Name: Generatie van transgene Hydra Door Embryo Microinjection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer transgene Hydra genereren door micro-injectie van plasmide-DNA in embryo's. Deze methode maakt stabiele transgene lijnen voor genetisch onderzoek naar ontwikkeling en regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Award voor HL en een NIH-subsidie ​​(R24 GM080527) om RESCEJ was een NRSA Postdoctoraal (NIH F32GM9037222) en wordt momenteel ondersteund door een Mentored Research Scientist Development Award van de National Institute on Aging (K01AG04435). We willen de reviewers bedanken voor nuttig commentaar.

1 Voorbereiding van plasmide DNA, naalden en injectie Gerechten <ol><li> Bereid het plasmide-DNA met behulp van een High Speed ​​Maxi of Midi kit en concentreer het DNA tot 2,5 mg / ml met ethanol precipitatie. De DNA pellet moet worden opgelost in nuclease-vrij gedeïoniseerd water. Bewaar het DNA in 10-20 pi aliquots bij -20 ° C. (Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van beschikbare vectoren) </li><li> Een injectie schotel middels agarose een trog construeren voor het vasthouden van embryo&#39;s in een 100 x 15 mm petrischaal. <ol><li> Plaats een 75 x 50 glazen microscoop dia in een 100 x 15 mm petrischaal in een hoek. Giet ongeveer 50 ml van 2% agarose gesmolten in Hydra medium 24 in de petrischaal. Als alternatief, giet de agarose in de schaal eerst en drijven een &quot;Micro-injectie Fish Mold&quot; bovenop. </li><li> Nadat de agarose is gestold, verwijder het glaasje of de mal. Als een glasplaatje werd gebruikt, te snijden overtollige agarose weg met een scheermes blade aan een wand te vormen. Giet Hydra medium in de schotel en onmiddellijk te gebruiken of op te slaan bij 4 ° C totdat het nodig is. Opmerking: Injectie gerechten worden hergebruikt indien bewaard bij 4 ° C tussen toepassingen. </li></ol></li><li> Trek naalden van borosilicaatglas capillairen met een filament op de micropipet trekker met de volgende voorwaarden: verwarmen 525, trek 75, snelheid 100 keer 50 WINKEL de naalden door ze in een smalle strook klei persen in een petrischaal zodat zij die evenwijdig aan de bodem van de schaal. </li><li> Aan de injectie-oplossing bereiden combineren 3 pi 2,5 mg / ml plasmide-DNA-oplossing met 2 ui 10% fenolrood. Vortex de oplossing kort draai vervolgens gedurende 10 minuten bij maximale snelheid in een microcentrifuge om eventuele deeltjes die de naald kunnen verstoppen. </li><li> Onder een dissectiemicroscoop klem de naald enkele millimeters van de tip met een tang om een ​​kleine opening te creëren. Opmerking: Er is enige flexibiliteit in de juiste grootte van de opening omdat de druk kan worden aangepast in stap 3.3 deze variatie tegemoet. </li><li> Plaats de petrischaal zodat houdt de naald in een verticale stand met de punt naar beneden. Plaats de naald met ongeveer 0,5 pi injectie-oplossing door pipetteren vloeistof in het achtereinde van de naald. Laat capillaire werking om de oplossing te trekken naar de punt van de naald. </li></ol> 2 Voorbereiding van embryo&#39;s voor Injectie <ol><li> Op een dagelijkse basis te scannen de Hydra AEP stam cultuur voor poliepen produceren van eieren. Verzamel deze poliepen en leg ze opzij in een aparte cultuur schotel. Neem deze poliepen om de paar uur gedurende de dag om de voortgang van de vorming van ei bewaken. Wanneer eieren breken door het ectoderm en zitten op een ring van ingetrokken ectodermale cellen zijn ze klaar voor injectie 25. Plaats deze poliepen in een schotel met verschillende Hydra die testes hebben voor ten minste 1 uur voor injectie op voor de bevruchting. Hydra &lt;/ Em&gt; mannetjes zaadcellen vrijkomen zonder speciale manipulatie. </li><li> Als vrouwtjes in de AEP kolonie volledig gevormde eieren, die ongeveer 400 micrometer in diameter 25, of 1 tot 8-cellig stadium embryo&#39;s, verzamelen ook deze voor injectie. Direct injecteren embryo&#39;s die klieven begonnen. Opmerking: Het is niet mogelijk om het verschil tussen de volledig gevormde eieren en eencellige zygoten zeggen, waardoor deze worden geïncubeerd bij mannen vóór injectie. </li><li> Vóór injectie, is het grootste deel van de ouderlijke weefsel boven en onder het embryo met een scalpel met een # 15 blad. Laat alleen embryo met een klein stukje body kolom gehecht te worden gebruikt om de embryo manipuleren tang indien nodig. Opmerking: Het weefsel dat uit de buurt van het embryo wordt ontleed zal regenereren en moet worden opgeslagen om ervoor te zorgen dat de vrouwen blijven in de Hydra kolonie. </li><li> Met behulp van een Pasteur pipet, verplaats&#39;s naar de injectie schotel, regelen parallel aan de wand van deagarose trog. </li></ol> 3 Micro-injectie van plasmide DNA <ol><li> Monteer de microinjector op een magnetische standaard die zit op een ijzeren plaat. Monteer de injectie houder, dat is het deel van de microinjector dat de naald heeft, op een joystick micromanipulator. Monteer de joystick manipulator aan de ijzeren plaat, met een magnetische voet. Plaats deze gehele set-up op de rechterkant van een dissectie microscoop en plaats de injectie houder zodat het zichtbaar is in het waarnemingsveld. </li><li> Zet de injectie schotel met embryo&#39;s onder de dissectiemicroscoop georiënteerd dat de verticale wand van de goot agarose naar links. Steek de naald in de injectiespuit houder en laat de punt van de naald in de Hydra medium in de schaal. </li><li> Draai langzaam de knop van de spuit met de klok mee tot minerale olie vult de top van de naald en een gestage stroom injectieoplossing waargenomen verlaten van de naald in de Hydreen medium. Als de stroom te sterk is, hoe lager de druk door naar links te draaien aan de knop. Oefen deze stap om een geschikte druk, die afhankelijk van de grootte van de naald opening (dat wil zeggen hoe de naald werd geknipt in stap 1.5) routinematig te verkrijgen. Opmerking: Als de stroom te sterk is, zal het embryo niet de injectie overleven. </li><li> Tijdens het bekijken door de microscoop ontleden, verplaatst u de injectie gerecht zodat de eerste embryo zich in het midden van het veld. Verplaats de naald zodat raakt dat embryo. Gebruik de micromanipulator om het embryo met de naald prikken. Opmerking: de verticale wand van de agarose trog zal het embryo te houden van wordt verdrongen door de naald. </li><li> Laat de injectie-oplossing te stromen in het embryo 1 of 2 sec en dan snel te verwijderen van de naald. Als de embryo meerdere cellen, injecteren elke cel afzonderlijk. Tang om de embryo heroriënteren naar de volgende cel lijn met de punt van de naald. </li><li> Na de eerste embryo wordt geïnjecteerd, bewegen de schotel, zodat de volgende embryo is in de injectie en herhaal de procedure; doorgaan totdat alle embryo&#39;s geïnjecteerd. </li></ol> 4 kweken en broedeieren van embryo&#39;s <ol><li> Verplaats alle geïnjecteerde embryo&#39;s in een schotel met een paar Hydra die testikels (dit is dat alle embryo bevrucht). Incubeer de embryo&#39;s in een 18 ° C incubator, terwijl ze blijven embryogenese. </li><li> Zodra de cuticula stadium is bereikt, beweegt elke geïnjecteerde embryo een individuele well van een 24-wells plaat vol Hydra medium. </li><li> Incubeer de geïnjecteerde embryo&#39;s gedurende 2 weken in het donker bij 18 ° C. </li><li> Na de 2 weken incubatietijd, controleer elke geïnjecteerde embryo onder de stereomicroscoop. Noteer alle gevallen waarin de cuticula-stadium embryo losgemaakt van het stukje ouderlijke weefsel en het oorspronkelijke weefsel geregenereerd. Verwijder deze geregenereerd poliep onmiddellijk zodat het niet mistaken voor een nieuwe hatchling. </li><li> Verplaats de schotel van de geïnjecteerde embryo&#39;s onder een aquarium licht bij RT. Controleer de platen elke dag en verzamel jongen. Nieuwe jongen zal wit zijn, omdat de typische roze kleur van Hydra poliepen afkomstig van de Artemia ze eten. </li><li> Let op de jongen onder een fluorescentiemicroscoop om transgene expressie te detecteren. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Hydra reproduceert routinematig ongeslachtelijk, maar vereist prikkels uit de omgeving naar de productie van gameten beginnen. Deze stimuli zijn niet goed gedefinieerd voor de meeste Hydra soorten en kunnen van stam tot stam. Een belangrijke hindernis voor de productie van transgene Hydra is het verkrijgen van embryo&#39;s regelmatig omdat het moeilijk in een laboratoriumomgeving te induceren Hydra seksuele thuis hoort. De AEP stam 25 echter produceert gameten gemakkelijk i...

Hydra is gebruikt voor regeneratie, patroonvorming bestuderen en stamcellen ongeveer 250 jaar 2 Hydra een eenvoudige body opgesteld met drie cellijnen. Ectodermale epitheel, endodermale epitheliale en interstitiële. Het buisvormige lichaam wordt gevormd door de ectodermale en endodermale epitheliale lijnen, die elk een enkele cellaag. Alle epitheliale cellen in de kolom lichaam mitotische. Wanneer epitheelcellen verplaatst naar de uiteinden 3, de kop (mond en tentakels) aan het einde orale of voet (basale schijven) op aboral zij daartoe arresteren in de G2 fase van de celcyclus en veranderen lot van de cel 4. De cellen van het interstitiële lineage verblijf op de tussenruimten tussen de epitheelcellen. Deze lijn wordt ondersteund door multipotente stamcellen die zich in het ectodermale epitheliale laag van het lichaam kolom 5. De interstitiële stamcellen leiden tot drie somatische cell types (zenuwen, klier cellen, en nematocytes) en de kiemcellen 6,7. Als lid van de phylum Cnidaria, de zuster groep om alle bilateria, Hydra kan licht werpen op fundamentele biologische processen verdeeld onder meercellige dieren. Tot voor kort werden deze pogingen belemmerd door het gebrek aan betrouwbare methoden voor de verstoring van de genfunctie. Echter, met de ontwikkeling van transgene methodologie 1, we zijn nu in staat om optimaal te profiteren van Hydra tot een beter begrip van de fundamentele mechanismen gebruikelijk om meercellige dieren, zoals stamcel functie, regeneratie, en patroonvorming krijgen. Hydra Transgene lijnen worden vastgesteld door injectie van plasmide DNA in embryo, wat resulteert in willekeurige integratie en chimere expressie in een aanzienlijke frequentie van jongen. Een lijn uniforme expressie in een bepaalde lijn kan worden vastgesteld door ongeslachtelijke voortplanting. Het vermogen om klonale vermeerderen transgenic Hydra lijnen is een voordeel boven de meeste diermodellen, die kan worden vermeerderd alleen geslachtelijke voortplanting. Bovendien kunnen transgene cellen gemakkelijk in vivo worden gevolgd door de transparantie van het dier en de afwezigheid van endogene fluorescerende eiwitten 8. In de zeven jaar sinds de eerste transgene Hydra lijnen werden 1, dergelijke lijnen zijn gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Expressie van proteïnen verschillende celtypen is het mogelijk om celbeweging te volgen, veranderingen in celvorm waarnemen en volgen celtypes zowel wildtype omstandigheden en na chemische verstoring 1,5,9-12. Bovendien expressie van verschillende proteïnen de diverse lineages maakt FACS isolatie van specifieke celpopulaties. Deze techniek is gebruikt voor het sequencen van stamcellen specifiek mRNA en afstammings-specifieke RNA&#39;s 13,14. Terwijl de promotor vaneen van de twee Hydra actinegenen is meest gebruikt, enkele celtype specifieke promotors geïdentificeerd en gebruikt om expressie van GFP rijden transgene Hydra 9,11,15,16. In de toekomst zal celtype specifieke promotors zorgen voor waarneming en verzameling van specifieke celtype. Bovendien werd een transgene benadering succes gebruikt om de cis-werkende regulerende elementen van de promoter Wnt3 17 definiëren. De ontwikkeling van transgene werkwijzen Hydra biedt een robuuste benadering voor het testen van de functie van genen door ectopische expressie, overexpressie en knockdown. Transgene dieren gemaakt die fluorescent-gemerkte eiwitten tot expressie teneinde zowel de functie en cellulaire lokalisatie 18-20 onderzocht. Daarnaast is de expressie van RNA haarspelden in de 3&#39;UTR van een GFP-transgen leidt tot knockdown van doelgenen 21,22. In deze benaderingen GFP moet identificerenen volgen de transgene weefsel tijdens de creatie van de transgene lijn. Het is echter waarschijnlijk dat in sommige gevallen de GFP molecuul zou interfereren met de functie van het gecodeerde eiwit. Een recente studie toont aan dat Hydra genen kan worden geregeld in een operon configuratie, dwz polycistronische transcripten gemaakt, die vervolgens worden gescheiden door trans-spliced ​​leader toevoeging afzonderlijk 23 vertaald. Door een gen dat codeert voor een eiwit of een RNA haarspeld in de stroomopwaartse positie van een operon en een fluorescent eiwit gen in de stroomafwaartse positie, kan een transgeen weefsel te volgen zonder het gen dat voor het eiwit of RNA haarspeld taggen. Deze werkwijze is gebruikt om een RNA haarspeld in een operon configuratie met DsRed2 drukken om te komen gen knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>Email: Celina Juliano op celina.juliano@yale.edu of Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>High Speed Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Glass Microscope Slide</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Fish Mold</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass with Filament</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, 10 cm lengte</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Jewelers Forceps, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Iron Plate</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van transgene hydra door embryo microinjection

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Als lid van het fylum Cnidaria, de zustergroep van alle bilaterians, kan Hydra licht werpen op fundamentele biologische processen die gedeeld worden door meercellige dieren. Hydra wordt gebruikt als een model voor de studie van regeneratie, patroonvorming en stamcellen. Echter, onderzoeksinspanningen zijn gehinderd door een gebrek aan een betrouwbare methode voor genperturbaties om moleculaire functies te bestuderen. De ontwikkeling van transgene methoden heeft de studie van Hydra biologie nieuw leven ingeblazen1. Transgene Hydra maken het mogelijk om levende cellen te volgen, te sorteren om pure celpopulaties te verkrijgen voor biochemische analyse, manipulatie van genfunctie door knockdown en overexpressie, en analyse van promotorfunctie. Plasmide-DNA geïnjecteerd in embryo's in een vroeg stadium integreert willekeurig in het genoom vroeg in de ontwikkeling. Dit resulteert in jongen die transgenen expresseren in stukken weefsel in een of meer van de drie lijnen (ectodermale epitheel, endodermale epitheel of interstitieel). Het succespercentage van het verkrijgen van een jong met transgeen weefsel is tussen de 10% en 20%. Aseksuele vermeerdering van de transgene jong wordt gebruikt om een uniform transgene lijn in een bepaalde lijn te vestigen. Het genereren van transgene Hydra is verrassend eenvoudig en robuust, en hier beschrijven we een protocol dat gemakkelijk kan worden geïmplementeerd tegen lage kosten.

Oprichting van transgene Hydra lijnen Feed transgene jongen om de 2-3 dagen met Artemia naupliën. Hatchlings soms niet eten voor een dag of twee na het uitkomen. Sommige nieuwe jongen zal nooit eten, en dus zal het niet overleven. Als het jong is transgene in ofwel de ectodermale (Figuur 1A) of endodermaal epitheelweefsel, zodat het dier uit te lopen en het verzamelen van de knoppen die de meeste transgene weefsel (Figuur 1B, C) ​​te hebben. D...

Stabel transgenetische Hydra worden gemaakt door micro-injectie van plasmide DNA in embryo's, gevolgd door willekeurige genomische integratie en aseksuele voortplanting om een uniforme lijn te vestigen. Transgenetische Hydra worden gebruikt om celbewegingen te volgen, genen overexpresseren, promotorfunctie te bestuderen, of genexpressie te onderdrukken met behulp van RNAi.

Generatie van transgene Hydra Door Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Het algemene doel van deze procedure is om plasma-DNA micro-injecteren in hydra-embryo's om transgene lijnen te produceren. Dit wordt bereikt door eerst een plasma-DNA-oplossing te bereiden en deze in een injectienaald te laden. Vervolgens wordt de plasma-DNA-oplossing geïnjecteerd in hydra-embryo's tussen de een en acht celstadia.Vervolgens worden de hydra-embryo's ontwikkeld en uitgebroed en worden juvenielen met transgeen weefsel geselecteerd. De laatste stap is om een uniforme transgene lijn te produceren door middel van aseksueel ontluik van het oorspronkelijke transgene dier. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om transgene expressie in hydra te visualiseren.Deze methode is ontworpen voor onderzoekers die transgene hydrolijnen willen maken tegen lage kosten, waardoor een bredere toepassing van deze nuttige technologie mogelijk is, zowel voor huidige hydro-onderzoekers, maar ook voor degenen die net willen beginnen met het gebruik van dit model. Transgene hydra worden gebruikt om weefseldynamiek, eiwitlokalisatie, genfunctie door knockdown en overexpressie, en ook promotorfunctie te bestuderen. Na het bereiden van plasma-DNA volgens het tekstprotocol, bereid een injectieschaal voor door eerst een 75 bij 50 glazen microscoop in een 100 bij 15 millimeter petrischaal op een hoek te plaatsen. Los 2% agros op in 50 milliliters hydra-medium. Laat het afkoelen. Giet het vervolgens in de petrischaal. Nadat de agros is gestold, verwijdert u de glazen plaat en snijdt u met het scheermes eventueel overtollig agros weg om een muur te vormen.Pour vervolgens onmiddellijk hydra-medium in de schaal en gebruik het onmiddellijk of bewaar het op vier graden Celsius tot het nodig is. Om de injectieoplossing te bereiden, combineer je drie microliters van 2,5 milligram per milliliter plasma-DNA-oplossing met twee microliters van 10% fenolrode oplossing. Vorm de oplossing kort en draai deze vervolgens 10 minuten op maximale snelheid in een microcentrifuge om eventuele deeltjes die de naald onder een disserpeermicroscoop kunnen verstoppen te verwijderen.Gebruik een pincet om de naald een paar millimeter van de punt af te knippen om een kleine opening te maken. Orienteer de petrischaal met de naald zodat de naald in een verticale positie staat met de punt naar beneden. Pipetteer vervolgens ongeveer 0,5 microliter injectieoplossing in het achterste uiteinde van de naald.Om embryo's voor injectie voor te bereiden, begint u met het scannen van een hydra, een EP-stamcultuur voor poliepen die eieren produceren. Verzamel deze poliepen en breng ze over in een aparte kweekschaal. Observeer deze poliepen om de paar uur gedurende de dag om de voortgang van de eivorming te controleren.Wanneer eieren door het ectoderm breken en op een ring van ingetrokken dermale cellen zitten, zijn ze klaar voor injectie. Plaats poliepen met eieren klaar voor injectie in een schaal met verschillende hydra's die minimaal een uur testes hebben voor injectie om bevruchting mogelijk te maken als er vrouwtjes worden gevonden in de a EP-kolonie met volledig gevormde eieren of een tot acht cellen stadia embryo's. Verzamel deze ook voor injectie voor injectie. Gebruik een scalpel met een nummer 15-mes om het meeste van het ouderlijk weefsel boven en onder embryo's die zijn begonnen te kleven, te verwijderen, waardoor ze alleen met een klein stukje van de lichaamskolom van de ouder zijn verbonden.Bewaar het gedissekteerde weefsel in Hydra-medium omdat het zich zal regenereren en ervoor zorgt dat vrouwtjes in de hydra-kolonie blijven. Gebruik een weidepijp om de kleefembryo's over te brengen naar een injectieschaal, ze parallel aan de wand van de agros-trog te rangschikken. Om de micro-injector gemonteerd op een magnetische standaard die op een ijzeren plaat zit voor te bereiden.Monteer de injectiehouder, die deel uitmaakt van de micro-injector die de naald op een joystick microm manipulator houdt. Gebruik een magnetische standaard om de joystick manipulator op de ijzeren plaat te monteren. Plaats vervolgens de hele opstelling aan de rechterkant van een disserpeermicroscoop en positioneer de injectiehouder zodat deze zichtbaar is in het observatieveld.Plaats de injectieschaal met embryo's onder de disserpeermicroscoop georiënteerd zodat de verticale wand van de agros-trog aan de linkerkant staat. Voer de naald in de injectiehouder in en laat de punt van de naald zakken in het hydra-medium in de schaal. Draai vervolgens langzaam de knop van de spuit in de wijzers van de klok totdat mineraalolie de bovenkant van de naald vult en een gelijkmatige stroom injectieoplossing wordt waargenomen die de naald in het hydra-medium verlaat.Als de stroom te sterk is, verlaagt u de druk door de knop tegen de klok in te draaien. Centreer een embryo in het gezichtsveld en beweeg de naald zodat deze het embryo raakt. Gebruik vervolgens de microm manipulator om het embryo met de naald te doorboren en laat de injectieoplossing een of twee seconden in het embryo stromen voordat u de naald snel verwijdert.Als het embryo meer dan één cel heeft, injecteert u elke cel afzonderlijk. Ga zo door totdat alle embryo's zijn geïnjecteerd. Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, brengt u ze over in een schaal met een paar Hydra, een EP poliepen die testes hebben en incubeert u ze bij 18 graden Celsius terwijl ze embryogenese blijven ondergaan.Wanneer de embryo's het cuticulastadium bereiken, verplaatst u elk embryo in een putje van een 24-puttenplaat gevuld met hydra-medium en incubeert u ze twee weken in het donker bij 18 graden Celsius. Controleer vervolgens elk embryo onder een disserpeermicroscoop op loslating van het kleine stukje ouderlijk weefsel en de regeneratie van dat weefsel. Als dit aanwezig is, verwijdert u het onmiddellijk, zodat het niet wordt aangezien voor een nieuw uitgekomen dier.Nadat u elk embryo hebt gecontroleerd, verplaatst u de schaal onder een aquariumlicht op kamertemperatuur. Controleer de platen elke dag en verzamel de uitgekomen dieren. Nieuwe uitgekomen dieren zijn wit van kleur omdat ze nog niet hebb

generation-of-transgenic-hydra-by-embryo-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, Nijole Jasinskiene toont de methoden die gebruikt worden om transgene Aedes aegypti muggen, die vectoren voor knokkelkoorts te genereren. De technieken voor het correct opstellen van micro-injectie naalden, droogmiddelen embryo's en het uitvoeren van micro-injectie worden aangetoond.

Micro-injectie van A. aegypti embryo&#39;s om transgene muggen verkrijgen

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA's rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Het bestuderen van de vroegste gebeurtenissen van preneoplastische cel progressie en aangeboren immuunsysteem interactie cel is cruciaal om te begrijpen en behandelen van kanker. Hier beschrijven we een methode om epitheelcellen transformaties en de daaropvolgende live beeldvorming van aangeboren immuunsysteem interactie cel met HRAS G12V uiten huidcellen in de zebravis larven voorwaardelijk induceren.

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Live volgen van individuele WT retinale voorlopers in verschillende genetische achtergronden maakt voor de beoordeling van de bijdrage van de cel niet-zelfstandige signalering tijdens de neurogenese. Hier, een combinatie van gen knockdown, chimeer generatie via embryo transplantatie en in vivo time-lapse confocale beeldvorming werd gebruikt voor dit doel.

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo's via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.

Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer transgene Hydra genereren door micro-injectie van plasmide-DNA in embryo's. Deze methode maakt stabiele transgene lijnen voor genetisch onderzoek naar ontwikkeling en regeneratie.

Generatie van transgene Hydra Door Embryo Microinjection

Meer video's verkennen