Name: Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer intracerebroventriculaire virale injectie in neonatale muizenhersenen voor wijdverbreide neuronale transductie met AAV. Deze methode biedt levenslange transgeenexpressie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Robert A. en Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Ziekte onderzoekssubsidie A2010097 (JLJ) en NIA Biologie van Veroudering Trainingssubsidie T32 AG000183 (ondersteuning voor SDG).

Voer alle procedures en protocollen met betrekking tot dieren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. De hier beschreven procedures zijn beoordeeld en door het Baylor College of Medicine Institutional Animal Care en gebruik Comite. Replicatie-incompetent adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren voor transgene levering in het knaagdierhersenen zijn goedgekeurd voor Biosafety Level 1 gebruik. Raadpleeg de CDC website voor de publicatie Amerikaanse overheid &quot;Bioveiligheid in microbiologie en Biomedische Laboratories (BMBL)&quot; welke specifieke eisen met betrekking tot de juiste bescherming en virus handling procedures Gegevens. Neem contact op met de plaatselijke veterinaire veiligheid en milieuveiligheid personeel om institutionele specifieke eisen voor de procedures met behulp van virussen te leren. Regelgeving met betrekking tot de procedure kamers, quarantaine, en de identificatie van biologisch kooien variëren tussen instellingen. 1 Prepare P0 Pups en pleegmoeders <ol><li> Zorg voor een hoge vet voer voor alle zwangere en zogende vrouwen aan de energiebehoefte van de fokkerij en het geven van borstvoeding te ondersteunen. </li><li> In de avond, het opzetten van een fokprogramma kooi door het toevoegen van een of twee gezonde vrouwtjes naar de kooi van een enkele bewoner mannelijke. De volgende ochtend, controleer dan de vrouwtjes voor een dekking plug en scheiden de vrouwtjes van de mannetjes als een stekker aanwezig is. <ol><li> Gebruik pleegmoeders om pups te verhogen van een genetische achtergrond met slechte maternale kenmerken (bijvoorbeeld C57BL / 6 of C3HeJ). Pleegmoeders accepteren pups uit een ander nest, indien de overgedragen pups worden geboren binnen vier dagen van het eigen nest de pleegmoeder. </li><li> Een afzonderlijke paring kooi met ICR of FVB vrouwtjes langs de experimentele fokkers zodat de twee vrouwtjes leveren op ongeveer dezelfde tijd. </li></ol></li><li> Vrouwtjes zullen leveren in 19 ± 1 dagen vanaf de datum stekker, afhankelijk van de achtergrond stam. Drie dagen voor delivery (16 dagen na de datum stekker), plaats de zwangere vrouw in een schone kooi met vers nestmateriaal en een overdekte schuilplaats. </li><li> Controleer voor pasgeboren pups twee keer per dag te beginnen 2 dagen voor de verwachte datum van levering (17 dagen na de datum stekker). Onderzoek de kooi met minimale belasting van de moeder door gluren door de bodem op de aanwezigheid van roze pasgeborenen. Muizen in het algemeen leveren pups in de ochtend, maar in zeldzame gevallen zal leveren in de middag. </li><li> Plan om injecties uit te voeren zodra de pups verpleging (die duidelijk door zichtbare melk plekken zullen zijn), of binnen 6 uur van de geboorte, wat het eerst komt. </li></ol> 2 Bereid Apparatuur voor Injectie <ol><li> Bereid een 10 ul injectie spuit met een 32 G naald voor algemene P0 neonaten. Als het uitvoeren van stereotactische injectie, monteer de spuit op de manipulator arm. </li><li> Bij gebruik van een stereotaxisch frame voor injecties, het koelen van de neonatale fase tot 4-8 ° C met toevoeging van 100% ethanol en droog ijs tot het reservoir aan de voorkant van het blok. Houd de temperatuur boven de 1 ° C tot bevriezing van de pups te voorkomen. </li></ol> 3 Bereid Virale Verdunningen voor Injectie <ol><li> Bereid een 1% trypanblauw kleurstof oplossing (20x voorraad). </li><li> Bereid 5-25 pi fracties van adeno-geassocieerde virus (AAV) voorraad in een klasse 2 bioveiligheid kast. Plaats deze fracties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Vermijd extra vries-dooi cycli dit veroorzaakt het virus transductie efficiëntie verliezen. </li><li> Verwijder een hoeveelheid van AAV uit de -80 ° C vriezer en plaats op ijs te ontdooien. </li><li> Bereid de virale oplossing voor injectie door verdunning van het virus in ijskoude 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Begin met een tien-voudige seriële verdunning (10 oktober - 10 augustus virale deeltjes / halfrond) voor de eerste optimalisatie van de transductie patroon. </li><li> Voeg 20x trypan blauw aan de AAV oplossing tot een eindconcentratie van 0,05%. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Enscenering van de pasgeboren pups voor Injectie <ol><li> Plaats een klein aluminium plaatje op het ijs om af te koelen. Plaats een droge taak doekje op de plaat de huid van de pup beschermen tegen de kou metaal. Dit dient als een vlakke koud oppervlak voor verlamming en het injecteren van de pups. </li><li> Bereid een warming pad geschikt voor het houden van neonatale muizen warm voor en na de injectie. </li><li> Zodra de pasgeboren pups zijn begonnen met verpleegkundige, verwijder ongeveer de helft van hen uit de kooi en laat de andere helft met hun moeder. Plaats de verzamelde pups op de opwarming pad in afwachting van injectie. OPMERKING: Als de biologische moeder niet de zorg voor de pups, verwijder het hele nest uit de kooi onmiddellijk en plaats de pups op een opwarming pad om injectie te wachten. Deze situatie kan zich voordoen met het eerste nest geboren C57BL / 6 vrouwtjes of met andere inteeltstammen dat arme fokkerij kenmerken hebben. In deze situatie zal melkvlekken niet zichtbaar pasgeboren pups worden. </li><li>Transfer een pup van de opwarming pad op de koude metalen plaat om onderkoeling anesthesie. Wacht 2-3 minuten voor de pup volledig verdoofd worden. Bevestig verdoving door heel zachtjes knijpen in een poot en monitor voor het gebrek aan beweging of ademhaling. </li></ol> 5 Injectie van AAV in Neonatale Muizen <ol><li> Vrije hand intracraniële injectie van AAV in neonatale muizen: <ol><li> Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blauw in de injectiespuit. </li><li> Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol. </li><li> Identificeer de injectieplaatsen bij 2/5 van de afstand van de lambda hechting aan elk oog. Een alternatief op de injectieplaats is gelegen op ongeveer 0,8-1 mm lateraal van de pijlnaad, halverwege tussen lambda en bregma. Deze monumenten zijn zichtbaar door de huid op P0. </li><li> Markeer de injectieplaats met een niet-giftige laboratorium pen. </li><li> Houd de spuit met de schaal toegankelijk voor monitoring het volume van de oplossing afgegeven. </li><li> Zorg ervoor dat de duim de bovenkant van de zuiger kan bereiken. Verwijder vervolgens de duim van de zuiger, terwijl het plaatsen van de naald, zodat niet onbedoeld doseren virus. </li><li> Zoek een comfortabele positie om de arm voor injectie brace door de invoering van de elleboog op de bank en leunt de arm op de ijsemmer. </li><li> Leg de pup op zijn kant met zijn kop direct onder de spuit. Draai de kop van de pup, zodat de gemarkeerde plaats van injectie naar boven is gericht en voorzichtig maar stevig deze positie met een open hand te houden. </li><li> Houd de injectiespuit loodrecht op het oppervlak van de schedel en de naald op de gemarkeerde injectieplaats tot een diepte van ongeveer 3 mm. Injecteer de naald totdat de weerstand daalt lichtjes, wat aangeeft dat de naald is doorgedrongen in de laterale ventrikel. Als een verwijzing nodig is, markeer 3 mm van het uiteinde van de naald met een niet-giftige maker. Pas de injectie diepte voor pup grootte en spanning op basis van kleurstof targeting van de ventrikels. </li><li> Houd de spuit vast zodat de zuiger ingedrukt zonder dat de naald verder in de hersenen kan zijn. Als de injectie verplaatst in de thalamus, zal virusverspreiding ernstig beperkt. </li><li> Begin langzaam te injecteren virus, terwijl het toezicht op de gedoseerde volume van de spuit. Dien een maximaal volume van 2 pi in elk ventrikel. Als de naald in de juiste positie, wordt de kleurstof verspreid naar het ventrikel vullen. </li><li> Trek langzaam de naald. </li><li> Laat de eerste injectie te sluiten vóór het injecteren van het andere halfrond. OPMERKING: Niet injecteren dezelfde plaats meer dan eens. Terugplaatsen van de naald krachten virus dat al is geïnjecteerd te lekken en veroorzaakt letsel of de dood van de pup. </li><li> Injecteer de contralaterale ventrikel volgens dezelfde procedure. </li></ol></li><li> Stereotactische injectie van AAV in neonatale muizen: <ol><li> Laad 5 pl verdund AAV met 0,05% trypan blue into de injectie spuit in handen van de stereotaxische manipulator. </li><li> Plaats voorzichtig de kop van de pup tussen het oor bars van de neonatale frame. Controleer de kop waterpas in de Y-as (voor naar achter) door te controleren dat de lijn tussen lambda en bregma parallel aan het podium. Controleer het hoofd niveau in de X-as (links naar rechts) door te controleren dat een denkbeeldige lijn tussen de oren of tussen de ogen, parallel aan de fase is. </li><li> Veeg het hoofd van de verdoofde pup met een wattenstaafje gedrenkt in 70% ethanol. </li><li> Gebruik de stereotaxische manipulator aan de spuit bovengenoemde lambda positioneren en nul de X en Y coördinaten. Verplaats de stereotaxische armen (X, Y) = (0.8, 1.5) mm voor standaard P0 pups. OPMERKING: Pup grootte en stereotactische coördinaten kan per stam en leeftijd. Coördinaten op basis van kleurstof injecties past indien nodig de laterale ventrikels richten. </li><li> Langzaam de naald in de injectieplaats. Het oppervlak van de schedel zal indent en dan los zodra de naald de huid is doorgedrongen. Trek de naald tot de schedel herstelt de normale concave vorm, maar houd de schuine kant van de naald onder de huid. Nul de Z-coördinaat op dit punt. </li><li> Steek de naald tot Z = -1.7 mm en vervolgens terug te trekken tot -1.5 mm. </li><li> Injecteer langzaam het virus. Elk halfrond kunnen tot 2 pi van de oplossing. </li><li> Houd de spuit in de plaats voor 30-60 sec na het voltooien van de injectie en dan langzaam terug te trekken van de naald dan 1-2 minuten. </li><li> Herhaal de contralaterale hemisfeer, met negatieve coördinaten in de X-as voor de injectie. OPMERKING: Alternative coördinaten voor injectie zijn (X, Y, Z) = (0.8, 2.0, -1.5) mm en (1.2, 1.0, -1.5) mm. Voer de eerste injectie (0.8, 2.0), dan naar (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) en tenslotte (1.2 -1.0). Injecteer 1 ul van de oplossing op elke locatie, voor een totaal van 2 pl per halfrond. Beweeg snel tussen de injecties om de procedure in de les te voltooiens dan 10 minuten. </li></ol></li></ol> 6 Post-injectie Care <ol><li> Na het voltooien van injecties in beide hersenhelften, plaats de pup terug op de opwarming pad totdat de lichaamstemperatuur en huidskleur terug te keren naar de normale en de pup begint te bewegen. </li><li> Bij gebruik van de biologische moeder om de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de terugkeer van de geïnjecteerde pups naar de biologische moeder nadat ze herstellen de normale beweging. Leg de resterende uninjected pups op de opwarming pad. Herhaal deze procedure totdat alle muizen werden geïnjecteerd. </li><li> Bij gebruik van een pleegmoeder voor de geïnjecteerde pasgeborenen te zogen, en de overdracht van alle geïnjecteerde pups aan de pleegmoeder voor zorg na ze herstellen de normale beweging. <ol><li> Verwijder meeste of alle pups die tot de pleegmoeder van de kooi tot het succes van de geïnjecteerde dieren. </li><li> Als pups pleegmoeder en geïnjecteerd pups hebben dezelfde ogen en huidskleur, markeer pups van de pleegmoeder met een laboratorium pen, zodat ze kunnen wordenlater onderscheiden. </li><li> Plaats pups de pleegmoeder en een aantal van hun beddengoed samen met de geïnjecteerde pups. Zorg ervoor dat de geïnjecteerde pups verwerven van de geur van haar biologische nakomelingen te verbeteren acceptatie van de nieuwe pups. </li><li> Plaats alleen de geïnjecteerde pups terug in de kooi van de pleegmoeder. Ruimen eventuele resterende pups van de pleegmoeder. </li></ol></li><li> Zorg ervoor dat de moeder is het bijwonen van en verpleging de geïnjecteerde pups binnen 10 minuten van het plaatsen van hen in de kooi. Als de moeder niet de pups binnen deze tijd heeft te verzamelen, overdragen pups naar een andere pleegmoeder. </li><li> Label de kooi met een biohazard-kaart te laten zien dat het bevat viraal-geïnjecteerde dieren. Het huis van de kooi in een goedgekeurd gebied voor 72 uur. </li><li> Na de 72 uur quarantaineperiode, de overdracht van de moeder en de pups (maar geen beddengoed of andere kooi items) om een ​​schone kooi. Uitvoeren van deze overdracht in een Level 2 bioveiligheid kast om de blootstelling aan een viraal besmette beddengoed te voorkomen. Return de schone kooi met de geïnjecteerde dieren naar de gewone muis faciliteit. </li><li> Plaats de vuile kooi in een biohazard zak, steriliseren in een autoclaaf, en dan terug de kooi naar het vivarium. </li></ol> 7 Cleanup <ol><li> Overgebleven virus oplossing bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. Het virus blijft transductie ten minste 2 maanden bij opslag bij 4 ° C 8. </li><li> Ontsmet de injectienaald en spuit met 2% bleekmiddel, gevolgd door herhaalde spoelingen in gedeïoniseerd water. </li><li> Reinig de werkruimte met 2% bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol. </li><li> Verzamel alle disposable artikelen waaronder pipet tips, tubes, masker en handschoenen in een plastic zak biologisch gevaarlijk. Afvoeren van afvalstoffen, zoals vereist door de lokale wetgeving en institutionele beleid (dwz autoclaaf of verbranden). </li></ol> 8 Bereid Mouse Brains for Imaging <ol><li> Plaats een geïnjecteerde muis in een kooldioxide euthanasie kamer bij 34 weken na injectie. Volg de institutionele richtlijnen voor een correcte euthanasie procedures. Geen dieren perfuse met paraformaldehyde als dit de fluorescentie label zal uitdoven. </li><li> Verwijder de gehele hersenen van de schedel en bevestig 3-12 uur in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C. </li><li> Breng de vaste hersenen tot 30% sucrose voor cryoprotection. Incubeer bij 4 ° C totdat de hersenen naar de bodem zinkt. </li><li> Verzamel een emmer uit fijngemalen droog ijs. Snijd de hersenen in de helft beneden de middellijn. Begraaf de hersenhelften in het droogijs te bevriezen. </li><li> Koel de microtoom fase door toevoeging van droog ijs en 100% ethanol. </li><li> Bevestig de hersenen naar het podium met de middellijn naar beneden met behulp van PBS, en laten bevriezen. </li><li> Doorsnede van de hersenen op 30-45 micrometer dikte met behulp van een bevriezing sledemicrotoom. </li><li> Plaats gedeelten in 24-well platen bevattende antivries-oplossing (250 ml glycerol, 300 ml ethyleenglycol, 500 ml 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4). Afdekplaten with aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Verzamel secties 1-4 putjes en spoel 3x in PBS. </li><li> Mount secties op objectglaasjes en dekglaasje. Laat dia&#39;s om te drogen op een donkere plaats. </li><li> Afbeelding dia&#39;s met behulp van geschikte filters voor inheemse YFP of tdTomato om het virus transductie patroon controleren. </li></ol>

<ol><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).</li>
<li>Sun, B., Gan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+expression+in+the+central+nervous+system+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors.</a> Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J Virol. 75, 12382-12392 (2001).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+brain+injection+of+adeno-associated+virus+type+1+%28AAV1%29+in+neonatal+mice+results+in+complementary+patterns+of+neuronal+transduction+to+AAV2+and+total+long-term+correction+of+storage+lesions+in+the+brains+of+beta-glucuronidase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice.</a> J Virol. 77, 7034-7040 (2003).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+transduction+of+the+neonatal+brain+delivers+controllable+genetic+mosaicism+for+visualising+and+manipulating+neuronal+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo.</a> Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).</li>
<li>Chakrabarty, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+serotype+and+timing+of+injection+determines+AAV+transduction+in+the+neonatal+mice+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+formulations+that+enhance+physical+stability+of+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy.</a> Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).</li>
<li>Bauer, H. C., Bauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+of+the+blood-brain+barrier%3A+still+an+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma.</a> Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).</li>
<li>Cearley, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+repertoire+of+AAV+vector+serotypes+mediate+unique+patterns+of+transduction+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> J Virol. 82, 5887-5911 (2008).</li>
</ol>

Auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We hebben een veelzijdige werkwijze beschreven voor het manipuleren neuronale genexpressie middels AAV als middel voor grootschalige plaatsing in de neonatale muizenhersenen. Vergeleken met andere vormen van neuronale transgenese zoals in utero elektroporatie 1 of stereotaxische intracraniale injectie 2,3, neonatale virale injectie is relatief eenvoudig. De basis procedure kan worden uitgevoerd in een paar minuten met slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Optimale overleving en transgene ex...

Traditionele methoden voor het wijzigen van neurale genexpressie vereisen tijdrovende en dure kiembaan manipulaties. Alternative de novo benaderingen zoals in utero elektroporatie of lentivirale stereotaxische injectie geven snellere resultaten en minder duur maar heeft het nadeel dat complexe chirurgische ingreep 1-3. Verder transgenexpressie een beperkt ruimtelijk bereik van deze methodes. Hierin beschrijven we een snelle, gemakkelijke en economische methode voor grootschalige neuronale manipulatie via intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) in de neonatale hersenen van muizen. De werkwijze werd eerst beschreven door John Wolfe en Marco Passini in 2001, waar ze voorgesteld kleine deeltjesgrootte van AAV stond het diffunderen in de cerebrospinale vloeistof bij het ​​passeren van de laterale ventrikels via onrijpe ependymale barrière en in het hersenparenchym 4, 5. Intraventriculaire injectie van AAV in de ferste 24 uur na de geboorte opbrengsten wijdverspreide virale transductie van neurale subsets verspreid over elk gebied van de hersenen, van de reukkwabben de hersenstam 6,7. Viraal afgeleverd transgenen tot expressie worden gebracht en actief binnen dagen na injectie en aanhouden tot een jaar na transductie. Zo, dit veelzijdige manipulatie maakt studies variërend van vroege postnatale ontwikkeling van de hersenen tegen veroudering en degeneratie in de volwassene. Bij de aanpassing van de techniek om onze specifieke experimentele behoeften, hebben we vooral gericht op AAV8 serotype want het is de meest efficiënte transductie neuronen 6. We zien dat de virale titer kan worden verdund tot de dichtheid van getransduceerde neuronen voor experimenten testen cel-intrinsieke gevolgen van genetische manipulatie controleren. Daarnaast hebben we aangetoond dat twee virussen kunnen worden gecoördineerd geïnjecteerd om expressiepatronen die eenzijdig gericht afzonderlijke of overlappende sets van neuronen produceren, afhankelijk van de gekozen serotypenvirale verpakking. Ons werk vergroot de veelzijdigheid van deze techniek voor gebruik in een groot aantal experimentele neurologie instellingen.

<table><tbody><tr><td>ICR outbred muizen</td><td>Harlan</td><td>Hsd:ICR (CD-1)</td><td>Deze stam is ook bekend als CD-1</td></tr><tr><td>FVB inteelt muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>1800</td><td>5-6 weken oud</td></tr><tr><td>Nestlets</td><td>Lab Supply</td><td>NESTLETS</td><td></td></tr><tr><td>Shepherd shacks</td><td>Lab Supply</td><td>SS-muis</td><td></td></tr><tr><td>Hoogvet knaagdier voer</td><td>Purina Mills</td><td>PicoLab Muis dieet 20, #5058</td><td>Dit is ons standaard fokkersvoer</td></tr><tr><td>Hoogvet knaagdier voer (alternatief)</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Teklad Global 19% eiwit knaagdier dieet #2019S</td><td>Als laag fyto-oestrogeen, autoclaveerbare dieet is nodig</td></tr><tr><td>Injectiespuit</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 ml spuit</td></tr><tr><td>Injectienaalden</td><td>Hamilton</td><td>7803-04, RN 6PK PT4, 0.375"</td><td>32 G, voor standaard P0 injecties</td></tr><tr><td>Metalen plaat voor cryoanesthesie</td><td>McMaster Carr</td><td>8975K439</td><td>Ruwe aluminium plaat, 6&rdquo; x 12&rdquo;, 0.25&rdquo; dik, moet worden gesneden in 3 gelijke stukken en randen gefreesd door lokale machine winkel</td></tr><tr><td>Stereotactisch apparaat voor kleine dieren met digitaal display</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td></td></tr><tr><td>Universele spuithouder met naaldsteunvoet</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 1772-F1</td><td></td></tr><tr><td>Neonatale frame</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Officieel genoemd een muis en neonatale rat adapter</td></tr><tr><td>Biogevaar afvoerzakken met steriele indicator</td><td>VWR</td><td>14220-030</td><td>Belangrijk! &ndash; Controleer met lokale dierenarts en milieuveiligheidspersoneel om het protocol van uw instituut voor biogevaar afvalverwijdering te leren</td></tr></tbody></table>

intracerebroventriculaire viral injectie van de neonatale mouse brain voor persistent en wijdverbreide neuronale transduction

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Met het tempo van de wetenschappelijke vooruitgang snel te accelereren, zijn nieuwe methoden nodig voor experimentele neurowetenschappen om snel en eenvoudig te manipuleren genexpressie in de hersenen van muizen. Hier beschrijven we een techniek voor het eerst geïntroduceerd door Passini en Wolfe voor directe intracraniële levering van viraal gecodeerde transgenen in de neonatale hersenen van muizen. In zijn meest elementaire vorm, de procedure vereist slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Echter, kan het protocol ook worden aangepast voor gebruik met stereotaxisch frames om consistentie voor onderzoekers nieuwe om de techniek te verbeteren. De werkwijze berust op het vermogen van adeno-geassocieerd virus (AAV) vrij van de cerebrale ventrikels in het hersenparenchym bewegen terwijl het ependymale bekleding nog onrijpe tijdens de eerste 12-24 uur na de geboorte. Intraventriculaire injectie van AAV op deze leeftijd resultaten wijdverspreide transductie van neuronen in de gehele hersenen. Expressie begint binnen enkele dagen na de injectie en blijft voor de lifetime van het dier. Virale titer kan worden aangepast aan de dichtheid van getransduceerde neuronen controle, terwijl co-expressie van een fluorescent proteïne een onmisbare label van getransduceerde cellen. Met de stijgende beschikbaarheid van virale kern faciliteiten voor zowel off-the-shelf, voorverpakte reagentia en aangepaste virale voorbereiding te bieden, biedt deze aanpak een tijdige methode voor het manipuleren van genexpressie in de hersenen van muizen, dat is snel, gemakkelijk, en veel minder duur dan traditionele kiembaan engineering.

Succesvolle intraventriculaire virale injectie opbrengsten wijdverspreid en robuuste neuronale expressie. Hier virale transductie evalueerden we gebruik YFP- of tdTomato fluorescerende genen onder de controle van de kip beta actinepromoter (CBA promotor). Deze constructen werden verpakt in AAV8 en geïnjecteerd in de laterale ventrikels van neonatale (P0) ICR-muizen. Hoge virale titers (10 10 deeltjes per halfrond) resulteerde in dichte etikettering van de olfactorische bulb, striatum, de cerebrale cortex, hip...

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Het algemene doel van deze procedure is om neuronen in de hersenen viraal te transduceren. Dit wordt bereikt door cryoanesthesie van pasgeboren pups, gevolgd door overbrenging van de neonate naar het gekoelde stadium voor injectie. Vervolgens identificeer je de injectieplaats voor het targeten van de laterale ventrikels tussen de Lambda-naad en elk oog of lateraal vanaf de sagittale naad halverwege tussen Lambda en Bgma.De laatste stap is om de naald tot de juiste diepte te steken en langzaam maximaal twee microliters virusoplossing in de laterale ventrikel van elk halfrond te infuseren. Uiteindelijk wordt een fluorescente tag of immunofluorescentie voor het gen van belang gebruikt om het transgene-expressiepatroon te tonen dat het gevolg is van intraventriculaire injectie. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen met het nauwkeurig targeten van de laterale ventrikels.Deze techniek wordt gedemonstreerd door zowel vrijhandige intracraniële injectie als door stereotactische injectie, waarbij de vrijhandige techniek zal worden uitgevoerd door een andere postdoc in mijn laboratorium. Om te beginnen, bereid een injectiespuit van 10 microliter met een naald van 32 gauge voor voor pasgeborenen op postnatale dag nul. Plaats vervolgens een kleine aluminium plaat op ijs om af te koelen en plaats een droge taakveger op de plaat om de huid van de pup te beschermen tegen het koude metaal.Dit dient als een vlakke koude oppervlakte voor het anestheseren en injecteren van de pups. Bereid vervolgens een verwarmingskussen voor dat geschikt is om neonatale muizen warm te houden voor en na de injectie. Zodra de pasgeboren pups zijn begonnen met zuigen, verwijder je ongeveer de helft van hen uit de kooi en laat je de andere helft bij hun moeder.Plaats de verzamelde pups op het verwarmingskussen terwijl je op injectie wacht. Breng een pup van het verwarmingskussen naar de koude metalen plaat om hypothermie te induceren.Anesthesie. Wacht twee tot drie minuten tot de pup volledig verdoofd is.Bevestig de anesthesie door heel zachtjes een poot te knijpen en controleer op gebrek aan beweging of ademhaling. Handmatige intracraniale injectie laad vijf microliter verdunde adeno-geassocieerd virus, of een A V met 0,05%Trian blauw in de injectiespuit. Veeg voorzichtig het hoofd van de verdoofde pup af met een wattenstaafje gedrenkt in 70%Ethanol.Identificeer de injectieplaatsen op tweederde van de afstand van de lambda-naad tot elk oog en een alternatieve injectieplaats bevindt zich op ongeveer 0,8 tot één millimeter lateraal vanaf de sagittale naad halverwege tussen Lambda en Bgma. Deze landmarks zijn zichtbaar door de huid op postnatale dag nul. Markeer de injectieplaats met een niet-toxische laboratoriumpen.Houd de spuit met een schaal zichtbaar voor het bewaken van het volume gedistribueerde oplossing. Zorg ervoor dat de duim de bovenkant van de plunjer kan bereiken. Verwijder vervolgens de duim van de plunjer terwijl je de naald positioneert.Om te voorkomen dat er per ongeluk virus wordt gedistribueerd, leg de pup op zijn zij met zijn hoofd direct onder de spuit. Draai het hoofd van de P zodat de gemarkeerde injectieplaats omhoog staat en voorzichtig maar stevig. Houd deze positie met een open hand vast.Houd de spuit loodrecht op het oppervlak van de schedel en steek de naald op de gemarkeerde injectieplaats tot een diepte van ongeveer drie millimeter. Breng de naald in tot de weerstand lichtjes afneemt, wat aangeeft dat de naald in de laterale ventrikel is gepenetreerd. Begin langzaam met het injecteren van virus terwijl je het gedistribueerde volume uit de spuit controleert.Breng een maximaal volume van twee microliters in de ventrikel. Trek de naald langzaam terug. Laat de eerste injectieplaats sluiten voordat je het andere halfrond injecteert.Als de naald op de juiste positie staat, zal de kleurstof zich verspreiden om de ventrikel te vullen. Koel het neonatale stadium af tot tussen de vier en acht graden Celsius door 100%ethanol en droog ijs toe te voegen aan het reservoir. Aan de voorkant van het blok slot.Houd de temperatuur boven één graad Celsius om bevriezing van de pups te voorkomen. Laad vijf microliter verdunde A a V met 0,05%trian blauw in de injectiespuit gehouden door de stereotactische manipulator. Plaats later voorzichtig het hoofd van de pup tussen de oorbars van het neonatale frame.Zorg ervoor dat het hoofd in de Y-as gelijkmatig is door te controleren of de lijn tussen lambda en Bgma parallel is aan het stadium. Zorg ervoor dat het hoofd in de x-as gelijkmatig is door te controleren of een denkbeeldige lijn tussen de oren of een lijn tussen de ogen parallel is aan het stadium. Veeg voorzichtig het hoofd van de verdoofde pup af met een wattenstaafje gedrenkt in 70%ethanol.Gebruik vervolgens de stereotactische manipulator om de spuit boven Lambda en nul te positioneren. De x en Y coördinaten. Beweeg de stereotactische armen naar een positie 0,8 millimeter lateraal en 1,5 millimeter anterior ten opzichte van de lambda-naad of standaard pasgeborenen op postnatale dag nul. Laat de naald langzaam zakken in de injectieplaats.Het oppervlak van de schedel zal zich indrukken en vervolgens loslaten. Zodra de naald de huid heeft gepenetreerd, trek de naald terug tot de schedel zijn normale concave vorm herstelt, maar houd de punt van de naald onder de huid op nul. De Z coördinaat op dit punt.Breng de naald in tot Z gelijk is aan min 1,7 millimeter en trek vervolgens terug tot min 1,5 millimeter. Injecteer langzaam het virus. Elk halfrond kan maximaal twee microliters oplossing accepteren.Houd de spuit 30 tot 60 seconden op zijn plaats na het voltooien van de injectie en trek vervolgens de naald langzaam terug gedurende één tot twee minuten. Herhaal dit voor het contralaterale halfrond met negatieve coördinaten in de x-as voor de injectieplaats. Nadat je injecties in beide halfronden hebt voltooid, plaats je de pup terug op het verwarmingskussen tot de lichaamstemperatuur en huidskleur weer normaal zijn en de pup begint te bewegen.Vervolgens verwijder je de overgebleven niet-geïn

intracerebroventricular-viral-injection-neonatal-mouse-brain-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

This video describes an efficient technique to induce glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate, and generate tumors with histopathological characteristics of human GBM.

Glioblastoma Induction Using SB Mediated Transposition: A Technique for Generating Novel Mouse Model Using Transposon Mediated Integration of SB Plasmid into Neonatal Mouse Brain

This video demonstrates the intracerebroventricular injection process for studying murine cytomegalovirus (MCMV) distribution in the neonatal mouse brain. MCMV, engineered to express an enhanced green fluorescent protein (EGFP) for visibility, is injected into the lateral ventricle of a mouse pup's brain. The injected virus circulates through the cerebrospinal fluid, infecting cells in the periventricular region, including the marginal zone, choroid plexus, and subventricular zone.

An Intracerebroventricular Injection to Analyze Murine Cytomegalovirus Distribution in a Neonatal Mouse Brain

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Human cytomegalovirus (HCMV) infectie van pasgeborenen is een belangrijke oorzaak van mentale retardatie, maar de moleculaire gebeurtenissen die tot virus-geïnduceerde pathogenese zijn nog steeds slecht begrepen. Om de dynamiek van de hersenen infectie te onderzoeken, hebben we aangepast...

Gebruik van<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging aan de progressie van de Experimentele Mouse Cytomegalovirusinfectie in Pasgeborenen Monitor

Diermodellen van pediatrische ziekte vroeg begin en agressieve ziekteprogressie ervaren. Klinisch relevante afgifte van therapie aan jonge muismodellen kan zijn technisch moeilijk. Dit protocol beschrijft een niet-invasieve werkwijze voor intraveneuze injectie pasgeboren muizen binnen de eerste twee dagen postnatale leven.

Intraveneuze injecties in pasgeboren muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor intracerebroventriculaire en intravasculaire injectie van virale deeltjes of fluorescente microbeads in de neonatale muizenhersenen. Het lokalisatiepatroon van het virus en de nanodeeltjes kan worden gedetecteerd door microscopische evaluatie of door in situ hybridisatie.

Intracerebroventriculaire en Intravasculaire Injectie van virusdeeltjes en TL Microkralen in de Neonatale Brain

We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Dit protocol demonstreert een nieuwe methode voor het toepassen van gentherapieën op subpopulaties van cellen bij neonatale ratten in de postnatale leeftijd van 5-10 dagen door een anterograde chemogenetische modifier in de somatomotorische cortex en een retrograde transporteerbaar Cre-recombinase in het cervicale ruggenmerg te injecteren.

Gericht op het corticospinale kanaal bij neonatale ratten met een dubbel-virale vector met behulp van gecombineerde hersen- en wervelkolomchirurgie

Het huidige protocol schetst stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van intrathecale injecties bij neonatale muizen voor genbewerking en medicijnafgifte.

Intrathecale injectie van pasgeboren muis voor genoombewerking en medicijnafgifte

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Leer intracerebroventriculaire virale injectie in neonatale muizenhersenen voor wijdverbreide neuronale transductie met AAV. Deze methode biedt levenslange transgeenexpressie voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Meer video's verkennen