomsnelheid is bereikt. Voor UV-oplossingsmeting in de UV-spectrometerbesturingssoftware, klik op het bestandsmenu.Klik vervolgens op Nieuwe absorptiemeting om een venster te openen met alle beschikbare spectrometers. Klik op de juiste UV-spectrometer en klik vervolgens op volgende om een venster te openen dat de gegevensverzamelingparameters weergeeft. Definieer zowel de integratietijd als de spectrale gemiddelde.Klik op de knop gelabeld volgende om het scherm te openen dat wordt gebruikt om het referentiespectrum op te nemen. Klik op de knop die verschijnt als een gele lichtbol om een ​​referentiespectrum op te nemen terwijl het oplossingsmedium continu wordt gepompt. Tijdens deze meting, sluit de sluiter op de deuteriumlamp UV-lichtbron door de schakelaar op gesloten te zetten.Klik op de knop gelabeld volgende om het scherm te openen dat wordt gebruikt om het donkere spectrum op te nemen. Klik op de knop die verschijnt als een grijze lichtbol om een ​​donker spectrum op te nemen terwijl het oplossingsmedium continu wordt gepompt. Tijdens deze meting, klik op de knop die afwerkt zegt om de UV-absorptiemetingen in de carmicroscoopbesturingssoftware te beginnen, klik op de knop die een XYT-meting selecteert.Klik op de vervolgkeuzelijst en selecteer de beeldgrootte in pixels. Sleep de schuifregelaar voor de beeldsnelheid naar de snelle, medium of langzame positie. Klik op de pijlen gelabeld zoom om de zoomniveau aan te passen.Klik vervolgens op de vervolgkeuzelijst en selecteer het gebruikte objectief. Klik op het invoervak en typ het aantal frames dat nodig is voor de oplossingsvideo van de car Gebruik de optische parametrische oscillator of OPO-controller om de instellingen van de OPO aan te passen, zoals temperatuur, pazo-positie en LEO-filterpositie totdat de maximale laseruitvoer op de gewenste ramenfrequentie is bereikt. Plaats een tablet in de monsterhouder van de op maat gemaakte car-stroomcel en draai de monsterhouder stevig dicht.Om lekkage te voorkomen, bevestig de leidingen aan de stroomcel van de car en verbind de stroomcel van de car met de kolf met het oplossingsmedium en de peristaltiekpomp. Plaats de stroomcel van de car met een tablet op de microscooptafel. Controleer of de stroomcel van de car is aangesloten op de beker met oplossingsmedium.De peristaltiekpomp, de V-vormige UV-stroomcel en de afvalopvangbeker. Klik op de XY-herhaalknop om het microscoopsysteem te laten scannen in een continue scanmodus. Pas de focus van de microscoop aan door het objectief te verplaatsen totdat het oppervlak van de tablet zich in het gezichtsveld op het scherm van de microscoopbesturingscomputer bevindt.Klik op de schuifregelaar in de microscoopbesturingssoftware gelabeld PMT. Pas de detectorgevoeligheid aan door de PMT-spanning te verhogen of te verlagen totdat een bevredigend beeld op het scherm zichtbaar is. Klik op stop in de microscoopbesturingssoftware om de continue scan gelijktijdig te stoppen.Begin met het pompen van oplossingsmedium. Begin met het opnemen van een enkele XYT-scan en begin met het verzamelen van UV-absorberende spectra. Tijdens het oplosexperiment bewaakt u de video-opname en past u handmatig de focus van de microscoop aan.Om ervoor te zorgen dat de tablet continu scherp staat. Stop de peristaltiekpomp door deze uit te schakelen. Klik op het bestandsmenu en klik vervolgens op opslaan als video in de microscoopbesturingssoftware om de XYT-scan als video op te slaan. In de spectrometerbesturingssoftware klikt u op het bestandsmenu, klikt u op opslaan en klikt u vervolgens op stop exporteren.Om de verzameling van UV-absorptiespectra te stoppen, verwijdert u de stroomcel van de car van de microscooptafel en verwijdert u de tablet uit

coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-microscopy-visualizes

Research

JoVE Journal

Engineering

Techniek

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Source: Zhang, M. et. al., Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the application of stimulated Raman scattering microscopy to assess susceptibility to antibiotics by tracking deuterium-labeled metabolic activity. By monitoring carbon–deuterium signals, the method enables rapid detection of resistant and susceptible bacterial populations.

Detection of Bacterial Antibiotic Susceptibility Using a Stimulated Raman Scattering Microscope

Source: McCullagh, E. A., et al. Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates fluorescence and Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) imaging to visualize neuronal architecture in rodent brain tissue. Nissl staining labels cell bodies by binding to ribosomal RNA, while CARS imaging targets lipid-rich myelin through laser-induced signals. Overlaying the fluorescence and CARS images provides a...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy to Visualize Myelinated Neurons in Mouse Brain Tissue

Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.

Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Dit protocol presenteert een snelle antimicrobiële gevoeligheidstest (ASAT) binnen 2,5 uur door eencellige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van het D2O-metabolisme. Deze methode is van toepassing op bacteriën in de urine of volbloedomgeving, die transformerend is voor snelle eencellige fenotypische ASAT in de kliniek.

Snelle antimicrobiële gevoeligheidstests door gestimuleerde Raman-verstrooiing Beeldvorming van deuteriumincorporatie in een enkele bacterie

Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.

Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging

Dit artikel vergelijkt direct de resolutie, gevoeligheid en beeldcontrasten van gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) geïntegreerd in hetzelfde microscoopplatform. De resultaten laten zien dat CARS een betere ruimtelijke resolutie heeft, SRS betere contrasten en spectrale resolutie geeft, en beide methoden hebben een vergelijkbare gevoeligheid.

Directe vergelijking van hyperspectrale gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemische beeldvorming

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Het visualiseren van myelinisatie is een belangrijk doel voor veel onderzoekers die het zenuwstelsel bestuderen. CARS is een techniek die compatibel is met immunofluorescentie die lipiden in weefsel zoals de hersenen die gespecialiseerde structuren zoals myeline verlichten, native in beeld kan brengen.

Coherente Anti-Stokes Raman Spectroscopie (CARS) Toepassing voor Imaging Myelinisatie in Brain Slices

Leer CARS-microscopie voor farmaceutische tabletontbinding met in situ-oplosanalyse. Deze methode visualiseert oppervlakteveranderingen in realtime en correleert beeldvorming met UV-absorptiespectroscopie.

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) Microscopie Visualiseert Farmaceutische Tabletten tijdens het oplossen

Meer video's verkennen