De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae
16 oktober 2014
Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om te bepalen of veranderingen in mutatiefrequenties met een verhoogde replicatieve leeftijd van gistcellen alleen te wijten zijn aan extra rondes van celdeling of aan leeftijdsspecifieke veranderingen in de snelheid van accumulatie van mutaties. Dit wordt bereikt door eerst mutatiefrequenties en -snelheden in jonge cellen te meten door cellen op selectieve en niet-selectieve media te spreiden om een voorspelde mutatiefrequentie te berekenen voor cellen van toenemende leeftijden als gevolg van mutatieaccumulatie bij elke ronde celdeling.
Vervolgens wordt een gistcelpopulatie gelabeld met biotine gekweekt in vloeibare cultuur en de originele gelabelde cellen worden hersteld door magnetisch sorteren om verouderde moedercellen te verkrijgen die meerdere celdelingen hebben ondergaan. Dan worden verouderde moedercellen opnieuw gekweekt om hun leeftijd te verhogen en vervolgens opnieuw gesorteerd of gekleurd voor butscars en vervolgens verspreid op selectieve en niet-selectieve media om hun gemiddelde replicatieve leeftijd en mutatiefrequentie te bepalen. Er worden resultaten verkregen die laten zien of er leeftijdsspecifieke toenames of afnames zijn in de accumulatie van mutaties op basis van een vergelijking van de experimenteel waargenomen mutatiefrequentie met de voorspelde mutatiefrequentie voor cellen van de waargenomen gemiddelde leeftijd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van veroudering te beantwoorden, zoals of veranderingen in de snelheid van accumulatie van genetische schade bijdragen aan normale veroudering, of dat de levensduur veranderende effecten van verschillende genetische en omgevingsfactoren, gedeeltelijk te wijten zijn aan veranderingen in mutatiesnelheden.
Melissa Patterson, een afgestudeerde student in mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Om een basislijn mutatiesnelheid per celgeneratie vast te stellen met behulp van fluctuatietests voor cellen gekweekt onder standaard kweekcondities. Voor elke replicaatcultuur verdunt cellen één op 2000 en spreidt één tot vier microliters uit op niet-selectief medium om kolonievormingseenheden per milliliter te bepalen. Pel de resterende cellen bij 2.400 Gs gedurende één minuut in een microcentrifuge en gebruik 100 microliter water om ze op te schalken voordat ze op selectief medium worden verspreid om mutanten te identificeren.
Nadat de platen gedurende drie dagen bij 30 graden Celsius zijn geïncubeerd, telt u de kolonies om de initiële mutatiesnelheid en -frequentie te bepalen volgens het bijbehorende tekstprotocol om charmy CCI met biotin te labelen. Begin met het uitstrekken van de cultuur van een glycerolstock op YPD-medium en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende één tot drie dagen. Gebruik een steriele pipettip om cellen van de plaat over te brengen naar ten minste één milliliter water. Houd er rekening mee dat één tot anderhalve centimeter van een dik begroeide portie van de streek ongeveer 10 tot de achtste cellen zal geven.
Gebruik een hemo cytometer om de exacte celdichtheid voor elke stam of behandelingsconditie te bepalen. Gebruik een vijf millimeter biotin reagens stock om 10 tot de achtste cellen per verzamelpunt te labelen volgens de standaardprocedure van de fabrikant. Voer alle centrifugatie stappen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius uit na de laatste wassing.
Gebruik water om de gelabelde cellen op te schalen tot een uiteindelijke concentratie van 10 tot de achtste cellen per milliliter om de celviabiliteit te controleren om 10 microliter cellen te verdunnen met 23 microliter water en 67 microliter 0,4% Triam blauw in één XPBS, incubeer de cellen gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur voordat u een hemo cytometer gebruikt om levende of ongekleurde en dode of gekleurde cellen te scoren. Na het meten van basiswaarden voor celleeftijd en mutatiefrequentie, volgens het tekstprotocol, brengt u de biotin gelabelde cellen over naar 20 milliliter YPD-medium. Doe alsof u de achtste cellen bent.
Laat de culturen 16 tot 18 uur groeien bij 20 graden Celsius tot ongeveer 10 tot de achtste cellen per milliliter. Laat de cellen niet de stationaire fase bereiken en houd de cellen indien nodig enkele uren bij vier graden Celsius om het tijdstip van de groeiperiode en verzameling te optimaliseren. Na het bepalen van de celdichtheid en het pelleten van de cellen bij vier graden Celsius, was de cellen door 30 milliliter bead label buffer toe te voegen en te vortexen, draai de suspensie en giet het supernatant af.
Na een tweede wassing, schorsen we de cellen in 50 microliter bead label buffer. Doe alsof je de achtste totaal cellen bent door te vortexen. Voeg twee microliter magnetische kralen toe, doe alsof je de achtste totaal cellen bent en na het kortstondig vortexen, breng op ijs gedurende 10 minuten aan, periodiek kerend.
Gebruik vervolgens 30 milliliter bead label buffer om de cellen drie keer te wassen. Voeg vervolgens 0,5 milliliter bead label buffer toe. Doe alsof je de achtste totaal cellen bent en vortex de pellet kort op een medium instelling totdat de cellen opnieuw zijn opgeschort.
Giet de suspensie door een 40 micron celzeef in een 50 milliliter buis om eventuele resterende celklonten te verwijderen. Laat de cellen indien nodig één tot twee uur op ijs staan voordat u ze op de kolom laadt. Volg het aanbevolen protocol van de fabrikant voor de magnetische kolommen met maximaal twee keer 10 tot de negende totaal cellen per.
Zorg ervoor dat u alle lucht verwijdert wanneer u de kolommen laadt en verwijder en vervang de kolom op de scheider tussen wasbeurten om te voorkomen dat cellen tussen de kralen worden vastgehouden. Wanneer u meervoudige kolomscheiders gebruikt voor het verwerken van meerdere kolommen van hetzelfde monster, elueer ze allemaal in dezelfde verzamelbuis om de tijd voor verwerking te verkorten en het verlies van cellen te verminderen indien gewenst. Bewaar de doorstroming van de bindings- en wasstappen om jonge cellen te analyseren die door de moedercellen zijn geproduceerd na concentratie van de cellen door centrifugatie bij 3000 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, aspireer alles behalve één milliliter buffer.
Doe alsof je de acht originele biotin gelabelde cellen bent. Vorm vervolgens kort voor het opschalken van de
Overzicht
Deze studie onderzoekt mutatiesnelheden in jonge Saccharomyces cerevisiae-cellen en hoe deze snelheden veranderen met de replicatieve leeftijd van moedercellen. Door gebruik te maken van fluctuatietests, magnetische sortering en flowcytometrie, beoogt het onderzoek voorspelde mutatiefrequenties te vergelijken met werkelijke metingen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Genetica
- Celbiologie
- Ouderdomsonderzoek
Achtergrond
- Mutatiesnelheden kunnen invloed hebben op veroudering en cellulaire functies.
- Inzicht in de accumulatie van mutaties is cruciaal voor het begrijpen van verouderingsprocessen.
- Gist dient als modelorganisme voor het bestuderen van genetische mutaties.
- Fluctuatietesten bieden een methode voor het schatten van mutatiefrequenties.
Doel van de studie
- Om vast te stellen of veranderingen in de mutatiefrequentie te wijten zijn aan celdeling of aan leeftijdsspecifieke accumulatie van mutaties.
- Om een baseline-mutatiesnelheid vast te stellen voor jonge gistcellen.
- Om voorspelde en waargenomen mutatiefrequenties in verouderde moedercellen te vergelijken.
Gebruikte methoden
- Fluctuatietests om mutatiesnelheden in jonge cellen te meten.
- Magnetische sortering om verouderde moedercellen te isoleren.
- Flowcytometrie om celouderdom en mutatiefrequentie te beoordelen.
- Kolonietelling op selectieve en niet-selectieve media om mutatiesnelheden te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Geobserveerde mutatiefrequenties werden vergeleken met voorspelde waarden.
- Leeftijdspecifieke veranderingen in mutatiesnelheden werden geïdentificeerd.
- De methodologie maakte effectief onderscheid tussen jonge en verouderde cellen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van genetische schade bij veroudering.
Conclusies
- Mutatieaccumulatie wordt beïnvloed door de replicatieve leeftijd in gistcellen.
- Veranderingen in mutatiesnelheden kunnen bijdragen aan het verouderingsproces.
- De studie biedt een kader voor toekomstig onderzoek naar veroudering en genetica.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dit protocol stelt biofarmaceutische R&D in staat om ouderdomsgerelateerde veranderingen in mutatieaccumulatie te kwantificeren, waarbij gist wordt gebruikt als ziekterevlevant systeem voor mechanistishe risicoanalyse van mechanismen van genomische instabiliteit. Door magnetische sortering van moedercellen te combineren met fluctuatietests, biedt het voorspellende betrouwbaarheid bij het onderscheiden van replicatie-afhankelijke mutatieaccumulatie van ouderdomsspecifieke mutationele processen, wat de validatie van targets in ouderdomsgerelateerde pathways ondersteunt. De benadering levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen die bijdragen aan de selectie van preklinische modellen en de ontdekking van translationele biomarkers voor interventies gericht op genoomstabiliteit.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de vraag of een toegenomen mutatielast bij het ouder worden voortkomt uit extra celdelingen of gewijzigde mutagenesitesnelheden.
- Operationele waarde: Maakt grootschalige isolatie van verouderde moedercellen mogelijk via magnetische sortering, waardoor de beperkingen van traditionele micromanipulatie voor de detectie van zeldzame gebeurtenissen worden overwonnen.
- Voorspellende waarde: Maakt gebruik van gegevens uit fluctuatietests van jonge cellen om mutatiefrequenties te voorspellen, wat helpt bij het vaststellen of waargenomen veranderingen een weerspiegeling zijn van werkelijke leeftijdsspecifieke mutagenese.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare populaties moedercellen met gedefinieerde replicatieve leeftijden voor downstream fenotypische screening.
- Kwantitatieve output: Genereert gegevens over de mutatiefrequentie via fluctuatietesten, wat dose-responsanalyse of analyse van genetische perturbaties in verouderingsmodellen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Magnetische sortering maakt het herstel van voldoende celgetallen mogelijk voor statistische kracht in fluctuatie-assays, wat de reproduceerbaarheid van de assay over verschillende condities ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Gebruikt S. cerevisiae als een geconserveerd model om mechanismen van de DNA-schaderespons te bestuderen die vertaalbaar zijn naar menselijke veroudering en kankergevoeligheid.
- Mechanische risicoreductie: Maakt onderscheid tussen passieve accumulatie van mutaties en actieve, leeftijdsafhankelijke mutagenese, wat bijdraagt aan de selectie van targets voor pathways van genoomstabiliteit.
- Translationele continuïteit: Verbindt replicatieve leeftijd (via kwantificering van knoplittekens) met functionele read-outs van mutagenese, ter ondersteuning van preklinische validatie die is afgestemd op biomarkers.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen vroege ontdekkings- en preklinische workflows door een genetisch hanteerbaar systeem te bieden om te evalueren hoe veroudering de mutatiesnelheden beïnvloedt, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen voor targets in DNA-herstel, chromatineregulatie of mitotische getrouwheid.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests over de vraag of levensduurpaden de mutagenese beïnvloeden, onafhankelijk van de replicatiegeschiedenis.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve outputs van de mutatiefrequentie voor het screenen van verbindingen of genetische bibliotheken in op leeftijd gestratificeerde cellen.
- Analytica: Op fluctuatietesten gebaseerde mutatiesnelheden maken statistische vergelijking van condities mogelijk, waardoor teams prioriteit kunnen geven aan hits met leeftijdsspecifieke effecten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt replicatieve veroudering in gist met geconserveerde mutagenesemechanismen, wat extrapolatie naar mammalian preklinische modellen ondersteunt.
- Enterprise hergebruik: Magnetische sortering en fluctuatietesten vormen een modulair platform dat toepasbaar is op studies naar gen-knock-out, omgevingsstress of behandeling met verbindingen bij veroudering.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in verouderingsonderzoek door replicatie-afhankelijke mutatieaccumulatie te scheiden van leeftijdsspecifieke mutatieaccumulatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van moedercellen en de kwantificering van de leeftijd, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en experimentele batches wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Informeert kapitaalefficiënte prioritering van targets door te valideren of anti-aging verbindingen mutagenese beïnvloeden buiten de effecten van proliferatie.
- Impact op portfolio: Maakt een risico-gecorrigeerde vooruitgang van targets voor genoomstabiliteit mogelijk op basis van mechanisch bewijs van leeftijdgerelateerde mutationele verschuivingen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in gistgenetica, magnetische cel sortering en de methodologie van fluctuatietests.
- Afhankelijk van flowcytometrie- of microscopie-infrastructuur voor kwantificering van de leeftijd op basis van knoplittekens.
- Vereist standaardisatie van biotinylering en magnetische kraal-scheiding om contaminatie door jonge cellen te minimaliseren.
- Aanpassing aan niet-gist-systemen kan alternatieve strategieën voor oppervlaktemarkering en leeftijdsdetectie vereisen.
- Beperkt door de noodzaak om de stationaire fase uit te sluiten en logaritmische groei te behouden voor nauwkeurige sortering op leeftijd.
