Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën
September 18th, 2014
Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.
Het overkoepelende doel van deze procedure is om eiwitten van belang op het ER-mitochondriale membraan te immunolabelen met een antilichaam naar keuze en gelijktijdig te analyseren met de mitochondriale functie. Dit wordt bereikt door eerst het weefsel van belang, zoals de hersenen, ruggenmerg of lever van een rat, te verzamelen. De tweede stap is het isoleren van de mitochondriën uit het weefsel, in dit geval het ruggenmerg.
Het ruggenmerg wordt gehomogeniseerd met een dans. Homogenisator en andere orgaantjes en celresten worden verwijderd door middel van een reeks centrifugatiestapjes totdat een ruwe mitochondriale palats is verkregen. Myeline, een belangrijke verontreiniging van centraal zenuwweefsel, wordt verwijderd door mitochondriën te mengen met een oplossing van 12% opti prep en nogmaals te centrifugeren. Vervolgens worden de geïsoleerde mitochondriën gelabeld met een primaire antilichaam naar keuze, gevolgd door een secundair antilichaam geconjugeerd aan een Fluor.
De laatste stap is het toevoegen van fluorescente kleurstoffen om de mitochondriale identiteit of eerder functionele parameters te bevestigen. Uiteindelijk wordt flowcytometrie gebruikt om de relatieve abundantie van mitochondriale altomembranen te tonen gedurende normale fysiologie of ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals microscopie is dat het een hoge doorvoer en snelle kwantificering van duizenden individuele mitochondriën mogelijk maakt.
Dieren die in dit onderzoek werden gebruikt, werden strikt behandeld volgens een protocol goedgekeurd door het institutionele Comité voor de bescherming van dieren van de C-R-C-H-U-M, dat nationale normen volgt zoals beschreven door de Canadian Council on Animal Care Air. Om deze procedure te beginnen, plaats een gehele intacte ruggenmerg die werd verzameld uit een rat in een glazen homogenisator van vijf milliliter die vijf volumes homogenisatiebuffer bevat. Plaats de glazen homogenisator op ijs en homogeniseer het weefsel met de hand totdat er geen grotere weefselstukken meer overblijven, wat ongeveer acht slagen zal duren.
Breng het homogenaat over naar twee of drie microcentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.300 keer G bij vier graden Celsius. Pipet vervolgens het supernatant in een ultracentrifugebuis van vijf milliliter. Voeg 750 microliters homogenisatiebuffer toe aan het pellet en schud het pellet voorzichtig op. Centrifugeer vervolgens de suspensie en schud het pellet opnieuw op.
Nogmaals twee keer om kleine deeltjes te verwijderen, trek al het supernatant naar dezelfde ultracentrifugebuis van vijf milliliter en plaats vervolgens de buizen in een ultracentrifuge rotor. Uitgerust met slingerende emmers, centrifugeer de buizen bij 17.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Wanneer de centrifugatie voltooid is, bewaar het supernatant voor verdere verwerking als de cytosolische fractie van belang is.
Resus pendeer vervolgens het pellet, dat de ruwe mitochondriale fractie is, in vier milliliter homogenisatiebuffer die 50 millimolair kaliumchloride bevat. Centrifugeer het opgeschoonde pellet bij 17.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmer rotor, gooi vervolgens het supernatant weg en schud het pellet voorzichtig op in 800 microliters homogenisatiebuffer in een nieuwe ultracentrifugebuis van vijf milliliter op precies 800 microliters van het opgeschoonde pellet. Pipet vervolgens 200 microliters iod dal naar de 800 microliters van het opgeschoonde pellet om een uiteindelijke concentratie van 12%iod Dal te creëren.
Meng de inhoud van de buis voorzichtig maar grondig met een P 1000 pipette en centrifugeer vervolgens bij 17.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmer rotor. Aspibeer de laag myeline aan de bovenkant van de buis en gooi het supernatant voorzichtig weg, omdat de palats los kan zijn. Resus pendeer het pellet in vier milliliter homogenisatiebuffer. Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 17.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een slingerende emmer rotor.
Gooi het supernatant weg en resus. Suspendeer het pellet in vier milliliter homogenisatiebuffer. Herhaal vervolgens de centrifugatie opnieuw en verwijder het supine-agens resus.
Buig het uiteindelijke pellet in 100 tot 200 microliters homogenisatiebuffer en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Bepaal de hoeveelheid eiwit in elk monster met behulp van een standaard eiwitkwantificeringstest zoals bionische zuurtest of BCA. Bij het voorbereiden van de monsters voor kwantificering, verdun de monsters en de standaardcurve in 2%natriumsulfaat om voldoende solubilisatie van mitochondriën te garanderen.
Voor elke te testen kleuring, pipet 25 microgram van de geïsoleerde mitochondriën in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Zorg ervoor om een ongekleurd monster in elk experiment op te nemen, evenals een geschikte isotypecontrole voor elk getest antilichaam. Centrifugeer elk monster bij 17.000 keer G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius in een tafelmicrocentrifuge. Verwijder vervolgens het supernatant en schud de geïsoleerde mitochondriën op in 50 microliters mitochondriënbuffer.
Voeg 10%vet-vrije BSA toe, incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en voeg vervolgens 20 microgram primaire antilichaam per milliliter oplossing toe. Incubeer de geïsoleerde mitochondriën met het primaire antilichaam gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om het ongebonden antilichaam weg te spoelen, centrifugeer elk monster en gooi het supine-natant weg. Resus pendeer vervolgens voorzichtig het pellet in 200 microliters mitochondriënbuffer en herhaal de centrifugeerstap, gooi het supine-natant weg en schud het pellet op in 50 microliters mitochondriënbuffer.
Voeg 0,5 microgram van het secundaire antilichaam toe per milliliter monster. Incubeer vervolgens de monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Wanneer de incubatie voltooid is, centrifugeer elk monster en gooi het supernatant weg, dat het ongebonden secundaire antilichaam bevat. Reese.
Resus pendeer het pellet in 200 microliters mitochondriënbuffer en centrifugeer het monster. Weer. Verwijder
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het detecteren en kwantificeren van mitochondriale buitenmembraaneiwitten door middel van immunolabeling van geïsoleerde mitochondriën uit knaagdierweefsel, specifiek ruggenmerg. De benadering maakt gelijktijdige analyse van mitochondriale functie mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Mitochondriën spelen een cruciale rol in de cellulaire energiemetabolisme.
- Begrip van mitochondriale functie is essentieel voor het bestuderen van verschillende neurologische aandoeningen.
- Immunolabelingtechnieken kunnen de detectie van specifieke eiwitten verbeteren.
- Flowcytometrie biedt een krachtige methode voor het analyseren van gelabelde cellen.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren en labelen van mitochondriale eiwitten.
- Om de functionele aspecten van mitochondriale subpopulaties te beoordelen.
- Om een protocol te verstrekken dat kan worden aangepast voor verschillende weefsels.
Gebruikte methoden
- Verzameling van knaagdierweefsel (bijv. ruggenmerg).
- Isolering van mitochondriën door homogenisatie en centrifugatie.
- Verwijdering van verontreinigingen zoals myeline met behulp van dichtheidsgradientcentrifugering.
- Immunolabeling met primaire en secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluoroforen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van mitochondriën uit ruggenmergwefsel.
- Effectieve labeling van mitochondriale buitenmembraaneiwitten.
- Flowcytometrie-analyse demonstreerde de gevoeligheid van de methode.
- Mogelijke toepassingen voor het bestuderen van mitochondriale functie bij verschillende ziekten.
Conclusies
- De beschreven methode is een waardevol hulpmiddel voor mitochondriaal onderzoek.
- Het maakt de gelijktijdige beoordeling van eiwitaanwezigheid en mitochondriale functie mogelijk.
- Deze benadering kan worden aangepast voor verschillende weefsels en experimentele omstandigheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, quantitative assessment of mitochondrial outer membrane proteins in rodent tissues, supporting target validation in neurodegenerative and metabolic disease research. By combining immunodetection with functional readouts, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on mitochondrial pathophysiology. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking protein localization to organelle function in a scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding mitochondrial protein mislocalization under pathological conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating outer membrane protein signals with mitochondrial health metrics.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage through quantitative, reproducible readouts of target engagement in isolated organelles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative mitochondrial preparations suitable for downstream screening campaigns.
- Reproducibility: Employs rigorous contamination removal (e.g., myelin depletion) to ensure consistent starting material across experiments.
- Scalability: Enables analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample, supporting high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disorders where outer membrane protein alterations are implicated.
- Translational Continuity: Links target protein detection to functional outcomes (e.g., membrane potential, superoxide production) for mechanism-based biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on concordant changes in target localization and organelle health.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for mitochondrial-focused programs in neuroscience and metabolism.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting novel or disease-altered proteins at the mitochondrial surface.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable mitochondrial samples with built-in functional controls for compound evaluation.
- Analytics: Provides multiplexed readouts (protein labeling, membrane potential, ROS) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects target validation to preclinical continuity through functional mitochondrial readouts that predict pathophysiological relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial target assessment across multiple disease areas and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking target protein detection to mitochondrial function in intact organelles.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through contaminant removal steps and internal functional controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk by validating targets in a disease-relevant organelle context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets based on concordant localization and functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation, antibody validation, and flow cytometry setup.
- Depends on access to centrifugation equipment, fluorophores, and mitochondrial-specific dyes for quality control.
- Necessitates standardization of isolation and staining protocols across teams to ensure data comparability.
- Must account for tissue-specific variables (e.g., myelin content in neural tissue) when adapting to new models.
- Limited by the need for fresh tissue and the inability to assess dynamic protein trafficking in real time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Isolation of Spinal Cord Mitochondria
5:34
Immunolabeling of Isolated Mitochondria for Flow Cytometry
8:06
Assaying Mitochondrial Transmembrane Potential and Superoxide Production by Flow Cytometry
9:30
Acquisition of Immunolabeled Isolated Mitochondria by Flow Cytometry
10:21
Results: Flow Cytometry Analysis of Isolated Mitochondria
11:34
Conclusion
