Name: Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Leer immunodetectie van mitochondriale buitenmembraaneiwitten door flowcytometrie van geïsoleerde mitochondriën uit rattenruggenmerg. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van mitochondriale functie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Laurie Destroismaisons en Sarah Peyrard voor uitstekende technische ondersteuning en Dr.Alexandre Prat voor de toegang tot de flowcytometer. Wij zouden ook graag Dr Timothy Miller erkennen voor zijn bijdrage met betrekking tot de verwijdering van myeline van de voorbereidingen. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Neuromusculaire Research Partnership, de Canadese Stichting voor Innovatie, ALS Society of Canada, de Frick Stichting ALS onderzoek, CHUM Stichting en het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec (CVV). Zowel CVV en NA zijn wetenschappelijke onderzoekers van het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec en CIHR nieuwe onderzoekers. SP wordt ondersteund door de Tim Noël studententijd van de ALS Society of Canada.

Dieren die in deze studie werden in strikte overeenstemming met een protocol (N08001CVsr) door het Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Universite de Montreal (CRCHUM) Institutionele Commissie voor de bescherming van dieren goedgekeurd die de nationale normen zoals die door de Canadese volgt behandeld Raad over Animal Care (CCAC). Bereid alle reagentia die nodig zijn om dit protocol (Tabel 1) uitvoeren. Alle andere details met betrekking tot uitrusting, voorraden en leveranciers zijn te vinden in de lijst van materialen. <img alt="Tabel 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tabel 1 Buffer Samenstellingen. 1 Verzameling van Rat Spinal Cord <ol><li> Diep verdoven van de rat (Sprague Dawley) met 4% isoflorane. Verifiëren verdoving door een gebrek aan reflex na knijpen van the voorpoot. Euthanaseren de ratten onthoofd via guillotine. Deze methode van euthanasie de voorkeur boven andere, die het ruggenmerg kan vervalsen. </li><li> Snijd de huid van de rug naar de ruggengraat bloot. Snijd de wervelkolom met been schaar net boven het schaambeen. Visualiseer de opening van de wervelkolom. </li><li> Plaats een injectiespuit 10 ml, met een 200 ul pipetpunt (verbonden via enigszins smelten boven vlam), gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), in de wervelkolom. </li><li> Spoel het ruggenmerg door een medium voldoende druk op de plunjer. </li><li> Als er bloed aanwezig is op het ruggenmerg, spoelen met PBS alvorens de volgende stap. OPMERKING: Deze methode is ook gevalideerd voor de hersenen en de lever. Als waaronder deze weefsels verzamelen halve hersenen van de rat gedood en een stuk lever gelijk gewicht aan het ruggenmerg. Alle andere stappen blijven identiek. </li></ol> 2 Isolatie van Spinal Cord Mitochondria (Aangepast van Vande Velde et al. 4) <ol><li> Verzamel de gehele intact ruggenmerg en plaats in 5 ml glashomogenisator met 5 volumes (~ 3,25 ml) homogenisatiebuffer (HB). Voor een optimaal herstel van geïsoleerde mitochondriën, voeren alle stappen op het ijs of in een koude kamer. Homogeniseren weefsel met de hand tot er geen grote stukken weefsel blijven, ongeveer acht slagen. Plaats homogenaat in twee (2 ml) of drie (1,7 ml) microcentrifuge buisjes. Centrifuge 1300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een microcentrifuge benchtop. </li><li> Recover supernatant en plaats in een 5 ml ultracentrifuge buis. Voeg 750 ul (~ 0,5 volumes) HB aan de pellet met microcentrifugebuisje en voorzichtig resuspendeer de pellet. Herhaal centrifugeren en resuspensie stappen nog twee keer. Pool alle bovenstaande vloeistoffen (S1a en S1b) in dezelfde 5 ml ultracentrifuge buis boven. Deze stap dient om kleine vuil te verwijderen. </li><li> Centrifuge gepoolde S1 met behulp van een ultracentrifuge uitgerust met een swingende emmer rotof en centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Blijf supernatant (S2) voor verdere verwerking als de cytosolische fractie van belang (bijvoorbeeld Western blot analyse). Resuspendeer de pellet (P2), het ruwe mitochondriale fractie in 4 ml HB + 50 mM KCl. Centrifuge 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor. Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet (P3) in 800 ul HB. OPMERKING: Mitochondria worden gewassen met HB + 50 mM KCl alle niet-specifieke mitochondriën geassocieerde verontreinigingen. </li><li> In een nieuwe 5 ml ultracentrifuge buis, voeg precies 800 ul geresuspendeerde pellet (P3). </li><li> Om deze tube, 200 pl iodixanol (dichtheidsgradiënt medium), waardoor een eindconcentratie van 12% iodixanol maken. Meng de inhoud van de buis voorzichtig maar grondig door pipetteren met een P1000. Toevoeging van iodixanol eerste, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd pellet (P3) kan de voorkeur verdienen om grondig mengen te vergemakkelijken. Centrifugeren in een ultracentrifuge met een swinging bucket rotor bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> OPMERKING: Lever geen myeline bevatten en daarom is deze stap is niet nodig als alleen de lever wordt verwerkt. Echter, als de lever wordt gelijktijdig verwerkt met CNS mitochondriën, is het raadzaam om alle weefsels gelijk te behandelen. </li><li> Zuig de laag van myeline bovenaan de buis en verwijder de bovenstaande vloeistof. Pellet mogelijk los zit. Resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Centrifugeer opnieuw bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Herhaal het centrifugeren en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer de uiteindelijke pellet (P7) in 100-200 ul HB en overbrengen in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Deze steekproef bevat geïsoleerde mitochondriën. </li><li> Ga verder met eiwit kwantificering. Verdun monsters en de standaard kromme in 2% natriumdodecylsulfaat (SDS) passende solubilisatie van mitochondria duri waarborgenng eiwit kwantificering. </li></ol> 3 immunolabeling van Geïsoleerde Mitochondriën voor flowcytometrie <ol><li> Voor elke kleuring mengsel te testen, pipet 25 ug geïsoleerde mitochondria in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Inclusief een ongekleurde monster in elk experiment; en voor elk antilichaam, moet u een monster voor de juiste isotypecontrole bevatten. </li><li> Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C in een bench-top microcentrifuge. </li><li> Verwijder de supernatant en resuspendeer geïsoleerde mitochondria in 50 ul Buffer Mitochondria (M buffer) aangevuld met 10% vetzuurvrij BSA gedurende 15 min bij 4 ° C (blokkeringsstap). OPMERKING: Bij etikettering incubaties uitgevoerd in een koelkast bij 4 ° C. </li><li> Voeg primair antilichaam (konijn anti-MFN2, 20 ug per ml) aan de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. OPMERKING: Bepaal een optimale concentratie van elk antilichaam empirisch door titratie. Vanwege de variabiliteit in concentratie en / of purity, verschillende partijen van hetzelfde antilichaam van dezelfde fabrikant kan leiden tot verschillende resultaten; Daarom titratie nodig voor elke nieuwe partij antilichamen. </li><li> Spoel ongebonden primaire antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 50 ul M Buffer. </li><li> Voeg secundair antilichaam (ezel anti-konijnen IgG fycoerythrine (PE), 0,5 ug per ml) aan de buis en incubeer de monsters gedurende 30 min bij 4 ° C, beschermd tegen licht. </li><li> Spoel ongebonden secundair antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 500 pi M Buffer. </li><li> Om ervoor te zorgen gebeurtenissen zijn in feite mitochondriën, vlek geïsoleerd mitochondria met eenmitochondriën specifieke fluorescente kleurstof gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Als kleuring van andere functionele parameters (mitochondriale transmembraanpotentiaal- of superoxide productie) gewenst is, ga dan naar stap 4 Zo niet, ga dan naar stap 5 voor de overname. OPMERKING: Het is belangrijk om te controleren of het emissiespectrum van het secundaire antilichaam is compatibel met dat van de functionele kleurstoffen. Bijvoorbeeld als controle mitochondriale zuiverheid met een commercieel kleurstof met spectrale eigenschappen die vergelijkbaar FITC en transmembraanpotentiaal met tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), een levensvatbare tweede antilichaam moet allofycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Voeg compensaties controles, dat wil zeggen, een monster immunolabeled of gekleurd met een enkele fluorofoor, indien van toepassing. </li><li> Over te dragen aan een buis die geschikt zijn voor het laden doorstroomcytometer. (Voor de kleine steekproef, een microtiterplaat buis wordt geplaatst binnen 3 ml stromingscytometer buis te vergemakkelijken.) Houd monsters op ijs en onmiddellijk overgaan totstromingscytometer voor overname. </li></ol> 4 Het testen Mitochondriale transmembraanpotentiaal- en Mitochondriale superoxide productie door flowcytometrie <ol><li> Controleer geïsoleerde mitochondria een intact transmembraanpotentiaal door kleuring met 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Ter vergelijking van transmembraanpotentiaal tussen monsters en populaties, gebruik van lagere / niet-quenching concentratie van TMRM (1 tot 30 nM) meer geschikt kunnen zijn 6. <ol><li> Als controle voor TMRM kleuring, vlek geïsoleerde mitochondria 100 nM TMRM in aanwezigheid van 100 uM carbonyl cyanide m-chloor fenyl hydrazine (CCCP), een mitochondriale ontkoppelaar die mitochondria zal depolariseren. De concentratie van CCCP vereist om de mitochondriën depolariseren kan lager zijn indien lagere concentraties kleurstof worden gebruikt. </li></ol></li><li> Controleer of geïsoleerde mitochondria produceren mitochondriale superoxide door staining met een geschikt mitochondrial superoxide indicator 7, ook in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. <ol><li> Als controle voor mitochondriële superoxideproductie, vlek geïsoleerde mitochondria kleurstof in aanwezigheid van 10 uM Antimycin A, een remmer van complex III van de mitochondriale ademhalingsketen dat superoxide productie verhogen. </li></ol></li></ol> 5 Verwerving en Analyse van immunolabeled Geïsoleerde Mitochondriën door flowcytometrie <ol><li> Instrument opgezet: Switch voltages van lineair naar de modus te melden bij de analyse van geïsoleerde mitochondriën en stel spanningen vergemakkelijken (FSC: 450; SSC: 250). Controleer of gebeurtenissen verzameld FSC-A (stippellijn) modus als FSC-W (breedte) en FSC-H (hoogte), kunnen wambuizen (exclusief dwz twee gebeurtenissen, die door de detector tegelijkertijd ) in de analyse van de collectie post-data. Stel het aantal evenementen te innen tot 100.000. Verwerven compensatie controles, Indien van toepassing. </li><li> Data-acquisitie: Voor data-acquisitie, vermijd vortexen monsters. In plaats meng door zachtjes te tikken buis. Aanvankelijk events verzamelen bij een lage druk gedurende gating. Poort op de totale bevolking. Pas spanningen histogrammen bijgevolg meestal de piek van het ongekleurde monster is gelijk aan het tweede decennium (10 2). Zodra poorten zijn gevestigd, en monsters worden verwerkt, kan de druk worden overgeschakeld naar hoog. </li><li> Analyse: Visualiseer wambuizen door het plotten van FSC-W versus FSC. Identificeer borstrokken en wambuizen. Poort op singlets. Selecteer de mitochondriale populatie door gating op gebeurtenissen die positief zijn gekleurd met een mitochondriaal-selectieve kleurstof. </li><li> Bepaal achtergrond labeling van isotype controle. De isotype controlemonster, het percentage bepalen van de mitochondriale etikettering positief MFN2 antilichaampopulatie. </li></ol>

<ol><li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li>
<li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes%3A+from+animalcules+to+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li>
<li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li>
<li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+five+dimensions%3A+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
<li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li>
<li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li>
<li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li>
<li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li>
<li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dynamin-related+protein+1%2C+a+mediator+of+mitochondrial+fission%2C+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li>
<li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li>
<li>Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het wordt steeds duidelijker dat de mitochondriën zijn belangrijke spelers in zowel de normale fysiologie en ziekte. Terwijl immunoblotting kan bepalen welke eiwitten binnen mitochondria of het mitochondriale oppervlak in een bepaalde toestand, deze methode rapporten over het gemiddelde van de gehele populatie. Deze methode kan geen informatie over de relatieve abundanties van mitochondriale subpopulaties of subsets opleveren. Hoewel het is al eerder werd aangenomen dat alle mitochondriën zijn gemaakt gelijk, wordt het ...

Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die meerdere rondes van kernsplijting en kernfusie ondergaan, worden vervoerd naar sites van hoge vraag naar energie en snel te reageren op fysiologische stimuli 1. Aangezien meer en meer erkend dat mitochondriën in verschillende weefsels, zelfs verschillende cellulaire compartimenten, hebben verschillende functionele profielen nieuwe methoden nodig om deze verschillende mitochondriale subsets identificeren. Microscopie verschaft een middel waarmee individuele mitochondria worden gevisualiseerd en de aanwezigheid van een eiwit op of in mitochondriën kan worden bepaald door immunofluorescentie 2. Echter, kwantitatieve analyse van deze methode is arbeidsintensief en is meer geschikt voor experimenten met geïmmortaliseerde of primaire cellijnen. De studie van individuele mitochondria uit weefsel aanzienlijk moeilijker en de meeste methoden niet mogelijk voor gemakkelijke identificatie van mitochondriale subsets gelijktijdig met de evaluatie van de mitochondriale functie 3. Om deze hindernis, een nieuwe werkwijze voor mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsels en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie immunolabel aanpakken ontwikkeld. Dit maakt de snelle detectie en kwantificering van eiwitten gelokaliseerd in de buitenste mitochondriale membraan, die aan microscopie opzichte analyse is veel minder arbeidsintensief en maakt de analyse van duizenden mitochondria in een enkel monster. Deze test kan worden toegepast op het lot en de relatieve hoeveelheid mitochondriaal buitenste membraaneiwitten die geacht constitutief aanwezig in de mitochondriën te volgen, de rekrutering van eiwitten aan het oppervlak mitochondriale of de detectie van proteïnen mislocalized naar de mitochondriën bij pathologische omstandigheden. Bovendien is de integratie van conventionele fluorescente indicator kleurstoffen maakt het gelijktijdige evaluatie van bepaalde aspecten van mitochondriale functie in verschillende mitochondrialesubpopulaties.

<table><tbody><tr><td>Ratten</td><td>Charles River</td><td>Stamcode 400</td><td>Volwassen (9 weken tot 18 weken) mannelijke of vrouwelijke ratten kunnen worden gebruikt voor het isolatieprotocol. Het gewicht van ratten is afhankelijk van geslacht en leeftijd (mannen tussen 300 tot 500 g en vrouwen tussen 200 tot 350 g) worden doorgaans gebruikt.</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Kontes Glass Co. </td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparant, dunwandig&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor en emmers&nbsp;&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, dichtheidsgradiëntmedium</td></tr><tr><td>Vetzuurvrij bovien Serum Albumine</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Moet vetzuurvrij zijn voor mitochondriën</td></tr><tr><td>Natriumsuccinaat dibasic hexahydraat&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Mitofusin2 antilichaam</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Konijn IgG</td><td>Jackson Immuno Research&nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Konijn IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titerbuis</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>Voor monsteropname door middel van flowcytometrie&nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc. </td><td></td><td>Software gebruikt voor analyse</td></tr><tr><td>BCA-eiwitbepaling kit&nbsp;&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford-test wordt niet aanbevolen omdat deze niet compatibel is met hoge concentraties SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetectie van outer membraaneiwitten door flowcytometrie van geïsoleerde mitochondriën

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methoden voor het opsporen en monitoren mitochondriale buitenste membraan eiwit componenten in dierlijke weefsels zijn van vitaal belang om mitochondriale fysiologie en pathofysiologie bestuderen. Dit protocol beschrijft een techniek waarbij mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel immunologisch en door flow cytometrie geanalyseerd. Mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren ruggenmerg en onderworpen aan een snelle verrijkingsstap om myeline, een belangrijke verontreiniging van mitochondriale fracties bereid uit zenuwweefsel verwijderen. Geïsoleerde mitochondria worden dan gelabeld met een antilichaam van keuze en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam. Analyse door flow cytometrie controleert de relatieve zuiverheid van mitochondriale preparaten door kleuring met een mitochondriale specifieke kleurstof, gevolgd door detectie en kwantificering van eiwit immunologisch. Deze techniek is snel, kwantificeerbare en high-throughput, waardoor de analyse van honderden duizenden mitochondria per monster. Het is van toepassing op nieuwe p beoordelenroteins het mitochondriale oppervlak onder normale fysiologische omstandigheden en de eiwitten die in pathologie mislocalized kunnen worden bij dit organel. Belangrijk is, kan deze methode worden gekoppeld met fluorescentie-indicator kleurstoffen verslag over bepaalde activiteiten van mitochondriale subpopulaties en haalbaar is voor mitochondriën van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) en lever.

Mitochondriën afgeleid van rat ruggenmergen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht op Mitofusin2 (MFN2), een eiwit betrokken bij de fusie van de buitenmembraan van mitochondria 8. Na isolatie en labeling met een MFN2 specifiek antilichaam en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, mitochondria worden verwerkt door flowcytometrie (figuur 1). Volgende data-acquisitie, worden monsters geanalyseerd met behulp van flowcytometrie analyse software, door eerst te visualiseren al...

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Het overkoepelende doel van deze procedure is om eiwitten van belang op het ER-mitochondriale membraan te immunolabelen met een antilichaam naar keuze en gelijktijdig te analyseren met de mitochondriale functie. Dit wordt bereikt door eerst het weefsel van belang, zoals de hersenen, ruggenmerg of lever van een rat, te verzamelen. De tweede stap is het isoleren van de mitochondriën uit het weefsel, in dit geval het ruggenmerg.Het ruggenmerg wordt gehomogeniseerd met een dans. Homogenisator en andere orgaantjes en celresten worden verwijderd door middel van een reeks centrifugatiestapjes totdat een ruwe mitochondriale palats is verkregen. Myeline, een belangrijke verontreiniging van centraal zenuwweefsel, wordt verwijderd door mitochondriën te mengen met een oplossing van 12% opti prep en nogmaals te centrifugeren. Vervolgens worden de geïsoleerde mitochondriën gelabeld met een primaire antilichaam naar keuze, gevolgd door een secundair antilichaam geconjugeerd aan een Fluor.De laatste stap is het toevoegen van fluorescente kleurstoffen om de mitochondriale identiteit of eerder functionele parameters te bevestigen. Uiteindelijk wordt flowcytometrie gebruikt om de relatieve abundantie

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the labeling of neuronal cells with antibodies for mitochondrial respiratory chain complexes, mitochondrial DNA-associated protein, and mitochondrial outer membrane protein, followed by flow cytometry to quantify their levels.

Measurement of Multiple Mitochondrial Parameters in Neurons using Flow Cytometry

Vergelijking van het mitochondriale membraanpotentieel tussen monsters levert waardevolle informatie op over de cellulaire status. Gedetailleerde stappen voor het isoleren van mitochondriën en het beoordelen van de respons op remmers en ontkoppelaars met behulp van fluorescentie worden beschreven. De methode en het nut van dit protocol worden geïllustreerd door het gebruik van een celcultuur en een diermodel van cellulaire stress.

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Mitophagy, de selectieve afbraak van mitochondriën, heeft betrokken bij mitochondriale homeostase en in verschillende ziekten bij de mens is gedereguleerd. Handige experimentele methoden voor het meten van de activiteit van de mitophagy zijn echter zeer beperkt. Hier bieden we een gevoelige test voor het meten van de activiteit van de mitophagy met behulp van stroom cytometry.

Gevoelige meting van Mitophagy door Stroom Cytometry met behulp van de pH-afhankelijke fluorescerende verslaggever mt-Keima

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Leer immunodetectie van mitochondriale buitenmembraaneiwitten door flowcytometrie van geïsoleerde mitochondriën uit rattenruggenmerg. Deze methode maakt gelijktijdige analyse van mitochondriale functie mogelijk.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Meer video's verkennen