Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect
2 augustus 2015
Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.
Het overkoepelende doel van deze procedure is om eiwit-, eiwitinteracties binnen een bepaald proteoom op een parallel onbevooroordeelde manier te identificeren, wat niet mogelijk is met andere technologieën. Dit wordt bereikt door eerst hybridisatie en een met een epitope getagd eiwit van belang te combineren met een hoog gezuiverde, volledige functionele eiwitbibliotheek die in een coördinatenvlak op het oppervlak van een microscoopglasplaat is afgezet. Zodra het eiwit evenwicht heeft bereikt met elk van zijn respectieve doeleiwitten op de array, wordt de vrije fractie weggewassen en worden de eiwitinteracties gedetecteerd met een monoklonaal antilichaam tegen het epitope dat geconjugeerd is met een fluorescerende component, met behulp van een standaard microarrayscanner.
De resulterende beelden zijn doorweven met informatie over de intensiteit van elk kenmerk met betrekking tot gebonden eiwit en fluorescent signaal. Deze informatie wordt geëxtrapoleerd met behulp van microarray-analysesoftware om een lijst met intensiteitswaarden voor elk kenmerk op de array te genereren. De informatie over het eiwit-eiwit-interacterende paar kan worden geëxporteerd naar downstream bioinformatica-analysesoftware om de kenmerkende gegevens te scoren en eiwit-eiwitinteracties tussen het eiwit van belang en de eiwitten op de microarray te identificeren.
De ruwe signaalintensiteitsgegevens worden verzameld over twee of meer eiwitmicroarrays om rekening te houden met inter- en intra-assayvariaties, en de gegevens worden genormaliseerd om elk van de interacties te scoren. Het resulterende resultaat genereert een doellijst van interacterende eiwitten, die kan worden gebruikt om verder onderzoek naar eiwit-eiwitinteracties te begeleiden. In vivo Functioneel eiwitmicroarray werd meer dan 15 jaar geleden ontwikkeld in Michael Snyder's lab.
Sindsdien zijn er veel succesvolle toepassingen van deze technologie geweest vanwege de veelzijdigheid en biochemische proteomische assays. Deze techniek vergemakkelijkt de studie van eiwitinteracties en modulaire signaalnetwerken, evenals alternatieve connectiviteit en eerder bekende signaalcascades Om de V vijf fusiekinase sondes te kweken en te zuiveren, gebruik vers gestreken giststam Y 2 58 die V vijf fusie-eiwitplaat bevat, de gist op synthetisch compleet uracil, 2% dextrose agar, en kweek gedurende drie dagen uit een bevroren cultuur bij 30 graden Celsius. Inoculeer starterculturen van een enkele kolonie en laat ze een nacht groeien in synthetisch compleet uracil.
2% dextrose op een schuddende platform of wiel bij 30 graden Celsius. De volgende ochtend, inoculeer 400 milliliter van een synthetisch compleet uracil. 2% raffinose cultuur met voldoende startercultuur om een eind optische dichtheid bij 600 nanometer of een OD 600 van 0,1 te bereiken.
Laat de inoculums groeien tot een OD 600 van 0,6, en induceer vervolgens de expressie van de V vijf kinase fusieconstructie door voldoende drie keer gistextract toe te voegen. Pepton aangevuld met 6% galactose om het inductiemedium met een factor drie te verdunnen of een eindgalactoseconcentratie van 2% te bereiken. Induceer cellen bij 30 graden Celsius gedurende zes uur op een schuddende platform. Gebruik een tweede liter erlenmeyer kolf om een geschikte beluchting te garanderen.
Verzamel de cellen door 400 milliliter van de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 1000 keer G bij vier graden Celsius te centrifugeren. Was de cellen eenmaal met 50 milliliter ijskoud PBS-buffer en breng over naar een kegelvormig buisje van 50 milliliter. Was de pellet opnieuw in ijskoud fosfaatgebufferd serum of A PBS-buffer en breng over naar twee milliliter snapcapbuisjes voor lysis.
Nadat de cellen gedurende één minuut bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius zijn gecentrifugeerd, verwijdert u de buffer met een pipet en plaatst u de buisjes op ijs. Lyse de cellen met 0,5 millimeter zirkoniumoxidekralen in een een-op-een-op-een volume van celpellet naar kralen naar PBS lysisbuffer. Vortex vervolgens het mengsel drie keer gedurende twee minuten op vier graden Celsius met behulp van een agitatieplatform.
Centrifugeer het lysaal gedurende 10 minuten bij 20.000 keer G in een tafelblad microfuge bij vier graden Celsius. Breng het opgehelderde lysaal over naar een buisje met ongeveer 100 microliter voorgewassen nikkelaffiniteitsresin en incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Om het histamine zes keer getagde V vijf fusie-eiwit te vangen, bepellet het resin met behulp van een tafelbladcentrifuge gedurende vijf minuten bij 1000 keer G en vier graden Celsius na verwijdering van het supernatant.
Was het resin gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius op de mutator met wasbuffer. Herhaal de wasbeurt nogmaals twee keer met verse wasbuffer. Elueer de eiwitten met twee volumes van 100 microliter 200 millimolair ole.
Voeg glycerol toe tot een eindconcentratie van 30%van de monsters en bewaar bij min 80 graden Celsius totdat het wordt gebruikt in de test. Om interacties te detecteren. Verdun het V vijf fluoro vier geconjugeerde antilichaam tot 260 nanogram per milliliter in sonde, buffer en meng grondig door te schudden.
Verdun vervolgens de V vijf fusie-eiwit sonde over een concentratiebereik van vijf tot 500 microgram per milliliter. Verwijder vervolgens de eiwitmicroarrays uit de vriezer en breng ze net voor gebruik in de koelkast naar vier graden Celsius. Voeg de blokkeringsbuffer direct toe aan de glijhouder met de eiwitmicroarrays en bedek de bovenkant met paraform om lekkage te voorkomen.
Blokkeer de arrays in blokkeringsbuffer gedurende één uur door te schudden bij 50 RP op een podium bij vier graden Celsius. Na het blokkeren, brengt u de arrays over naar een bevochtigde kamer, zet ze op vier graden Celsius en voegt u 90 microliter verdunde sonde direct toe aan het arrayoppervlak. Bedek de arrays met een verhoogde lifterslip en incubeer zonder te schudden in de bevochtigde kamer bij vier graden Celsius gedurende anderhalf uur. Na incubatie voegt u de glijbaan toe aan een kegelvormig buisje van 50 milliliter dat voldoende voorgekoelde sondebuffer bevat om de glijbaan volledig te omhullen, waar
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties binnen een proteoom met behulp van eiwitmicroarrays. De aanpak maakt een snelle en onbevooroordeelde analyse van duizenden interacties in parallel mogelijk, wat niet haalbaar is met traditionele technologieën.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Proteomics
Achtergrond
- Eiwit-eiwitinteracties zijn cruciaal voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Traditionele methoden voor het bestuderen van deze interacties kunnen beperkt zijn in reikwijdte.
- Eiwitmicroarrays bieden een high-throughput alternatief.
- Deze techniek maakt gebruik van een functionele library van eiwitten met volledige lengte.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de onbevooroordeelde identificatie van eiwitinteracties.
- Het benutten van eiwitmicroarrays voor high-throughput assays.
- Het faciliteren van downstream bio-informatische analyse van interactiegegevens.
Gebruikte methoden
- Hybridisatie van epitope-gelabelde eiwitten met een eiwitbibliotheek op een microscoopglaasje.
- Uitwassen van niet-gebonden eiwitten nadat het evenwicht is bereikt.
- Detectie van gebonden eiwitten met behulp van monoklonale antilichamen geconjugeerd aan fluorescente markers.
- Analyse van fluorescente signalen om interactiedata te genereren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van eiwit-eiwitinteracties op een high-throughput manier.
- Generatie van intensiteitswaarden die corresponderen met elke interactie.
- Export van interactiedata voor verdere bio-informatische analyse.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op diverse assays.
Conclusies
- De methode biedt een robuust platform voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Het vergroot de capaciteit voor high-throughput biologische assays.
- Deze benadering kan worden aangepast voor verschillende typen moleculaire interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Het in kaart brengen van eiwit-eiwitinteracties is een cruciale vroege stap bij de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's voor biopharma-ontdekkingsprogramma's. Functionele eiwitmicroarrays met een hoge dichtheid maken onbevooroordeelde, proteoombrede screening mogelijk om directe bindingspartners te identificeren, wat de generering van hypothesen en de verduidelijking van signaalpaden ondersteunt. Deze benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door kwantitatieve interactiegegevens te verschaffen voorafgaand aan kostbare downstream-validatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door directe eiwit-eiwitinteracties in een functioneel proteoom in kaart te brengen.
- Operationele waarde: Biedt een parallel, onbevooroordeeld platform om bindingspartners te identificeren zonder voorafgaande voorkeur voor bekende signaalpaden.
- Voorspellende waarde: Genereert interactiedatasets met een hoge betrouwbaarheid die bijdragen aan de prioritering van targets en padanalyse.
Screening en assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde proteïnebibliotheken voor voor reproduceerbare screeningscampagnes met gebruik van gezuiverde kinasesondes.
- Operationele waarde: Standaardiseert hybridisatie- en detectieworkflows om assay-consistentie tussen replica's te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt de screening van ~4.200 volledige eiwitten in duplo, wat een robuuste statistische analyse mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Identificeert kandidaat-interacties voor functionele in vivo validatie in ziekte-relevante modellen.
- Mechanische Risicoreductie: Verduidelijkt de connectiviteit van signaleringsnetwerken door zowel bekende als nieuwe interactiepartners te detecteren.
- Pathway-afstemming: Ondersteunt de ontdekking van biomarkers door kinase-activiteit te koppelen aan gefosforyleerde substraten in cellulaire contexten.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking en ondersteunt de identificatie van targets via proteoombrede interactiescreening voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing door directe bindingspartners van kinasen of andere eiwitten van belang te onthullen.
- Screening: Maakt assay-klare eiwitmicroarrays mogelijk met geblokkeerde oppervlakken en gestandaardiseerde hybridisatiecondities.
- Analytiek: Genereert genormaliseerde intensiteitswaarden uit dubbele arrays om interacties te scoren en rekening te houden met technische variatie.
- Translationeel onderzoek: Verbindt microarray-hits met in vivo validatie via vervolgfunctionaliteitsassays.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar proteoom-screeningplatform dat toepasbaar is op meerdere kinasen of eiwitfamilies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door directe, kwantitatieve meting van eiwit-eiwitinteracties.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde stappen voor zuivering, hybridisatie, wassen en detectie.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de selectie van targets door vroege gegevens over het interactielandschap te leveren.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door interactienetwerken te highlighten die relevant zijn voor ziektemechanismen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in gist-eiwitexpressie, affiniteitszuivering en de omgang met microarrays.
- Afhankelijk van toegang tot eiwit-microarray-slides met een hoge dichtheid en fluorescence-scanningsinstrumentatie.
- Vereist standaardisatie van blokkerings-, hybridisatie- en antilichaam-probingcondities tussen batches.
- Omvat optimalisatie van de kinase-probeconcentratie en incubatietijden voor specifieke targets.
- Beperkt tot oplosbare, functionele eiwitten die hun activiteit behouden na zuivering en immobilisatie op de array.
