Name: De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer hoe je magnetisch sorteren en fluctuatietests combineert om genoominstabiliteit tijdens mitotische veroudering te analyseren in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers mutatieaccumulatie in oude moedercellen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door subsidie ​​R00AG031911 van het National Institute on Aging van de National Institutes of Health om PHM De inhoud van dit artikel niet noodzakelijk overeen met de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1 Voorbereiding van de media en oplossingen <ol><li> Kweek cellen middels gistextract-pepton-glucose (YPD) rijk medium voor het standaardprotocol. Bereid een 2% bacto-pepton, 1% gistextract, 2% glucose oplossing YPD medium en voeg 2% bacto-agar voor vast medium 19. Autoclaaf te steriliseren. Gebruik een ander medium, indien nodig, om een ​​bepaalde groeicondities of mutante giststam testen. </li><li> Maak stevige synthetische compleet medium zonder arginine met 60 mg / L canavanine (SC-arg + canavanine) om te kiezen voor canavanine resistente mutanten. Bereid een oplossing die 0,67% bacto-giststikstofbase zonder aminozuren, 2% glucose, 0,2% van het mengsel zonder supplement arginine (dropout mix) en 2% bacto-agar 19. Autoclaaf en koel voorafgaand aan het toevoegen canavanine van een 20 mg / ml voorraadoplossing (filter-gesteriliseerd, bewaard bij 4 ° C) 19. <ol><li> Voeg vast synthetisch compleet medium bevattende 5-fluororotinezuur (5-FOA). Bereid 500ml van een oplossing die 1,34% bacto-giststikstofbase zonder aminozuren, 4% glucose, 0,4% complete aanvulling mengsel en 0,2% 5-FOA en filter-gesteriliseerd 19. Autoclaaf 500 ml van een 4% bacto-agar oplossing koel kort en meng met de 500 ml-filter gesteriliseerde voedingsoplossing. Gebruik geschikte alternatieve media voor andere mutatie assays. </li></ol></li><li> Voor biotine labeling, maak 500 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing die 137 mM natriumchloride, 2,7 mM kaliumchloride, 10,14 mM natriumfosfaat dibasisch en 1,77 mM kaliumfosfaat dibasisch, pH 8 Bewaar bij 4 ° C en blijf ijs tijdens gebruik. </li><li> Maak een frisse 5 mM biotine voorraad in steriele, ultrapuur water. </li><li> Om biotine labeling lessen, maak 500 ml 1x PBS, 100 mM glycine. Bewaren bij 4 ° C en blijf op ijs tijdens het gebruik. </li><li> Afhankelijk van het aantal gebruikte cellen en duur van het experiment, maken 1-2 L van de kraal-labeling buffer met 1x PBS, 2 mM EDTA, 0,5% Bovine serumalbumine. Filter steriliseren en de gas-buffer. Bewaren bij 4 ° C en blijf op ijs tijdens het gebruik. </li><li> Bereid een 0,4% trypan blauwe oplossing in 1x PBS, filter steriliseren en opslag bij kamertemperatuur bestemd voor cellevensvatbaarheid metingen. </li><li> Aliquot kleine volumes (-100 pl) van een tarwekiem agglutinine (WGA) fluorescente conjugaat te bewaren bij -20 ° C in folie verpakt (of ondoorzichtige) microcentrifuge buizen bestemd voor het bepalen cel leeftijd. </li></ol> 2 Bepaling van de mutatie snelheid en frequentie <ol><li> Opzetten van een basislijn mutatie snelheid per cel generatie met fluctuatie tests voor cellen onder standaard kweekomstandigheden gegroeid. Groei 7-11 repliceren 1 ml kweken van een eerste dichtheid van 1,000-5,000 cellen / ml vroege stationaire fase (~ 10 8 cellen / ml). <ol><li> Voor elke repliceren cultuur, verdunnen cellen 1: 2.000 en verspreiden 1-4 ul op niet-selectief medium (YPD) om kolonievormende eenheden / ml te bepalen. Pellet resterende cellen op ~ 2.400 xg gedurende 1 minuut in een microcentrifuge en resuspendeer in 100 pl water uitgespreid op selectief medium mutanten te identificeren. Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 30 ° C vóór het tellen kolonies (pas incubatietijd indien nodig gebaseerd op de groeisnelheid van cellen). </li><li> Bepaal het aantal onafhankelijke mutaties (m) die zich in het proces op basis van het aantal mutante kolonies (r) opgehaald op selectief medium. Gebruik de Lea-Coulson mediaan schatter om m te vinden door het vervangen van het mediane aantal mutante kolonies voor r in de formule onder de 9. Substitueer tenslotte waarden voor m totdat de linkerzijde van de vergelijking is nagenoeg nul. <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51850/51850eq1.jpg" /></li><li> Mutatie tarief te bepalen, eerst bereken het gemiddelde aantal levensvatbare cellen uitgespreid op selectief medium door het gemiddelde kolonie-vormende eenheden / ml van het duplokweken en het volumevan cultuur in ml spread op selectief medium. Verdeel de m waarde van stap 2.1.2 van dit gemiddelde aantal levensvatbare cellen om de mutatie snelheid per cel generatie te verkrijgen. </li></ol></li><li> Individueel te berekenen het aantal levensvatbare cellen verspreid op selectief medium voor elke repliceren cultuur in een proces zoals beschreven in stap 2.1.3. Verdeel het aantal mutante kolonies (r) voor een kweek verkregen door het aantal levensvatbare cellen uitgespreid op selectief medium om de mutatiefrequentie te verkrijgen. Gebruik de gemiddelde of de mediaan van de individuele mutatie frequenties van het repliceren culturen in stap 2.1 als een baseline mutatie frequentie. </li><li> Voeg frequentiemetingen voor en na biotine labeling cellen (stappen 3.2 en 3.4) te bepalen of de etikettering stap resulteert in een wijziging van de frequentie van mutaties die moeten worden overwogen bij het testen voor leeftijdsgebonden veranderingen in mutatie accumulatie. </li></ol> 3 Biotin Labeling <ol><li> Streak S. cerevisiae uit een glycerol voorraad bij -80 ° C op YPD medium en incubeer bij 30 ° C gedurende 1-3 dagen. </li><li> Met behulp van een steriele pipet overdracht cellen van de reeks van plaat 1 ml (of meer) water in gedachten houden dat 1-1,5 cm van een dik gegroeid deel van de strook zal ongeveer 10 8 cellen bevatten. Exact celdichtheid met behulp van een hemocytometer. </li><li> Label 10 8 cellen per stam (of behandeling conditie) per collectie punt waarop mutatie frequentie zal worden bepaald of een populatiegrootte voldoende is om ten minste 5-10 mutante kolonies per steekproef te verkrijgen op selectief medium (op basis van mutatie frequentie van stap 2.2). Voorzien van een extra 10 8 cellen voor nulmetingen per stam / conditie. </li><li> Biotine label volgens de standaardprocedure van de fabrikant, behalve gebruik maken van een 5 mM biotine reagens voorraad en schud tijdens de incubatie. Spin voor 5 min bij 4 ° C bij 3000 xg voor centrifugatiestappen, sinds spinning bij temperaturen hoger dan 4 ° C kan leiden tot verhoogde cel verlies. Na de laatste wasbeurt, schorsen cellen tot een concentratie van 10 8 gelabelde cellen / ml in water. </li><li> Controleer levensvatbaarheid van cellen met trypan blauw kleuring. Verdun 10 pi cellen met 23 ul water en 67 pl van 0,4% trypan blauw in 1x PBS. Incubeer gedurende ten minste 40 min bij kamertemperatuur voor het maken van levende (ongekleurd) en dood (gekleurd) cellen met een hemocytometer. </li><li> Meet de uitgangswaarden voor genoom instabiliteit, cel leeftijd en andere relevante kenmerken (zie paragrafen 5, 6 en 7). </li><li> Transfer-biotine gemerkte cellen 20 ml YPD-medium per 10 8 cellen in een Erlenmeyer kolf (ongeveer 5 x 10 6 cellen / ml). Groei cultuur (s) 16-18 uur bij 20 ° C een dichtheid van ongeveer 10 8 cellen / ml (4:56 celgeneraties), maar laat cellen stationaire fase bereiken. Gebruik een kortere incubatietijd voor groei bij 30 ° C. Houd biotine-gelabelde cells bij 4 ° C gedurende enkele uren voordat zij aan medium, indien nodig om de timing van de groeiperiode en verzamelen optimaliseren. </li></ol> 4 Bead Labeling en magnetische sorteren <ol><li> Na de groeifase, Verdun een hoeveelheid van cultuur aan de cel dichtheid te bepalen met behulp van een hemocytometer. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C bij 3.000 x g. Giet supernatant. </li><li> Was de cellen door te vortexen om pellet op te schorten in 30 ml van de kraal-etikettering buffer, dan centrifugeren en afgieten van supernatant zoals in paragraaf 4.1. Herhaal wassen. </li><li> Volledig opnieuw in suspensie cellen in 50 ul kraal-etikettering buffer per 10 8 totaal cellen door vortexen. Voeg 2 pi magnetische kralen per 10 8 totale cellen en vortex kort te mengen. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten, het omkeren van periodiek te mengen (bewerkt uit een online-protocol op <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf &lt;</a>/ A&gt;). </li><li> Was de cellen drie maal met 30 ml bead-labeling buffer. </li><li> Voeg 0,5 ml kraal-etikettering buffer per 10 8 totale cellen en kort vortex pellet op medium instellingen enkel tot cellen worden geresuspendeerd. Giet door een 40 micrometer cel zeef in een 50 ml buis om alle resterende celklonten verwijderen. Indien nodig, laat de cellen op ijs gedurende 1-2 uur vóór het laden van de kolom. </li><li> Volg de fabrikant aanbevolen protocol voor de magnetische kolom binden, wassen en elueren de magnetische-kraal gemerkte moedercellen. Voor versneld herstel van de gelabelde cellen, gebruik ten minste een kolom per 2 x 10 9 totaal cellen. <ol><li> Verwijder eventuele luchtbellen die zich voordoen bij het laden van de kolommen, als ze stroom zullen blokkeren. Verwijder en vervang de kolom aan de scheiding tussen wasbeurten om cellen te voorkomen dat ze gevangen zitten tussen de kralen (gewijzigd bij een online protocol bij <a href="http://www.sysbio.org/dataresources/usermanual031113.pdf">http://www.sysbio.org/dataresources/user</a>manual031113.pdf). </li><li> Tenzij stromen door binden en wasstappen jonge cellen die door de moedercellen analyseren, indien gewenst. Concentraat cellen zoals beschreven in stap 4.7. </li><li> Gebruik meerdere kolommen separatoren voor het verwerken van meerdere monsters tegelijk. Elute meerdere kolommen van hetzelfde monster in dezelfde collectie buis te verminderen verwerkingstijd en het verlies van cellen te verminderen. </li></ol></li><li> Concentreer geëlueerd moedercellen door centrifugeren bij 3000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig alle maar 1 ml buffer per 10 8 originele biotine-gelabelde cellen. Vortex kort aan cellen in de resterende buffer op te schorten. </li><li> Verdun een aliquot van cellen en kleuren met trypan blauw aan de celdichtheid en cellevensvatbaarheid met een hemocytometer bepaald (zie stap 3.5). Bereken het totale aantal cellen teruggewonnen. <ol><li> Als het aantal cellen aanzienlijk hoger dan verwacht, passen de elutie monster door een kolom te proberen te verwijderen contaminerende jonge cellen.Als het aantal cellen is aanzienlijk lager dan verwacht, passen de opgeslagen stroom door monster door een kolom te proberen opbrengst van moedercellen verbeteren. </li></ol></li><li> Gebruik cellen voor verdere analyse, zoals beschreven in de hoofdstukken 5 en 6 alternatief groeien de cellen in YPD bouillon weer aan hun replicative leeftijd (stap 3.7) te verhogen en te volgen door kraal etikettering en sorteren (stappen 4.1-4.8.1), zonder dat de moet de biotine herhalen etikettering. </li></ol> 5 Bepaling van Replicatieve Age <ol><li> Spin cellen gedurende 2 minuten bij 5000 xg bij RT voor alle stappen in dit gedeelte. Breng 25 pl van teruggewonnen cellen (~ 10 8 cellen / ml) in een 1,5 ml centrifugebuis en tweemaal spoelen met 1x PBS 1 ml. Aspireren uit supernatant. <ol><li> Ontdooi een portie van WGA-conjugaat, vortex te mengen, en spin kort eiwit aggregaten te elimineren. Suspendeer de cellen in 180 ul 1 x PBS en 20 ui WGA geconjugeerd aan een fluorescent molecuul bud littekens label op het oppervlak van de cellen. Bedek 1,5 ml centrifugebuis met folie en incubeer met zachte schommelen bij 30 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Was drie keer met 1 ml 1X PBS. </li></ol></li><li> Voor fluorescentie microscopie, label glijbanen en monteren per standaard protocol met behulp van een anti-fade-agent. Volledig genezen van dia&#39;s in het donker (tot een paar dagen) voor het afdichten dekglaasje naar cel beweging tijdens de beeldvorming te voorkomen. Telling knop littekens op ten minste 50 cellen per monster een representatieve maatstaf cel leeftijd verkrijgen. WINKEL dia tot 1 maand voor weergave Knop littekens, indien nodig. <ol><li> Anderzijds bepaalt de intensiteit van het fluorescerende signaal van de WGA-conjugaat door het uitvoeren van flowcytometrie op cellen gesuspendeerd in 1 ml 1x PBS na stap 5.1.2. Gebruik een 405 nm excitatie laser en 530/30 nm emissie-filter met een 505 nm lange pass filter voor de WGA-Alexa 488 Inclusief een onbesmet controle voor elk inzamelpunt. </li></ol></li><li> Grafiek bud littekens op jonge cellen en verouderde cellen geteld door microscopie op dey-as tegen de genormaliseerde geometrisch gemiddelde (gekleurd geometrisch gemiddelde / ongekleurde geometrisch gemiddelde) van de WGA-conjugaat fluorescentie van dezelfde celpopulaties op de x-as. Het verkrijgen van de vergelijking van een lineaire trendlijn voor deze relatie. Voor verdere experimenten wordt vervangen genormaliseerde meetkundig gemiddelde van WGA-conjugaat fluorescentie-intensiteit van een celpopulatie voor x in de vergelijking en lossen voor y de gemiddelde cel leeftijd van een monster. </li></ol> 6 mutatiefrequentie <ol><li> Spread gesorteerd moedercellen geresuspendeerd in buffer van stap 4.7 op YPD medium en selectief medium volgens stap 2.1.1. Gebruik 1 ml geresuspendeerd moedercellen voor selectief medium en rotatie cellen bij 5000 xg gedurende 1 minuut. OPMERKING: Bedek grotere hoeveelheden verdunde cellen op YPD medium zoals cellen toenemen leeftijd compenseren steeds niet-levensvatbare en verouderde cellen in oudere populaties. <ol><li> Incubeer YPD medium en selectief medium platen uitstap 6.1 bij 30 ° C gedurende 3 en 4 dagen, respectievelijk. Verhoog de incubatietijd tot een week voor de zeer oude cellen of langzaam groeiend ras. Bereken mutatiefrequentie zoals beschreven in stap 2.2. </li></ol></li></ol> 7 Berekening Voorspelde mutatiefrequentie voor een bepaald Replicatieve Age <ol><li> Bereken de gemiddelde toename replicatieve ouderdom van de biotine-gelabelde cellen in de loop van het experiment door de gemiddelde leeftijd van de initiële celpopulatie van de gemiddelde leeftijd van de gesorteerd moedercellen voor de betreffende soort. Gebruik de cel leeftijden berekend in stap 5.2 of stap 5.2.2. </li><li> Vermenigvuldig de mutatie snelheid in stap 2.1.3 verkregen door de gemiddelde cel leeftijd berekend in stap 7.1. Voeg deze waarde aan de basislijn mutatiefrequentie voor de initiële populatie berekend in stap 2.2 de voorspelde mutatiefrequentie voor cellen van de desbetreffende replicatieve leeftijd te bepalen. </li></ol>

<ol><li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%2C+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim Biophys Acta. 1790, 963-969 (2009).</li>
<li>Maher, R. L., Branagan, A. M., Morrical, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+DNA+replication+and+recombination+activities+in+the+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination of DNA replication and recombination activities in the maintenance of genome stability.</a> J Cell Biochem. 112, 2672-2682 (2011).</li>
<li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metab. 16, 18-31 (2012).</li>
<li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li>
<li>Madia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1%2FPolzeta-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11, 599-606 (2012).</li>
<li>McMurray, M. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+age-induced+switch+to+a+hyper-recombinational+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An age-induced switch to a hyper-recombinational state.</a> Science. 301, 1908-1911 (2003).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymol. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Boeke, J. D., LaCroute, F., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive+selection+for+mutants+lacking+orotidine-5%26%2334%3B-phosphate+decarboxylase+activity+in+yeast%3A+5-fluoro-orotic+acid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">A positive selection for mutants lacking orotidine-5&#34;-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance.</a> Mol Gen Genet. 197, 345-346 (1984).</li>
<li>Whelan, W. L., Gocke, E., Manney, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CAN1+locus+of+Saccharomyces+cerevisiae%3A+fine-structure+analysis+and+forward+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The CAN1 locus of Saccharomyces cerevisiae: fine-structure analysis and forward mutation rates.</a> Genetics. 91, 35-51 (1979).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother+enrichment+program%3A+a+genetic+system+for+facile+replicative+life+span+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The mother enrichment program: a genetic system for facile replicative life span analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 183, 413-422 (2009).</li>
<li>Lindstrom, D. L., Leverich, C. K., Henderson, K. A., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+age+induces+mitotic+recombination+in+the+ribosomal+RNA+gene+cluster+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Replicative age induces mitotic recombination in the ribosomal RNA gene cluster of Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS Genet. 7, e1002015(2011).</li>
<li>Feser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+histone+expression+promotes+life+span+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Elevated histone expression promotes life span extension.</a> Mol Cell. 39, 724-735 (2010).</li>
<li>Afonso, B., Silver, P. A., Ajo-Franklin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+selectively+arresting+daughter+cells+to+create+aging+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for selectively arresting daughter cells to create aging populations.</a> Nucleic Acids Res. 38, 2727-2735 (2010).</li>
<li>Smeal, T., Claus, J., Kennedy, B., Cole, F., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+transcriptional+silencing+causes+sterility+in+old+mother+cells+of+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of transcriptional silencing causes sterility in old mother cells of S. cerevisiae.</a> Cell. 84, 633-642 (1996).</li>
<li>Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+reactive+oxygen+species+begin+early+during+replicative+aging+of+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Free Radic Biol Med. 50, 963-970 (2011).</li>
<li>Dang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+lysine+16+acetylation+regulates+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H4 lysine 16 acetylation regulates cellular lifespan.</a> Nature. 459, 802-807 (2009).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14, 115-132 (1998).</li>
<li>Maxwell, P. H., Burhans, W. C., Curcio, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+is+associated+with+genome+instability+during+chronological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition is associated with genome instability during chronological aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 20376-20381 (2011).</li>
<li>Hall, B. M., Ma, C. X., Liang, P., Singh, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+analysis+CalculatOR%3A+a+web+tool+for+the+determination+of+mutation+rate+using+Luria-Delbruck+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fluctuation analysis CalculatOR: a web tool for the determination of mutation rate using Luria-Delbruck fluctuation analysis.</a> Bioinformatics. 25, 1564-1565 (2009).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+estimator+of+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A robust estimator of mutation rates.</a> Mutat Res. 661, 101-109 (2009).</li>
<li>Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+oxidatively+damaged+proteins+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.</a> Science. 299, 1751-1753 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol combineert meerdere methoden om middelen mogelijk en benaderingen in de Saccharomyces cerevisiae modelsysteem tijdens mitose veroudering doeltreffender kunnen worden toegepast op de studie van genoom instabiliteit. Een grote verscheidenheid aan assays om verschillende vormen van instabiliteit van het genoom kwantificeren door fenotypische selectie kan worden gecombineerd met magnetische sortering mogelijke leeftijd-specifieke veranderingen in accumulatie van bepaalde vormen van mutaties of chromosoomherschikkingen bestuderen. Terwijl genoom sequentieanalyse benaderingen meer informatie kan verschaffen over de algemene soorten wijzigingen van een genoom met de leeftijd, het vermogen om fenotypische selectie systemen mutatie snelheidsmetingen verkrijgen en bij voorkeur isoleren specifieke genetische veranderingen zijn belangrijke voordelen voor het bestuderen mechanistische aspecten van veroudering gerelateerde genoom instabiliteit. Het stroomlijnen van de bepaling van de cel leeftijd en het potentieel om parallelle metingen van physiologi makencal veranderingen via flowcytometrie een efficiënte manier om het genoom instabiliteit met andere cellulaire veranderingen tijdens specifieke leeftijdsgroepen correleren. Bepaling van potentiële leeftijdsafhankelijke schommeling van accumuleren mutaties vereist: 1) zorgvuldige bepaling van tarieven bij jonge celpopulaties 2) nauwkeurige bepaling van cel leeftijd, en 3) het vermogen om betrouwbaar te verrijken voldoende grote populaties van moedercellen reproduceerbaar meten genoom instabiliteit op oudere leeftijd. Deze aanpak maakt het mogelijk de gist modelsysteem om bij te dragen aan het bepalen van de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de leeftijd-afhankelijke veranderingen in tarieven en / of frequenties van het genoom instabiliteit in mitotisch actieve cellen. Bovendien kunnen genetische en omgevingsfactoren snel worden beoordeeld voor bijdragen aan leeftijdsafhankelijke genoom instabiliteit. Uiteindelijk kunnen deze karakteristieken leiden tot ontwikkeling van modellen die rekening houden met de wijze waarop mutaties accumuleren tijdens replicatieve veroudering. Deze werkwijze hangt af van het vermogen om mutaties of andere soorten genoom instabiliteit detecteren door het verschijnen van selecteerbare fenotypen te bekijken van dergelijke gebeurtenissen te meten. Echter, kan de creativiteit in assay ontwerp toe vele aspecten van het genoom instabiliteit te worden onderzocht. Zo kan de URA3 en CAN1 genen worden geplaatst op verschillende genomische locaties elke invloed van genomische locatie testen resultaten. Terugval van specifieke niet-functionele gen allelen tot functioneel gen allelen konden testen bepaalde mutatie-processen. Ook zou opneming van tal inactieve allelen van een gen of een gen met flankerende herhaalde sequenties worden gebruikt om recombinatiegebeurtenissen respectievelijk onderzocht wordt hersteld of verlies van genfunctie. Fluctuatie tests zijn de standaard aanpak voor het bepalen van de tarieven van de verschillende genoom instabiliteit gebeurtenissen 9. Het protocol is geschreven met behulp van de algemeen aanvaarde en relatief eenvoudige Lea-Coulson mediaan schatter en muta bepalennatiegraad om het meer toegankelijk te divers onderzoekers te maken, ook al is de MSS-maximum likelihood schatter methode wordt beschouwd als de beste aanpak voor het bepalen van het aantal mutaties 9. De MSS-maximum likelihood estimator eerder beoordeeld in detail 9, en kan worden gebruikt als een alternatieve methode, maar vereist meer gesofisticeerde berekeningen. U kunt ook gratis software om mutatie berekenen met deze methode is beschikbaar 22 gemaakt. Het verkrijgen van reproduceerbare metingen van mutatiesnelheden vereist aandacht voor enkele aspecten van experimenteel ontwerp, waaronder met geschikt duplokweken, enten kweken worden in kleine initiële celdichtheden die populatieomvang verhoogt 10.000-voudig of meer, en het kiezen van geëigende hoeveelheden zodat de gehele celpopulatie kan worden uitgespreid op selectief medium. Voor dit laatste punt kan een eerder beschreven formule worden gebruikt om de mutatie snelheid aanpassen op basis van de fractie van de cultuur tested 9. Variatie in de groei van culturen kan het bepalen van een reproduceerbare mutatie snelheid, en een aangepaste-mediaan gebaseerde schatter die meer reproduceerbare resultaten in dergelijke situaties is onlangs beschreven 23 kan opleveren compliceren. Het accuraat meten cel leeftijd andere factor die van belang is te bepalen of genoom instabiliteit frequenties oude cellen verschillen van de waarden verwacht vanwege de snelheid van gebeurtenissen bij jonge cellen. We hebben WGA kleuring gevonden voorkeur witte vlekken Calcofluor zijn, zowel qua achtergrond en flexibiliteit, aangezien WGA is geconjugeerd beschikbaar voor verschillende fluorescente moleculen. Deze flexibiliteit kan meer mogelijkheden bieden voor het gelijktijdig meten van andere cel kenmerken met fluorescerende reagentia. De eerste werkzaamheden om een ​​relatie tussen de intensiteit van het signaal voor de WGA kleuring en het bijbehorende aantal bud littekens op cellen te stellen, kan dan leiden tot een meersnelle bepaling van cel tijd door flowcytometrie. Deze aanpak maakt het ook mogelijk het gebruik van grotere populatie maten dan zouden in het algemeen door middel van microscopisch worden onderzocht voor een betere reproduceerbaarheid van de metingen. Terwijl meerdere bepalingen zou kunnen worden gemaakt door middel van microscopisch onderzoek van de cellen, voelen we dat de flowcytometrie aanpak maakt snelle screening van factoren die leeftijdsafhankelijke genoom instabiliteit beïnvloeden. Naast meetcel leeftijd betrouwbaar, dient aandacht te worden besteed aan het aantal celdelingen moedercellen mogen ondergaan met elke opeenvolgende ronde van groeiende cellen en sorteren. Gebruik van een kleinere initiële populatiegrootte of grotere kweekvolume waardoor cellen meer celdelingen ondergaan alvorens de gewenste celdichtheid. Zo hebben andere onderzoekers gebruikt twee ronden van sortering zeer oude gistcellen 16, waarbij als voordelen verkrijgen van oude cellen minder experime heeft verkregenntal stappen. Bij de beoordeling van de cultuur het volume te verhogen, zodat de cellen om meer celdelingen voorafgaand aan het sorteren te voltooien, rekening houden met de beperking van het totale aantal cellen dat in een enkele kolom kan worden verwerkt. Gebruik van een grotere cultuur volume kan het gebruik van meerdere kolommen noodzakelijk een celpopulatie te sorteren. Ook als cellen ondergaan minder rondes van celdeling tussen allerlei / inzamelpunten, dan zijn er meer mogelijkheden om afwijkingen van verwachte mutatie frequenties op verschillende tijdstippen te observeren tijdens de levensduur. Bijvoorbeeld, bemonstering alleen op vroege en late tijdstippen tijdens de levensduur kan data wijst op een gestage toename van de mutatie frequentie, maar bemonstering tegen extra tussenliggende momenten tijdens de levensduur kan snel en plateaus zien dat mutatie frequentie stijgt produceren. Echter, aangezien dit protocol isoleert oude moeder cellen, is er een mogelijkheid om een ​​meer directe meting van veranderingen in de mutatie tarieven met de leeftijd te verkrijgen. Fluctuatie testen kon be uitgevoerd met moedercellen van verschillende leeftijden te bepalen of de mutatie snelheid verschillen van de snelheid verkregen met jonge cellen. Terwijl het kweken van deze fluctuatie proeven een mengeling van oude en jonge cellen als ze groeien, kunnen eventuele afwijkingen van verktregen ab jonge cellen worden toegeschreven aan het gebruik van een oudere uitgangspopulatie. De mogelijkheid om reproduceerbaar verkrijgen van een voldoende groot populatie moedercellen verouderd aan genoom instabiliteit nauwkeurige meting is cruciaal voor het succes van deze benadering. Terwijl het protocol beschrijft het gebruik van een bepaald magnetisch sorteersysteem hiervoor zijn andere groepen gist moedercellen gesorteerd met alternatieve systemen 14,18 (zie tabel of Materials). Dergelijke alternatieve systemen moeten ook met deze methode, hoewel sommige optimalisatie van de protocollen van de fabrikant kan worden verlangd. Ongeacht het specifieke systeem dat wordt gebruikt, de grootte van de populatie nodigd verschilt afhankelijk van de frequentie van het type mutatie of genoomsegment herrangschikking gekozen studie. Minimaal moet er voldoende moedercellen ten minste een mutant kolonie per populatie verkrijgen van een mutatiefrequentie berekenen. In de praktijk kunnen de resultaten nogal variabel zijn als alleen nul tot vijf mutante kolonies worden verwacht van de populatiegrootte, en zelfs een kleine toename in densiteiten, zodat 09:55 mutante kolonies worden verwacht, kan sterk verbeteren reproduceerbaarheid. Wanneer biotine labelen van een beginnend bevolking, het herstel efficiëntie voor elke soort moet in aanmerking worden genomen om te helpen bij het identificeren van de juiste grootte van de populatie noodzakelijk om mutatie frequentie in oude moeder cellen te meten. Bij 90% terugwinning van moedercellen na elke soort, zou slechts 59% van de oorspronkelijke populatie worden hersteld na vijf ronden van groei en sortering. Deze daalt tot ~ 33% herstel van de oorspronkelijke populatie na vijf ronden van groei en sorteren als slechts 80% van gelabelde moedercellen worden herstellened tijdens elke soort. Meten en het maximaliseren van het herstel is van cruciaal belang bij het meten van laagfrequente gebeurtenissen, sinds een 2-3 voudige afname van de bevolkingsomvang gemakkelijk zou kunnen leiden tot onbetrouwbare aantallen mutant kolonies per bevolking. Er zijn tal van mogelijkheden om uit te breiden op of dit protocol te wijzigen om een ​​breder begrip van het genoom instabiliteit tijdens mitotische celveroudering te verkrijgen. Eenvoudige voorbeelden zijn te analyseren hoe veranderingen in de gen-functies, media verandert, of andere veranderingen milieuconditie veranderen de accumulatie van mutaties met de leeftijd. Mutation bekijken van jonge cellen met veranderde genfunctie en in de relevante voorwaarde zou worden gemeten en bepaald of mutaties accumuleren anders dan voorspeld door de snelheid waarden en anders dan in de controle celpopulaties. Celpopulaties op verschillende punten tijdens replicative veroudering kunnen worden blootgesteld aan specifieke stressoren, zoals zuurstofradicalen of DNA-beschadigende middelen. Eenvoorbijgaande en milde blootstelling aan oxidatieve stress niet wezenlijk het vermogen om celsortering (figuur 3) voeren wijzigen maar zwaardere belasting kunnen de terugwinning van cellen bemoeilijken. Voorlopige experimenten nodig zou zijn om te controleren of de moeder cellen kan nog efficiënter na specifieke spanningen hersteld. Bovendien kan de cellulaire kenmerken van geïsoleerde moedercellen in detail geanalyseerd, zoals het niveau van reactieve zuurstof species, en vacuolaire mitochondriale morfologie, en andere fysiologische kenmerken die zijn geassocieerd met veroudering 3. Voorts zou de moedercellen een populatie waarvan een verdere behandeling of manipulatie. Omdat moeder en dochter cellen fysiek worden gescheiden tijdens de procedure, de dochter cellen zijn ook nog beschikbaar voor analyse. Bijvoorbeeld veranderingen in de fysiologische kenmerken van de dochter van cellen of de asymmetrische erfenis van beschadigde macromoleculen tussen gist moeder en dochter cellen <sup&gt; 24 kan worden vergeleken met de timing van een interessante veranderingen in de mutatie frequenties / tarieven. Mutatie frequenties voor dochtercel populaties kunnen worden verkregen om te proberen te modelleren of er asymmetrische overerving van mutaties gedurende replicatieve veroudering. Samenvattend combineren verrijking van moedercellen door magnetische celsortering met schommelingen proeven kan de voordelen van de S. cerevisiae modelsysteem doeltreffender kunnen worden toegepast op doel mechanismen verantwoordelijk voor de accumulatie van genetische veranderingen tijdens mitose veroudering.

Micro-organismen, zoals gist Saccharomyces cerevisiae, zijn uitstekende modellen voor het onderzoek mutatiesnelheden, maar deze modellen zijn niet volledig gebruikt om de accumulatie van mutaties te onderzoeken gedurende mitotische celveroudering. Mutatie accumulatie in het nucleaire genoom wordt verondersteld bij te dragen aan veroudering hierdoor geen progressief verlies van (of variatie in) genfuncties 1. De mogelijkheid om een ​​microbieel systeem te gebruiken om de mechanismen en gevolgen van mutatie accumulatieonderzoek het ouder kan sterk versnellen de identificatie van genetische en omgevingsfactoren beïnvloeden deze taak vanwege gemakkelijke genetische systemen en het gemak kwantificeren zeldzame fenotypische veranderingen in microörganismen. DNA-herstel factoren en DNA schade respons eiwitten zijn goed geconserveerd in diverse soorten 2, en van de fundamentele overeenkomsten in organismal ouder zijn geïdentificeerd voor organismen zo divers als S. cerevisiae eend zoogdieren 3, waardoor het waarschijnlijk is dat de resultaten verkregen uit studies in gist zal de vergrijzing in veel organismen relevant zijn. Studies van de vergrijzing in S. cerevisiae maken gebruik van twee verouderende modellen die chronologische veroudering of replicatieve veroudering van cellen te meten. Chronologische veroudering wordt gekenmerkt door progressief verlies van levensvatbaarheid gistcel populaties die in een niet-delende toestand (stationaire fase) door nutriënten uitputting 3. De chronologische veroudering model is gebruikt om aan te tonen dat mutaties accumuleren met de leeftijd 4, omdat grote celpopulaties gemakkelijk worden verkregen in dit model fenotypische selectie uitvoert mutantcellen. In dit geval verschijnt mutatie accumulatie beïnvloed worden door groei-signaalwegen en oxidatieve stress 5, en elk van deze factoren is het inzicht veroudering in meercellige eukaryoten 3 relevant. De replicatieve veroudering model maakt gebruik van de asymmetrische divisiop tussen S. cerevisiae moeder en dochter cellen voor onderzoek naar veroudering die optreedt bij de opeenvolgende generaties cel 3. Gist replicatief veroudering is vaak gemeten door micromanipulatie van kleine populaties van moeder en dochter cellen, of meer recent, door middel van video microscopie van kleine populaties van gistcellen in microfluïdische apparaten 6,7. Beperkte omvang van de bevolking maken deze benaderingen slecht geschikt voor het onderzoeken van mutatie accumulatie tijdens mitotische ouder, tenzij het ​​hele genoom informatie wordt verzameld uit enkele cellen of zeer hoge frequentie van genetische veranderingen worden gemeten 8. Hele genoom-analyse van individuele cellen levert substantiële datasets voor onderzoek naar mutatie accumulatie, maar fenotypische selectie systemen hebben het belangrijke voordeel van het verstrekken van een middel van het meten van mutatie tarieven om mechanismen te bestuderen onderliggende mutatie accumulatie. Studies naar mutatie frequenties en tarieven door middel van fenotypische selecties in haploi onderzoekend giststammen bij replicatieve veroudering nog niet gemeld. Mutatie tarieven worden meestal gemeten met behulp van fluctuatie testen 9. Mutation frequentiewaarden de totale aantal cellen die een mutatie in een gen sequentie in een populatie. Dit omvat cellen die onafhankelijk mutaties optreden en alle kalveren van die cellen die eenvoudig erven bestaand mutaties. Daarentegen mutatiesnelheden gemeten door fluctuatie proeven geven het aantal onafhankelijke mutaties die pas ontstaan ​​waarbij elke cel generatie. Deze tests omvatten typisch inoculeren vele duplokweken bij lage celdichtheden de waarschijnlijkheid van het toevoegen cellen met bestaande mutaties in een doelsequentie, groeit de culturen dichtbij verzadiging en identificeren mutante cellen door groei op selectief medium te verminderen. Het aantal mutante cellen die in de herhaalde populaties worden dan gebruikt in een van de mathematische modellen om het aantal i schattenONAFHANKELIJKE mutaties die ontstaan ​​tijdens de groei 9. Vergelijking van het aantal onafhankelijke mutaties de gemiddelde populatiegrootte verschaft een maat van de mutaties. In S. cerevisiae, mutatie-frequenties en de tarieven worden vaak gemeten met de URA3- en CAN1 genen, omdat het verlies-van-functie mutaties in deze genen produceren selecteerbare fenotypes. Verlies van URA3 functie maakt, bestand tegen 5-fluororotinezuur (5-FOA), aangezien de proteïne gecodeerd door URA3 zet 5-FOA een toxische molecule 10. Functieverlies van CAN1 maakt cellen resistent canavanine een toxische arginine analoog worden, aangezien de proteïne gecodeerd door CAN1 transports arginine en canavanine in cellen 11. Zowel genetische en fysische sortering strategieën zijn met succes toegepast om grotere populaties van S. vinden cerevisiae moeder cellen te onderzoeken van replicatieve veroudering te vergemakkelijken. Genetische strategieën omvatten slimme benaderingen die kiest tegen dochter overleving van cellen in een populatie. De moeder verrijking programma (MEP) omvat beta-estradiol inductie van Cre recombinase expressie alleen in dochtercellen, waardoor dochter-specifieke verstoring van twee essentiële genen die werden om loxP plaatsen 12 bevatten. MEP stammen kunnen gewoonlijk worden gekweekt in de afwezigheid van de induceerder, maar alleen de moeder cellen blijven delen na inductie, terwijl dochtercellen zullen arresteren M-fase meestal tijdens de eerste progressie door de celcyclus 12. Hoewel dit systeem niet gebruikt globaal onderzoek mutatie accumulatie tijdens veroudering, is het gebruikt om verlies van heterozygositeit, relatief frequente vorm van genoom instabiliteit in diploïde giststammen, en biochemische veranderingen bij verouderen moedercellen 13,14 bestuderen. Ook de dochter-afleider systeem omvat dochter-specifieke expressie van de S. cereviSIAE URA3-gen 15. Dochter-afleider stammen groeien normaal tot 5-FOA wordt toegevoegd aan het medium, waarna dochtercellen expressie URA3 sterven, terwijl moedercellen blijven groeien 15. Dit zijn bruikbare systemen te verrijken voor moedercellen, maar afhankelijk handhaving van de genfuncties het selectiesysteem vormt. Willekeurige mutaties in een of meer bestanddelen van het selectiesysteem kan resulteren in dochtercellen die de selectie ontsnappen en vermenigvuldigen exponentieel. Tijdens de ontwikkeling van de MEP-stammen, de juiste omvang van de bevolking was vastbesloten om het uiterlijk van de mutant dochter cellen die de selectie 12 kon ontsnappen te voorkomen. Echter, deze limiet in grootte van de populatie afbreuk doet aan de opsporing van zeldzame vormen van het genoom instabiliteit tijdens replicatieve veroudering. Deze beperking maat populatie kan gedeeltelijk worden overwonnen door diploïde giststammen met twee kopieën van elk gen dragen aan het selectiesysteem, omdat de meestemutaties zou waarschijnlijk recessief 12. Echter, gebruik van diploïde stammen beperkt de typen mutatie gebeurtenissen die gemakkelijk gedetecteerd kunnen worden vergeleken met die die gemakkelijk gedetecteerd kunnen worden in haploïde gistcellen. Fysieke sorteren strategieën omvatten isolatie van de moeder cellen met een gelabelde celoppervlak van ongelabelde dochter cellen te verrijken voor grote populaties van de moeder cellen. De waarneming dat celoppervlakeiwitten (celwandeiwitten) van S. cerevisiae dochter cellen zijn nieuw gesynthetiseerde tijdens ontluikende werd misbruikt om de moeder cellen te labelen zonder het labelen van de dochter cellen die ze produceren 16. Bijvoorbeeld kan een eerste populatie van gistcellen op hun oppervlak gemerkt met biotine worden gekweekt en geïsoleerd van de dochtercellen behulp van anti-biotine microbolletjes en magnetische sortering 16 omdat de dochtercellen die door de initiële populatie niet biotine bevatten op hun oppervlak . Serial groei ensorteren laat geleidelijk oudere populaties van de moeder cellen worden verkregen en geanalyseerd. Deze procedure is met succes gebruikt om veranderingen in celfysiologie en genexpressie bij replicatieve veroudering gist 13,14,17,18 onderzoeken. De huidige methode past dit biotine etikettering en magnetische sortering techniek te verrijken moedercellen met het meten van de accumulatie van potentieel zeldzame mutaties of andere instabiliteit van het genoom getest door fenotypische selectie. Serial groei en fysische sortering analysesystemen mutatie accumulatie in geleidelijk oudere moedercellen, alsmede in hun dochter celpopulaties. Bepaling van het aantal mutaties per generatie laat een voorspelde mutatie frequentie te worden berekend voor de moeder cellen die een bepaald aantal celdelingen hebben ondergaan. Aangezien voorspelde frequentiewaarden zijn gebaseerd op de verwachte toename door aanvullende ronden van celdeling aanzienlijke afwijkingen in de waargenomen Mutatiop frequenties in vergelijking met de voorspelde waarden leveren bewijs voor de leeftijd-specifieke veranderingen in de snelheid van de accumulatie van mutaties. Met behulp van dit protocol, kunnen fluorescerende kleuring van bud littekens die overeenkomen met plaatsen van celdelingen op moeder cellen in combinatie met analyse door flowcytometrie worden gebruikt om snel te bepalen van de leeftijdsverdeling van gesorteerde en ongesorteerde populaties. Aanvullende fluorescente reagentia, zoals die gebruikt voor het detecteren van reactieve zuurstof species, kunnen ook worden gebruikt in deze protocol. Over het algemeen is dit protocol maakt een efficiënte analyse van de leeftijd-afhankelijke veranderingen in het genoom instabiliteit met het potentieel voor correlatie met leeftijd-gerelateerde cel fysiologische veranderingen in een modelorganisme goed geschikt is voor het bestuderen van de genetische en omgevingsfactoren die de vergrijzing samenhangende genoom instabiliteit beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Anti-Biotin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>2 ml MicroBeads geconjugeerd met monoklonale muis anti-biotine antilichamen (isotype: muis IgG1)</td></tr><tr><td>MACS LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>25 kolommen geschikt voor QuadroMACS separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Alleen Separator</td></tr><tr><td>QuadroMACS Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td>Inclusief: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Kolommen (130-042-401), MACS 15 ml Tube Rack (130-091-052), Eén 2 ml eenheid van MACS MicroBeads. Opmerking: Alternatieve systemen omvatten Dynabeads Biotin Binder en MagnaBind Magnetische Kralen</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer, 40 &micro;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td>40 &micro;m voor gebruik met BD Falcon 50 ml Conische Tubes. 50 per pakket</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>Poeder, filteren na oplossen is belangrijk om deeltjes te verwijderen</td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488</td><td>Life Technologies</td><td>W11261</td><td>Conjugaten met verschillende excitatie/emissiespectra kunnen ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>10 ml, andere antifade reagentia kunnen ook worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

de combinatie van magnetische sorteren van moeder cellen en schommelingen tests om genome instabiliteit tijdens mitose aging in analyze saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is een uitstekend modelsysteem geweest voor het onderzoek van de mechanismen en gevolgen van het genoom instabiliteit. Informatie verkregen uit deze gist model is voor veel organismen, inclusief de mens relevant, omdat DNA-herstel en DNA schade respons factoren goed zijn geconserveerd in diverse soorten. Echter, S. cerevisiae is nog niet gebruikt om volledig te pakken of de snelheid van de accumulatie van mutaties veranderingen met toenemende replicatie (mitotische) leeftijd als gevolg van technische beperkingen. Zo metingen gist replicatieve levensduur door micromanipulatie meestal zeer geringe populaties van cellen, die detectie van zeldzame mutaties verbieden. Genetische methoden verrijken moedercellen in populaties door het induceren dood van dochtercellen ontwikkeld, maar populatiegrootte nog beperkt door de frequentie waarmee willekeurige mutaties die de selectiesystemen gevaar komen. Het huidige protocol maakt gebruik van magnetische sorting oppervlak gelabelde gist moedercellen te stellen een populaties van veroudering moedercellen zeldzame mutaties kwantificeren door fenotypische selectie te verkrijgen. Mutatiesnelheden gemeten door fluctuatie proeven en mutatiefrequentie worden eerst ingevoerd voor jonge cellen en gebruikt om de mutatiefrequentie in moedercellen van verschillende leeftijden replicatieve voorspellen. Mutatie frequenties worden vervolgens voor gesorteerde moedercellen en de leeftijd van de moeder cellen wordt bepaald middels flowcytometrie door kleuring met fluorescent reagens dat bud littekens gevormd op het celoppervlak gedurende celdeling detecteert. Vergelijking van de voorspelde mutatiefrequentie basis van het aantal celdelingen de frequenties experimenteel waargenomen voor moedercellen van een bepaalde replicatieve leeftijd kan dan vaststellen of er leeftijdsgebonden veranderingen van de accumulatie van mutaties. Variaties van deze basisprotocol de middelen om de invloed van veranderingen in specifieke genfuncties onderzoeken ofspecifieke milieu-omstandigheden op mutatie accumulatie mechanismen pakken onderliggende genoom instabiliteit tijdens replicatieve veroudering.

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te bepalen of veranderingen in mutatiefrequenties met een verhoogde replicatieve leeftijd van gistcellen alleen te wijten zijn aan extra rondes van celdeling of aan leeftijdsspecifieke veranderingen in de snelheid van accumulatie van mutaties. Dit wordt bereikt door eerst mutatiefrequenties en -snelheden in jonge cellen te meten door cellen op selectieve en niet-selectieve media te spreiden om een ​​voorspelde mutatiefrequentie te berekenen voor cellen van toenemende leeftijden als gevolg van mutatieaccumulatie bij elke ronde celdeling.Vervolgens wordt een gistcelpopulatie gelabeld met biotine gekweekt in vloeibare cultuur en de originele gelabelde cellen worden hersteld door magnetisch sorteren om verouderde moedercellen te verkrijgen die meerdere celdelingen hebben ondergaan. Dan worden verouderde moedercellen opnieuw gekweekt om hun leeftijd te verhogen en vervolgens opnieuw gesorteerd of gekleurd voor butscars en vervolgens verspreid op selectieve en niet-selectieve media om hun gemiddelde replicatieve leeftijd en mutatiefrequentie te bepalen. Er worden resultaten verkregen die laten zien of er leeftijdsspecifieke toenames of afnames zijn in de accumulatie van mutaties op basis van een vergelijking van de experimenteel waargenomen mutatiefrequentie met de voorspelde mutatiefrequentie voor cellen van de waargenomen gemiddelde leeftijd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van veroudering te beantwoorden, zoals of veranderingen in de snelheid van accumulatie van genetische schade bijdragen aan normale veroudering, of dat de levensduur veranderende effecten van verschillende genetische en omgevingsfactoren, gedeeltelijk te wijten zijn aan veranderingen in mutatiesnelheden.Melissa Patterson, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om een basislijn mutatiesnelheid per celgeneratie vast te stellen met behulp van fluctuatietests voor cellen gekweekt onder standaard kweekcondities. Voor elke replicaatcultuur verdunt cellen één op 2000 en spreidt één tot vier microliters uit op niet-selectief medium om kolonievormingseenheden per milliliter te bepalen. Pel de resterende cellen bij 2.400 Gs gedurende één minuut in een microcentrifuge en gebruik 100 microliter water om ze op te schalken voordat ze op selectief medium worden verspreid om mutanten te identificeren.Nadat de platen gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius zijn geïncubeerd, telt u de kolonies om de initiële mutatiesnelheid en -frequentie te bepalen volgens het bijbehorende tekstprotocol om charmy CCI met biotin te labelen. Begin met het uitstrekken van de cultuur van een glycerolstock op YPD-medium en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende één tot drie dagen. Gebruik een steriele pipettip om cellen van de plaat over te brengen naar ten minste één milliliter water. Houd er rekening mee dat één tot anderhalve centimeter van een dik begroeide portie van de streek ongeveer 10 tot de achtste cellen zal geven.Gebruik een hemo cytometer om de exacte celdichtheid voor elke stam of behandelingsconditie te bepalen. Gebruik een vijf millimeter biotin reagens stock om 10 tot de achtste cellen per verzamelpunt te labelen volgens de standaardprocedure van de fabrikant. Voer alle centrifugatie stappen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius uit na de laatste wassing.Gebruik water om de gelabelde cellen op te schalen tot een uiteindelijke concentratie van 10 tot de achtste cellen per milliliter om de celviabiliteit te controleren om 10 microliter cellen te verdunnen met 23 microliter water en 67 microliter 0,4% Triam blauw in één XPBS, incubeer de cellen gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur voordat u een hemo cytometer gebruikt om levende of ongekleurde en dode of gekleurde cellen te scoren. Na het meten van basiswaarden voor celleeftijd en mutatiefrequentie, volgens het tekstprotocol, brengt u de biotin gelabelde cellen over naar 20 milliliter YPD-medium. Doe alsof u de achtste cellen bent.Laat de culturen 16 tot 18 uur groeien bij 20 graden Celsius tot ongeveer 10 tot de achtste cellen per milliliter. Laat de cellen niet de stationaire fase bereiken en houd de cellen indien nodig enkele uren bij vier graden Celsius om het tijdstip van de groeiperiode en verzameling te optimaliseren. Na het bepalen van de celdichtheid en het pelleten van de cellen bij vier graden Celsius, was de cellen door 30 milliliter bead label buffer toe te voegen en te vortexen, draai de suspensie en giet het supernatant af.Na een tweede wassing, schorsen we de cellen in 50 microliter bead label buffer. Doe alsof je de achtste totaal cellen bent door te vortexen. Voeg twee microliter magnetische kralen toe, doe alsof je de achtste totaal cellen bent en na het kortstondig vortexen, breng op ijs gedurende 10 minuten aan, periodiek kerend.Gebruik vervolgens 30 milliliter bead label buffer om de cellen drie keer te wassen. Voeg vervolgens 0,5 milliliter bead label buffer toe. Doe alsof je de achtste totaal cellen bent en vortex de pellet kort op een medium instelling totdat de cellen opnieuw zijn opgeschort.Giet de suspensie door een 40 micron celzeef in een 50 milliliter buis om eventuele resterende celklonten te verwijderen. Laat de cellen indien nodig één tot twee uur op ijs staan ​​voordat u ze op de kolom laadt. Volg het aanbevolen protocol van de fabrikant voor de magnetische kolommen met maximaal twee keer 10 tot de negende totaal cellen per.Zorg ervoor dat u alle lucht verwijdert wanneer u de kolommen laadt en verwijder en vervang de kolom op de scheider tussen wasbeurten om te voorkomen dat cellen tussen de kralen worden vastgehouden. Wanneer u meervoudige kolomscheiders gebruikt voor het verwerken van meerdere kolommen van hetzelfde monster, elueer ze allemaal in dezelfde verzamelbuis om de tijd voor verwerking te verkorten en het verlies van cellen te verminderen indien gewenst. Bewaar de doorstroming van de bindings- en wasstappen om jonge cellen te analyseren die door de moedercellen zijn geproduceerd na concentratie van de cellen door centrifugatie bij 3000 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, aspireer alles behalve één milliliter buffer.Doe alsof je de acht originele biotin gelabelde cellen bent. Vorm vervolgens kort voor het opschalken van de

combining-magnetic-sorting-mother-cells-fluctuation-tests-to-analyze

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Het begrijpen van de endogene moleculaire veranderingen in volwassen stamcellen tijdens veroudering vereist het isoleren van de cellen van belang. De hier beschreven methode presenteert een eenvoudige en robuuste aanpak om Drosophila intestinale stamcellen en de enteroblast-voorlopercellen op elk tijdstip tijdens veroudering te verrijken en te isoleren door middel van FACS.

Het isoleren van Intestinale stamcellen van volwassen Drosophila Midguts door FACS om Stem Cell gedrag te bestuderen tijdens veroudering

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer hoe je magnetisch sorteren en fluctuatietests combineert om genoominstabiliteit tijdens mitotische veroudering te analyseren in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers mutatieaccumulatie in oude moedercellen te begrijpen.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

Meer video's verkennen