Name: Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Ontdek laser-capture microdissectie van reukneuronen uit neusbiopsie voor onderzoek naar lithiumrespons bij bipolaire stoornis. Deze methode analyseert genexpressie in neuronale populaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door USPHS-subsidies MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte-centrum (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), en MH-096208 (K.I.), subsidies van DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R-stichtingen (A.S.), NARSAD (A.S. en K.I.), en Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. en K.I.).
We waarderen de inspanningen en bijdragen van Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema en Mark Christie voor de coördinatie van het biopsieproces oprechte.

OPMERKING: Alle onderzoek vrijwilligers in deze studie werden toegediend geïnformeerde toestemming documenten door de Institutional Review Board van Howard University en de Johns Hopkins University goedgekeurd. Alleen deelnemers die door ondertekening van de geïnformeerde toestemming documenten ingestemd werden opgenomen in de studie. De studie basis voor deze analyse bestond uit: 20 proefpersonen (12 BD en 10 controles; 30% van de mannen) en de gemiddelde leeftijd (sd) van 38,2 (14,1) jaar. OPMERKING: Spuit alle oppervlakken met RNase Zap om RNase vervuiling van glas en kunststof oppervlakken te verwijderen. 1. biopsieprocedure <ol><li> Spray actuele lidocaïne (Xylocaine) vloeibare 4% en oxymetazoline HCl 0,05% in de neusholte van de studie deelnemer en laat 15 minuten van verdovende tijd. </li><li> Geniet ½ x 3 inch chirurgische cottonoids in een mengsel van lidocaïne en oxymetazoline en plaats in de neusholte langs superieure deel van het neustussenschot en laat 15 minuten wachten. </li><li> Met een 30 ° stijfnasale endoscoop naar het bovenste gedeelte van de neusholte te lokaliseren, te verwijderen neusslijmvlies met behulp van up-bijten neus tang uit het superieure deel van het neustussenschot, waarbij meerdere kleine exemplaren. </li></ol> 2. Voorbereiding van Tissue Blokken <ol><li> Onmiddellijk voorafgaand aan de biopsie, vul standaard formaat cryomolds met weefsel bevriezen medium. </li><li> Met behulp van een autoclaaf pincet, monteren verse weefsel in het ijskoude medium en vries op droog ijs. Vul rest van cryoblock met de bevriezing medium, cryoblock bevriezen op droog ijs, en op te slaan blokken bij -80ºC. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Polyethyleennaftalaat (PEN) membraan glasplaatjes voorbereiden onmiddellijk voor cryosectioning. Spray slides met RNase Zap oplossing gedurende 5 min. Spoel vervolgens dia&#39;s in diethylpyrocarbonaat (DEPC) water en laat aan de lucht drogen gedurende 30 minuten. Activeren gedroogde dia&#39;s onder UV-licht voor 30 minuten. </li><li> Cryosectie elk blok volledig bij 30 micrometer. Houd dia&#39;s op een droge ice, en secties bevroren zoveel mogelijk. Bewaren glijbanen bij -80 ºC na voltooiing. </li></ol> 4. Laser-Capture Microdissection <ol><li> Begin met het ontwateren dia onmiddellijk voorafgaand aan microdissection. Laat bevroren dia&#39;s ontdooien gedurende 10 sec, en dan gelden de volgende ethanol serie aan elke dia: 60% (2 ml, 15 sec), 80% (2 ml, 15 sec), 95% (3 ml, 25 sec), 100 % (7 ml, 60 sec). </li><li> Draai gefotoactiveerd lokalisatie microscopie (PALM) microscoop op en stel de volgende voorwaarden: Voor 10x vergroting zet de energie om 82, richten zich tot 74, en de snelheid tot 25 - 30. Voor een vergroting van 20x, zet de energie om 63, richten zich tot 67, en snelheid tot 5 - 6. zo nodig aanpassen om een ​​optimale snij-resultaten te verkrijgen. </li><li> Visueel identificeren neuronen met behulp van 20X of 10X vergroting. Onderscheid de dunne oppervlakte olfactorische zenuw laag van onderliggende submucosa onder een microscoop zonder het gebruik van kleuring procedure. Observeren neuronen als een dichte zuilvormige uiterlijk 18.</li><li> De functie Potlood in voornoemde microscoop in stap 4.2, sporen rond de neuronale laag. Traceren iets weg van neuronen te verbranden van neuronen van de laser te voorkomen. Dit is essentieel voor een hoge kwaliteit RNA. Dan starten lasergeleide snijden. </li><li> Pick-up ontleed secties met behulp van fijne punt microdissection tang en zet weefsel in een microbuisjes met 100 ul lysis buffer op ijs. Herhaal dit voor alle neuronale secties verkregen uit een enkel monster. Totale dissectie tijd per monster mag niet meer dan 50 min. </li><li> Zodra dissectie is voltooid, onmiddellijk vortex monster lysaten en blijf op droog ijs. Store monsters bij -80ºC voor totaal RNA isolatie. </li></ol> 5. Isolatie van totaal RNA en Quality Control Analyse <ol><li> Dooi monster lysaten op ijs. Het uitvoeren van totaal RNA isolatie met RNAqueous Micro Kit met DNase-I inactivatie door het volgen van het protocol van de fabrikant zonder wijzigingen (zie &lt;strong&gt; Figuur 1). De totale elutievolume is ongeveer 20 pl. </li><li> Meet RNA concentratie en RNA kwaliteit te evalueren met RNA Integriteit Number (RIN) met behulp van Bioanalyzer. Monsters die aan de kwaliteitscontrole criteria in figuur 2 kan worden gebruikt voor cDNA-synthese. </li></ol> 6. cDNA Synthesis <ol><li> Synthetiseren cDNA met behulp van een gevalideerde commerciële kit (zie tabel van reagentia). Voer de annealing stap combineren 0,1-1,0 ng RNA (afhankelijk van beschikbaarheid) en RNase vrij water tot een totaal volume van 8 pi per buis. Voeg vervolgens 1 pl oligo d (T) 20 primer en 1 pl 10 mM dNTP mix per buis, voor een totaal volume van 10 pl. </li><li> Voorzichtig vortex en centrifugeer monsters en gloeien monsters bij 65 ° C gedurende 5 min. Nadat de reactie is voltooid, onmiddellijk koel monsters op ijs. </li><li> Bereid master mix oplossing volgens de specificaties in tabel 1. Voeg vervolgens 9,5 μl master mix en 0,5 ul van commercieel bereide reverse transcriptase (RT) aan elke buis. Voeg 0,5 ul RNase vrij water aan de buis in plaats van RT beheersen. </li><li> Voer een RT-reactie met de eerste incubatie bij 50 ° C gedurende 50 min, vervolgens 85 ºC gedurende 5 minuten en een laatste 4 ºC te houden, zonder fietsen. </li><li> Verdunnen alle monsters door 5x met water en hoeveelheid. Store monsters bij -80 ºC. </li></ol> 7. Real Time PCR - Bevestig Neuronal Verrijking <ol><li> Bereid de master mix oplossing volgens voorschrift in tabel 2. Gebruik een interne controle zoals GAPDH. Vergelijk olfactorische marker eiwit (OMP) expressie in gemicrodissecteerde weefsel met OMP meningsuiting in undissected weefsel om neuronale verrijking te bepalen. OPMERKING: OMP is een marker voor olfactorische neuronen. OMP volgorde: vooruit, 5&#39;-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 &#39; reverse, 5&#39;-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 &#39; GAPDH volgorde: vooruit, 5&#39;-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 &#39; reverse, 5&#39;-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 &#39;. </li><li> Opgezet PCR-plaat door het toevoegen van 7 pi master mix in elk putje en 3 pi cDNA. </li><li> Centrifuge plaat gedurende 5 minuten bij 300 g (1300 rpm). Run Realtime-PCR-reactie met behulp van de standaard thermische cycli voorwaarden gespecificeerd voor commerciële supermix zoals SYBR groener qPCR. </li><li> Analyseren van gegevens (zie figuur 2 voor specificaties). </li></ol> 8. Real Time PCR - expressie van genen of Interest <ol><li> Voer op monsters die neuronale verrijking van 2 maal of meer vertonen. </li><li> Bereid master mix op ijs voor elke sonde (FAM-gelabelde probe van rente en VIC-gelabeld GAPDH-) in aparte buizen volgens de specificaties in tabel 3. </li><li> Het opzetten van een PCR-plaat met 8 pi master mix in elk putje en 2 pl cDNA. </li><li> Centrifugeer de plaat gedurende 5 min bij 300 g (1300 rpm). Run Real Time-PCR-reactie met behulp van de default thermale cycli condities volgens de genexpressie master mix protocol van de fabrikant. Analyseer uitdrukking resultaten (zie figuur 2 voor specificaties). </li></ol>

<ol><li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+FK+%22Manic-depressive+illness%22">Manic-depressive illness</a>. , Oxford University Press. (1990).</li>
<li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+cascades%3A+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li>
<li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li>
<li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+%28LiTMUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles%3A+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li>
<li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish%2C+Sphyrna+tiburo%3A+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li>
<li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li>
<li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia%3A+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li>
<li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry%3A+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li>
<li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li>
<li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells%3A+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li>
<li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4%2FCxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li>
<li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li>
<li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li>
<li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li>
<li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia%3A+individual+and+age+related+variations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572(2009).</li>
<li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses%3A+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Nurnberger, J. I. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale%2C+unique+features%2C+and+training%5BTitle%5D)+AND+%22NIMH+Genetics+Initiative.+Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li>
<li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li>
<li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rating+scale+for+mania%3A+reliability%2C+validity+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li>
</ol>

De auteurs melden geen financiële relaties met commerciële belangen.

Een nieuw platform voor het verkrijgen van verrijkte olfactorische neuronale lagen combineert nasale biopsie en LCM wordt gepresenteerd en is gevalideerd in deze studie. Deze techniek kan wijdverspreide implicaties hebben. Het kan worden toegepast in de richting van biomarker studies, waaronder die voor de respons op de behandeling, en drug discovery inspanningen voor andere neuropsychiatrische omstandigheden, het maken van een bredere invloed in het veld. Om de hoge kwaliteit neuronen vatba...

Bipolaire stoornis (BD) is een ernstige neuropsychiatrische aandoening, gekenmerkt door pathologische veranderingen in de stemming, rijden en cognitie 1. Lithium gebruikt voor de behandeling van BD is aangetoond steady state mRNA niveaus van een groot aantal genen in dierstudies 2 veranderen, maar blijft het onduidelijk of een van deze moleculen geassocieerd met klinische respons bij de mens 2. Inzicht in het mechanisme van lithium reactie vereist onderzoeken lithium geïnduceerde moleculaire veranderingen in neuronale weefsels. Helaas, het is niet praktisch om het verkrijgen van de hersenen biopten van BD patiënten pre- en post-lithium therapie om moleculaire handtekeningen van lithium respons te identificeren. Post-mortem hersenweefsel zijn gebruikt om biomarkers in BD studie, maar ze kunnen niet worden gebruikt om moleculaire markers die aan dynamische veranderingen in emoties, cognitie en rijden beoordelen; en de geldigheid van achteraf geconstateerde lithium respons op de behandeling kan problematisch zijn 4. Lymfocyten en andere bloedcellen nuttig zou kunnen zijn, maar de moleculaire veranderingen in de bloedcellen kan geen afspiegeling van neuronale veranderingen 3-5. Cerebrospinale vloeistof onvoldoende informatie over intracellulaire moleculen die ziektegeassocieerde en medicatie-reversibele intrinsieke veranderingen kunnen weerspiegelen verkrijgen. De reukepitheel (OE) is een uniek deel van het centrale zenuwstelsel (CZS), embryologically-gerelateerd aan limbische structuren 6; en het is gemakkelijk toegankelijk via nasale biopsieën. Het bestaat uit glial ondersteuningsorgaan (dwz sustentaculaire) cellen, basale prolifererende cellen en olfactorische receptor neuronen in verschillende ontwikkelingsstadia 7-9. Daarom OE biedt een unieke gelegenheid om toegankelijke studeren dynamische veranderingen in het CZS van patiënten met neuropsychiatrische aandoeningen 7. Studies demonstreren het nut van de OE als surrogaat weefsel voor onderzoek ziekte geassocieerde gebeurtenissen die aan occ weerspiegelenurring in de hersenen neuronen 8,9. Zo hebben studies OE gebruikt moleculaire profielen geassocieerd met psychiatrische aandoeningen 10-14 onderzoeken. Olfactorisch systeem dient ook om klinische endophenoytpes zoals tekorten geur die geassocieerd zijn met negatieve symptomen van schizofrenie 15 identificeren. Bovendien, neurologische processen verder in de OE gedurende het hele leven, die een nuttig laan naar het model van de onderliggende pathofysiologie van psychiatrische aandoeningen 8,9. Een nadeel van het gebruik van dit weefsel is de aanzienlijke verontreiniging van olfactorische biopten met niet-neuronale cellen 16. Bijvoorbeeld, totaal RNA voor genexpressie studies in eerdere studies OE bevatten RNA geëxtraheerd uit het gehele nasale biopsie tissue omvattende RNA van niet-neuronale cellen 17. Daarom zijn eerdere benaderingen beperkt door de kwaliteit van de cellen. Om dit probleem te overwinnen, een nieuwe benadering voor het verkrijgen<html> verrijkte neuronale celpopulaties door het combineren van nasale biopsieën met laser-capture microdissectie (LCM) is ontwikkeld 18. LCM is een techniek die het mogelijk maakt de selectieve isolatie van cellen met UV laser snijden in combinatie met infrarood laser 19-21. De combinatie LCM met OE benadering minimaliseert aanzienlijke verontreiniging van OE door niet-neuronale cellen, waarbij verrijking van neuronale cellen 18 verbeteren. Bovendien kan de neuronale lagen worden onderscheiden van de submucosa laag onder een microscoop, waardoor de noodzaak voor kleuring. Neuronale celtypen kan verder worden onderscheiden van andere celpopulaties met primaire antilichamen die worden uitgedrukt door het celtype van belang 7. Daarom is deze werkwijze wordt een eenvoudiger werkwijze voor de verrijking van bijna zuiver neuronale celpopulatie die kunnen worden gebruikt voor genexpressie studies, immunohistochemie en andere morfologische onderzoeken. ve_content &quot;&gt; Dit onderzoek heeft tot doel een experimenteel platform voor moleculaire veranderingen in olfactorische neuronen in verband met de ziekte van staten en de respons op de behandeling te onderzoeken vast te stellen. Om dit aan te pakken, een kleine set van rookvrije patiënten die de DSM-IV diagnostische criteria voor BD voldaan op basis van het Diagnostisch Interview voor genetische studies (DIG) 22 werd aangeworven om twee nasale biopsieën ondergaan: een biopsie pre-behandeling met lithium en de tweede biopsie, na 6 weken van dagelijkse orale lithium therapie Bovendien moet in aanmerking BD patiënten zijn:. symptomatisch voor depressie , gebaseerd op scoren ≥10 van de 60 in de arts toegediend Montgomery-Asberg Rating Scale (MADRS) 23; symptomatisch voor hypomanie of manie, gebaseerd op een score ≥10 van de 56 op de arts toegediend Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. of ≥10 op beide MADRS en YMRS Rater-interbeoordelaar coëfficiënt van overeenstemming tussen clinici voor beide schalen is&gt; 0,96 Na biopten, neuronen waren enri.schakeld uit OE door LCM. Na aanvullende maatregelen voor kwaliteitscontrole, extractie van hoge kwaliteit RNA uit de weefsels en neuronale verrijking waarborgen, werd Real Time RT PCR uitgevoerd om voor- en nabehandeling expressie van genen van belang te onderzoeken. De volgende hoofdstukken bevatten een beschrijving van de validatie van deze aanpak, aandacht voor de optimalisatie van het protocol en de strategieën die werden toegepast voor het oplossen van problemen van het protocol.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Molds</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cryosectionering</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN (D)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Behandeld Water</td><td>Quality Biological</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microdissectie</td></tr><tr><td>Microscoop: PALM Series MicroLaser System</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td>Model: Axiovert 200M 
Software: Robo v3.2</td></tr><tr><td>No. 5 Dumont Microdissectietang</td><td>Roboz</td><td>RS-49085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA Extractie</td></tr><tr><td>RNAqueous Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cDNA Synthese</td></tr><tr><td>SuperScript III First Strand Synthesis Kit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">OMP qPCR</td></tr><tr><td>SYBR GreenER qPCR SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>11760-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Taqman qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan Expression Assay Probes</td><td>Applied Biosystems</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr></tbody></table>

reukneuronen verkregen door neus biopsie gecombineerd met laser-capture microdissection: een benadering die voor studie respons op de behandeling in mental disorders

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolaire stoornis (BD) is een ernstige neuropsychiatrische aandoening met slecht begrepen pathofysiologie en meestal behandeld met de stemmingsstabilisator, lithiumcarbonaat. Dierstudies evenals menselijke genetische studies geven aan dat lithium beïnvloedt moleculaire doelwitten die betrokken zijn bij neuronale groei, overleving en rijping, en met name moleculen betrokken bij Wnt-signalering. Gezien de ethische uitdaging verkrijgen brain biopsies onderzoeken dynamische moleculaire veranderingen geassocieerd met lithium-respons in het centrale zenuwstelsel (CZS), kan men het gebruik van neuronen verkregen olfactorische weefsels overwegen dit te bereiken goal.The reukepitheel bevat olfactorische receptor neuronen in verschillende ontwikkelingsstadia en gliale-achtige steuncellen. Dit verschaft een unieke gelegenheid om dynamische veranderingen in het CZS van patiënten met neuropsychiatrische aandoeningen te bestuderen, met olfactorisch weefsel veilig verkregen nasale biopsieën. Om het nadeel als gevolg van subst overwinnenantial besmetting van biopsie olfactorisch weefsel met niet-neuronale cellen, een nieuwe benadering verrijkte neuronale celpopulaties verkrijgen werd ontwikkeld door het combineren nasale biopsieën met laser-capture microdissectie. In deze studie, een systeem voor het onderzoeken therapiegerelateerde dynamische moleculaire veranderingen in neuronale weefsels ontwikkeld en gevalideerd, met een kleine voorsteekproef van BD patiënten gerekruteerd voor de studie van de moleculaire mechanismen van lithium behandelrespons.

Het protocol en het oplossen van problemen strategie in de studie van moleculaire handtekeningen werden succesvol geoptimaliseerd. RNA kwaliteit en neuronale verrijking criteria voor monsters die worden gebruikt stroomafwaarts Real Time-PCR-analyse werden gestandaardiseerd. RIN en RNA-concentratie werden onderzocht als verstorende factoren te gedetecteerd expressie niveaus. Op basis van de analyse van een aantal met RINS variërend 1-10, werd vastgesteld dat een minimum RIN van ~ 3.0 en hoger is voldoende voor downstream...

In deze studie, een roman platform om intraneuronaal moleculaire handtekeningen van respons op de behandeling in een bipolaire stoornis (BD) te onderzoeken werd ontwikkeld en gevalideerd. Reukepitheel van BD-patiënten werd verkregen door middel van nasale biopsieën. Vervolgens werd laser-capture microdissection gecombineerd met Real Time RT PCR om de moleculaire signatuur van lithium reactie in BD onderzoeken.

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Deze procedure beschrijft het gebruik van laser capture micro dissectie om neuronale lagen uit het olfactorische epitheelweefsel te isoleren, en schetst ook enkele downstream genexpressie-analyses. Begin met een nasale biopsie om het olfactorische epitheelweefsel te verkrijgen. Voer vervolgens laser capture microdissectie uit om de neuronale lagen te isoleren.Isoleer vervolgens RNA uit de monsters. Reverse transcribeer voor CDNA en analyseer voor genexpressie door QPCR. Uiteindelijk wordt laser capture microdissectie gebruikt om aan te tonen dat een verrijkte populatie neuronen kan worden geïsoleerd uit olfactorisch epitheelweefsel en toegepast op talrijke downstream toepassingen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande metalen zoals neuronale celculturen, is dat het ons toelaat om zowel toestands- als dynamische veranderingen in een neuronale context te bestuderen. We hadden het idee voor dit project toen we het potentieel ontdekten om laser capture micro dissectie te combineren met olfactorische biopsieën om verrijkte neuronale populaties te verkrijgen. Deze methode werd gevestigd en gedemonstreerd door TDA in het algemeen.We breidden deze methodolo

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven hier een methode voor biopsying olfactorische slijmvlies van de rat en mens neusholten. Deze biopten kunnen worden gebruikt voor zowel het identificeren van moleculaire afwijkingen in de hersenen ziekten of isoleren van multipotente volwassen stamcellen die gebruikt kunnen worden voor mobiele transplantatie in diermodellen van de hersenen trauma / ziekte.

Isoleren neus Olfactorische stamcellen van Knaagdieren of mensen

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Olfactorische receptor neuronen (ORNs) om te zetten geur signalen eerst in een receptor stroom die op zijn beurt actiepotentialen die worden overgebracht naar de tweede orde neuronen in de bulbus olfactorius triggers. Hier beschrijven we de zuig-pipet techniek om tegelijkertijd op te nemen van de geurstof-geïnduceerde receptor huidige en actiepotentialen van muis ORNs.

Odorant-geïnduceerde responsen Opgenomen van olfactorische receptor neuronen met behulp van de zuignap Pipet Techniek

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie

Dit protocol introduceert laterale vroege leerproces voor geurvoorkeur bij ratten door middel van acute enkelvoudige occlusie van de neusgaten. Lateraal leren maakt de bestudering van gedragsresultaten en onderliggende biologische mechanismen mogelijk binnen dezelfde dieren, waardoor de variantie die wordt veroorzaakt door ontwerpen tussen dieren wordt verminderd. Dit protocol kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan vroeg geur leren te onderzoeken.

Een gelateraliseerde Geur Learning Model in pasgeboren ratten voor Prepareernaald Neural Circuits Underpinning Memory Formation

Het analyseren van de fysiologische eigenschappen van olfactorische sensorische neuronen kent nog steeds technische beperkingen. Hier registreren we ze door middel van perforated patch-clamp in een intacte voorbereiding van het olfactorische epitheel in gene-targeted muizen. Deze techniek maakt de karakterisering mogelijk van membraaneigenschappen en reacties op specifieke liganden van neuronen die gedefinieerde olfactorische receptoren tot expressie brengen.

Geperforeerde Patch-clamp-opname van de muis olfactorische sensorische neuronen in Intact neuroepithelium: functionele analyse van neuronen uiten van een geïdentificeerd Odorant Receptor

Dit protocol legt uit hoe je enkele neuronen, microglia's en astrocyten verzamelt uit de centrale kern van de amygdala met hoge nauwkeurigheid en anatomische specificiteit met behulp van lasercapture microdissectie. Daarnaast leggen we ons gebruik van microfluïdeRT-qPCR uit om een subset van het transcriptome van deze cellen te meten.

Laser Capture Microdissectie en Microfluidic qPCR combineren om transcriptieprofielen van enkele cellen te analyseren: een systeembiologiebenadering voor opioïdenafhankelijkheid

Dit artikel beschrijft het gebruik van een ademgesynchroniseerde olfactometer om single- en dual-coil transcraniële magnetische stimulatie (TMS) te activeren tijdens de presentatie van geurstof gesynchroniseerd met menselijke neusademhaling. Deze combinatie stelt ons in staat om objectief te onderzoeken hoe aangename en onaangename geuren de corticospinale prikkelbaarheid en herseneffectieve connectiviteit bij een bepaald individu beïnvloeden.

Combinatie van een ademgesynchroniseerde olfactometer met hersensimulatie om de impact van geuren op corticospinale prikkelbaarheid en effectieve connectiviteit te bestuderen

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Ontdek laser-capture microdissectie van reukneuronen uit neusbiopsie voor onderzoek naar lithiumrespons bij bipolaire stoornis. Deze methode analyseert genexpressie in neuronale populaties.

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders (Video) | JoVE Journal

Reukneuronen Verkregen door Neus Biopsie Gecombineerd met Laser-Capture Microdissection: Een benadering die voor Studie respons op de behandeling in Mental Disorders

Meer video's verkennen