Name: High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer een high-throughput luciferase-methode voor virustitratie met geautomatiseerde vloeistofhandling. Deze techniek verwerkt snel meerdere monsters en beoordeelt tegelijkertijd celviabiliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vanessa Garcia wordt gefinancierd door een Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology en Cory Batenchuk door een Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.

1 Monstervoorbereiding <ol><li> Verkrijgen monsters die luciferase-expressie virus (hierin VSVΔ51-Fluc als voorbeeld) voor titratie en overbrengen in 96-well platen. Anders, infecties in 96-putjes weefselkweekplaten en gebruik supernatanten direct uitvoeren. </li><li> Laat twee kolommen onbehandeld voor het opnemen van standaard curves. Voor experimenten direct uitgevoerd in 96-well platen, titer aan het einde van het experiment (40 uur na infectie) of bewaar bij -80 ° C en titer later. </li></ol> 2 Voorbereiding van Tolerante Cellen voor virustitratie <ol><li> 24 uur vóór titering Bereid een suspensie van Vero-cellen bij een concentratie van 2,5 x 10 5 cellen / ml in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS), 30 mM HEPES en 1% penicilline / streptomycine. OPMERKING: Hoewel dit protocol maakt gebruik van Vero-cellen, elk geschikt tolerante cellijn voor VSV infectie kan be gebruikt. </li><li> Seed 2,5 x 10 4 cellen (100 ui) in 96-well witte vaste stof platte bodemplaten met een microplaat dispenser. <ol><li> Bereid 12 ml celsuspensie per plaat plus 5 ml voor priming. </li><li> Schoon microplaat dispenser cassette door spoelen van de buis met 50 ml steriel water. </li><li> Vul de microplaat dispenserlijnen met celsuspensie en laat 5 ml celsuspensie doorstromen. </li><li> Selecteer een programma dat 100 gl zal afzien in elk putje van een witte wanden 96-well plaat. Afzien, en indien nodig herhalen voor extra borden. Ook zaad enkele putjes in een 96-well duidelijke platte bodemplaat als opaak-witte bottom wand platen worden gebruikt voor verificatie van de gezondheid van de cellen en dichtheid. </li><li> Wanneer u klaar bent, spoel cellen terug in de oorspronkelijke verpakking. Reinig de cassette door het uitvoeren 50 ml 70% ethanol gevolgd door 50 ml warm steriel water door de buis. </li><li> Zorg ervoor dat de cassette en slangen zijn appropriately gereinigd tussen toepassingen. </li></ol></li><li> Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li></ol> 3 Voorbereiding van Viral Standard Curve <ol><li> Bereid een standaard kromme van VSVΔ51-Fluc in serumvrij DMEM zodanig dat de eindconcentratie van plaque vormende eenheden (pfu) per ml na overdracht op Vero-cellen is als volgt: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 4 10 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml en 10 1 pfu / ml. Bereid 50 pi van elke concentratie per plaat van Vero-cellen en een extra 10%. OPMERKING: Titer van de luciferase virus voorraad moeten worden beoordeeld op een klassieke manier 10 om een standaard curve die zal zorgen voor absolute kwantificatie genereren. Anders relatieve kwantificatie mogelijk zonder nauwkeurige titer informatie willekeurig instellen virale titer gebaseerdverdunning stappen. Bijvoorbeeld de eerste verdunning van de standaard curve kan worden ingesteld op 10 8 virale eenheden en de volgende 1/10 verdunning tot 10 7 enzovoort. In deze context moet men waarden als fold-verandering ten opzichte van een vooraf bepaald monster als absolute kwantificering niet nauwkeurig uit te drukken. </li></ol> 4 Overdracht van Sample Supernatants op Tolerante Cellen <ol><li> Controleer Vero-cellen uitgeplaat in de heldere bodem 96-well plaat onder een lichtmicroscoop te bevestigen dat monolagen ten minste 95% confluent. </li><li> Transfer 25 ul monster supernatant op Vero-cellen gezaaid in witte wanden platen. Niet supernatanten over in de kolommen 2 aangewezen standaard curves. Opmerking: Dit kan gelijktijdig plaats voor alle putjes op een enkele plaat met een 96-kanaals vloeistofmanipulator. </li><li> Met een 8 of 12-kanaals Meerkanaalspipet Voeg 25 ul van elke verdunning van de standaardkromme bereid in Stap 3, de Vero-cellen inde 2 aangewezen kolommen. </li><li> Centrifugeer platen gedurende 5 min bij 430 x g bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li></ol> 5 Beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen <ol><li> OPMERKING: Bij het starten van supernatanten verkregen uit infectie experimenten gedaan in heldere 96-well platen kunnen levensvatbaar monster voor kwantificatie met cellevensvatbaarheid indicatorkleurstof worden beoordeeld zoals Resazurin. </li><li> Voeg Resazurin in een hoeveelheid gelijk aan 10% van het volume in elk putje van de 96-well plaat of monsters met virus en cellen. Omvatten cel alleen, als aan-only media controle grenswaarden voor 100% en 0% levensvatbaarheid respectievelijk bepalen. </li><li> Na 2-4 uur (incubatietijd afhankelijk van het celtype en van de concentratie van commercieel verkrijgbaar of gereconstitueerde poeder van de kleurstof), gelezen en registreer het signaal met behulp van een fluorescentie plaatlezer (530-560 excitatie, 590 emissie). Verslag cel viability een monster volgens de formule relatieve metabole activiteit = ((Monsterhoeveelheid signaal - negatieve controle signaal) / (Cell enkel stuursignaal - negatieve controle signaal)) x 100% </li></ol> 6 Voorbereiding van de Luciferine Ondergrond <ol><li> 30 min vóór het einde van de 5 uur incubatie, bereid de luciferine een 2 mg / ml oplossing in steriele met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te verkrijgen. Bereid 2,5 ml per plaat plus een extra 2 ml. Bescherm oplossing tegen licht. OPMERKING: De luciferine kan ook eerder op de dag worden bereid en bewaard bij 4 ° C tot gebruik. </li></ol> 7 Reading Bioluminescence <ol><li> Na 5 uur incubatieperiode voeg 25 pl luciferine aan elk putje van Vero-cellen in de witte vaste platen. Luciferine Voeg handmatig of met een geautomatiseerd dispenser geïntegreerd in de luminometer. Opmerking: het gebruik van een instrument met slechts enkele en eindpunt leest kunnen de toevoeging van een luciferase compatibele lysis buf vereisenfer vóór toevoegen van het substraat luciferine consistentie verbeteren. </li><li> Lees de platen met de volgende parameters: <ol><li> Schud gedurende 5 sec. </li><li> Wacht 30 sec. </li><li> Lees luminescentie op een geschikte vaste waarde gevoeligheid / blootstelling. Als de optie is beschikbaar op het instrument te gebruiken multi-point leest (bijvoorbeeld 3 x 3 matrix) om de nauwkeurigheid te verbeteren. </li></ol></li><li> Opnemen en opslaan van de gekwantificeerd bioluminescentie intensiteit. </li><li> Als een geautomatiseerde dispenser werd gebruikt om toe te voegen luciferin zuiveren de luciferin en prime de lijnen met warm steriel water. </li></ol> 8 Data Analysis <ol><li> Voor nauwkeurige resultaten, lossen de niet-lineaire regressie om een ​​Heuvel vergelijking van de standaard curves genereren. Breng deze vergelijking om de monsters getitreerd virale expressie-eenheden berekenen. Sommige virussen of situaties kan een standaardcurve met een lineair verband te produceren; in dit geval lossen voor een lineaire vergelijking. </li></ol>

<ol><li>Grigorov, B., Rabilloud, J., Lawrence, P., Gerlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+titration+of+measles+and+other+viruses%3A+optimization+with+determination+of+replication+cycle+length%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid titration of measles and other viruses: optimization with determination of replication cycle length.</a> PLoS One. 6 (e24135), (2011).</li>
<li>Lizee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>McSharry, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+of+flow+cytometry+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Uses of flow cytometry in virology.</a> Clin Microbiol Rev. 7, 576-604 (1994).</li>
<li>Watcharatanyatip, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecies+detection+of+antibodies+to+influenza+A+viruses+by+a+double-antigen+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispecies detection of antibodies to influenza A viruses by a double-antigen sandwich ELISA.</a> J Virol Methods. 163, 238-243 (2010).</li>
<li>Dawson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Quantification+of+Viruses+in+Solution+Using+the+ViroCyt+Virus+Counter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Quantification of Viruses in Solution Using the ViroCyt Virus Counter.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 23 (S10), (2012).</li>
<li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+and+RT-PCR%3A+true+or+false%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV and RT-PCR: true or false.</a> Mol Ther. 1, 389-390 (2000).</li>
<li>Diallo, J. S., Roy, D., Abdelbary, H., De Silva, N., Bell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+infection+of+live+tissue+with+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses.</a> J Vis Exp. 52, (2011).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li>
<li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adenoviruses%3A+propagation%2C+purification%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Human adenoviruses: propagation, purification, quantification, and storage.</a> Curr Protoc Microbiol. 14 (14C 11), (2006).</li>
<li>Diallo, J. S., Vaha-Koskela, M., Le Boeuf, F., Bell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+purification%2C+and+in+vivo+testing+of+oncolytic+vesicular+stomatitis+virus+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation, purification, and in vivo testing of oncolytic vesicular stomatitis virus strains.</a> Methods Mol Biol. 797, 127-140 (2012).</li>
<li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li>
<li>Diallo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+pharmacoviral+approach+identifies+novel+oncolytic+virus+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers.</a> Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De luciferase-gebaseerde strategie beschreven is, een aantal voordelen boven andere bestaande werkwijzen waaronder het eenvoudige, snelheid, minimale uitrusting nodig en relatief lage kosten. Een belangrijke bijdrage aan deze is het vermijden van een seriële verdunning stap. Toch seriële verdunning gebaseerde derivaten van dit protocol zijn zeker haalbaar en werden onlangs gebruikt om luciferase uitdrukken Ebola titers beoordelen in een high-throughput antivirale scherm 11. Terwijl inherent tijdrovend en duurder, kunnen dergelijke aanpassingen groter dynamisch bereik voor virale kwantificering indien nodig. Naast de bijzonder geschikt voor de evaluatie van virale titers in de context van high-throughput screens, onze eentraps luciferase gebaseerde virale kwantificeringsmethode genereert nauwkeurige schattingen van infectieuze virions bij replicerende virussen. Bovendien uitlezingen van luminescentie naast cytotoxiciteit gegevens van hetzelfde experiment geven eenvolledig beeld van het effect van de experimentele voorwaarden doelcellen, hetgeen bijzonder nuttig in de context van oncolytische virussen en drugsgebruik schermen. De hier getoonde voorbeeld wordt een negatieve replicerende enkelstrengs RNA-virus; echter kan dit protocol worden aangepast om een ​​aantal replicerende en niet-replicerende virussen met enkele kleine aanpassingen protocol. Dit omvat DNA-virussen zoals Vaccinia, HSV en AAV (zie figuur 5). Monsters geïnfecteerd met intracellulaire virussen zoals vacciniavirus vereisen bijvoorbeeld een virus afgifte stap voor kwantificering (bijvoorbeeld ten minste een vries-dooi cyclus). Bij toepassing van deze techniek op andere virussen, moet de incubatietijd optimaliseren van de overdracht van het virale lysaat supernatant of het lezen van de platen door de luminometer. Deze parameter zal voornamelijk afhangen van de replicatiecyclus van het virus in de tolerante cellijn en de sterkte van de promoter rijden luciferase expressie. Dit kan het beste met de volledige standaard curve in de optimalisatie stap. Daarvoor moet men de geschikte permissieve cellijn met verschillende monsters van het bereide standaardkromme infecteren en lees elk repliceren op een andere tijdstippen na overdracht. Idealiter wordt een incubatietijd punt gekozen, dat leidt tot een lineair verband tussen LOG (RLU) en LOG (titer) verspreid over de verwachte monster titer bereik. Voor VSVΔ51-Fluc deze bedraagt ​​typisch 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml gedurende 5 uur incubatietijd. Bij lagere of hogere titers worden verwacht van monsters, kan men eenvoudig verhogen respectievelijk verlagen de incubatietijd. Alternatief kan monsters verdund binnen het bereik veel wordt typisch gedaan ELISA vallen. Zoals hierboven vermeld, is deze methode zeer geschikt voor high-throughput drug screens middels drug bibliotheken meeste stappen worden automatisch uitgevoerd. Cellen worden uitgeplaat efficiently toepassing van een geautomatiseerde microplaat dispenser, kan de geneesmiddelenbibliotheek toevoegen via een 96-kanaals vloeistofmanipulator, kan virus worden toegevoegd met behulp van een microplaat dispenser en borden lezen met een geautomatiseerde luminometer. In principe kan deze ook worden aangepast aan 384 putjes of kleinere formaten; echter, de beperking tot dit einde is het aantal cellen die kunnen worden verzilverd, krijgen minder cellen leidt tot een kleiner bereik in de lineariteit van het LOG (RLU) tot (titer) relatie LOG. Tenslotte kan beoordeling van cellevensvatbaarheid met resazurin of andere metabole kleurstoffen gemakkelijk worden opgenomen in de workflow, waardoor discriminatie cytotoxische verbindingen antivirale schermen of identificatie van verbindingen die leiden tot synergistische doden in combinatie met virussen 12. Toch beperkingen van deze werkwijze omvatten het vereiste van een luciferase transgen virus, wat niet altijd mogelijk is, en de beschikbaarheid van voldoende permissieve cellijn. Het is echter waarschijnlijk mogelijk aanpassende werkwijze voor gebruik met andere reporter genen (bijvoorbeeld GFP) verstrekte de reporter kwantificeringsmethode een geschikte lineariteit en signaal-ruisverhouding. Kortom, kan de beschreven high-throughput werkwijze worden gemodificeerd om verschillende virussen aangepast en afgestemd op diverse toepassingen.

Klassieke virale plaque-assays blijven een steunpilaar in virusonderzoek, ook al kunnen ze berucht tijdrovend zijn en vormen een belangrijke bottleneck bij het verkrijgen van resultaten uit experimenten. Snellere indirecte methoden voor viruskwantificering zijn opgekomen, waaronder kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), ELISA en flowcytometrie1-4. Recente innovaties zoals de Virocyt-virusteller kunnen direct virussen tellen met behulp van geavanceerde flow-sorteringstechnologie en een combinatie van eiwit- en DNA/RNA-kleurstoffen5. Hoewel al deze methoden ongetwijfeld het tempo van virusonderzoek hebben versneld, heeft elke methode zijn voor- en nadelen. Zo kan qPCR de kwantificering van specifieke virale genoomsequenties mogelijk maken, maar kan het niet effectief onderscheid maken tussen besmettelijke en defecte virionen6. ELISA's kunnen zeer specifiek zijn, maar vereisen een geschikt antilichaam tegen het gewenste doelwitvirale eiwit en kunnen erg duur zijn. Hoewel flowcytometrietechnologie vele voordelen biedt en aanzienlijk is verbeterd, blijven doorvoer en toegang tot zeer gespecialiseerde apparatuur een hindernis. Belangrijk is dat al deze technieken niet ideaal geschikt zijn voor high-throughput screening, waarbij de gemak en tijdsvereiste van de viruskwantificeringsstap van kritiek belang is.
Hier beschrijven we een high-throughput en gemakkelijk te automatiseren techniek om virussen te titraten die een Firefly luciferase (Fluc) transgeen tot expressie brengen. Deze methode genereert benaderd virale titers in een testmonster op basis van luminescentie signaallezingen door de parallelle gebruik van een standaardcurve van bekende hoeveelheden virus. monsters die onbekende hoeveelheden luciferase-expresserend virus bevatten, worden overgebracht naar een permissieve "plaquing"-cellijn parallel met de standaard virusverdunningscurve en virus-geassocieerde luminescentie wordt gelezen na een paar uur incubatietijd. Dit maakt snelle, kwantitatieve, vaak op dezelfde dag resultaten mogelijk, in tegenstelling tot klassieke plaque-assay protocollen die doorgaans enkele dagen incubatie vereisen om zichtbare plaques handmatig te tellen7-9.
Het protocol schetst de stappen van onze titratiemethode met behulp van oncolytisch Vesicular Stomatitis Virus dat een Fluc transgeen codeert (VSVΔ51-Fluc) als voorbeeld en geeft een overzicht van 1. Voorbereiding van het monster 2. Het plateren van een permissieve cellijn voor virustitratie met behulp van een geautomatiseerde dispenser 3. De voorbereiding van de virale standaardcurve 4. De overdracht van de monstersupernatants naar de permissieve cellijn met behulp van een 96-well handmatige pipetteerder 5. De beoordeling van monsterscytotoxiciteit met behulp van een celviabiliteitsreagens 6. De voorbereiding van het luciferine substraat 7. Lezen van bioluminescentie en 8. Data-analyse.

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>NorthBio Inc.</td><td>NBSF-701</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td>Bereid een 1 mM oplossing, pH 7.3</td></tr><tr><td>alamarBlue&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012B</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin potassium salt</td><td>Biotium</td><td>10101-2</td><td></td></tr><tr><td>96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>384-well platen kunnen ook worden gebruikt voor hogere doorvoer</td></tr><tr><td>Synergy Mx</td><td>BioTek</td><td>SMTBL</td><td>Monochroom microplate reader</td></tr><tr><td>Liquidator96</td><td>Mettler Toledo</td><td>LIQ-96-200</td><td>96 tip handmatig pipetteringssysteem</td></tr><tr><td>Liquidator96 LTS Tips gesteriliseerd met filters</td><td>Mettler Toledo</td><td>LQR-200F</td><td>Elke steriele gefilterde tips die compatibel zijn met pipettors naar keuze zijn geschikt</td></tr><tr><td>Microflo</td><td>BioTek</td><td>111-206-21</td><td>Gebruikt om cellen in een 96-well plate te plaatsen</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210450</td><td>Microplate fluorometer</td></tr></tbody></table>

high-throughput titratie van luciferase-expressie recombinant virussen

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standaard plaque-assays om infectieuze virale titers te bepalen, kunnen tijdrovend zijn, zijn niet geschikt voor een groot volume aan monsters en kunnen niet worden uitgevoerd met virussen die geen plaques vormen. Als alternatief voor plaque-assays hebben we een hoogdoorvoermethode voor titratie ontwikkeld die het mogelijk maakt om in één dag een groot volume aan monsters tegelijkertijd te titratie. Deze aanpak omvat infectie van de monsters met een Firefly luciferase-gelabeld virus, overdracht van de geïnfecteerde monsters naar een geschikte permissieve cellijn, daaropvolgende toevoeging van luciferine, lezen van platen om luminescentiemetingen te verkrijgen, en tenslotte de omrekening van luminescentie naar virale titers. De beoordeling van cytotoxiciteit met behulp van een metabolische levensvatbaarheidskleurstof kan eenvoudig parallel in de workflow worden opgenomen en geeft waardevolle informatie in de context van een geneesmiddelenscreening. Deze techniek biedt een betrouwbare, hoogdoorvoermethode om virale titers te bepalen als alternatief voor een standaard plaque-assay.

Samenvatting van de werkstroom waarin de high-throughput werkwijze is geïllustreerd in figuur 1. Figuur 2 toont de resultaten van een typische standaardcurve ofVSVΔ51-Fluc. Vier-parameter niet-lineaire regressieanalyse gegenereerd een Heuvel plot van onbekende invoer pfu (schatting van virale titer) worden geïnterpoleerd. Deze geschatte titers worden genoemd virale expressie-eenheden (VEU). Figuur 3A toont VEUs en titers verkregen door het uitvoeren van een standaard plaque assay met dezelfde monsters 10. Monsters afkomstig van een experiment waarbij verschillende chemicaliën werden gebruikt om de replicatie te verbeteren en de verspreiding van VSVΔ51-Fluc in 786-0 cellen. VEUs geïnterpoleerd uit de standaard curve moet worden vermenigvuldigd met een factor die is gebaseerd op de verdunning van monster supernatanten worden overgebracht naar Vero-cellen (in dit geval, is de verdunningsfactor 5). De lineaire correlatie tussen de titers en VEU wordt getoond in figuur 3B </strong&gt; Met een R2 van 0,8083 en een Pearson&#39;s r score van 0.899 (p &lt;0,0001). In figuur 4, typisch celcytotoxiciteit gegevens van een metabolische bepaling getoond voor 786-0 cellen behandeld met chemicaliën vóór infectie met VSVΔ51-Fluc. Tenslotte Figuur 5 toont typische standaard curves verkregen met diverse virussen (Herpes Simplex Virus (HSV), vacciniavirus en adeno-geassocieerd virus (AAV), alle expressie Firefly luciferase) en beschrijft incubatietijden en vries-dooi cycli, zoals vereist. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1 Workflow van high-throughput virus titering en cytotoxiciteit assay met VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 Vero-cellen per putje (100 pl) en incubeer bij 37 ° C. (B) 24hr latere overbrenging 25 gl standaardcurve op Vero-cellen (2 kolommen per plaat). (C) Breng 25 pl monsters worden getitreerd op Vero-cellen blijven. Centrifuge platen en incubeer bij 37 ° C. (D) In een bedrag gelijk aan 10% van het volume in het goed, voeg resazurin reagens om de plaat met de originele samples. Incubeer de platen bij 37 ° C. (E) na 3 uur, leest en schrijft fluorescentie en beoordelen cytotoxiciteit. (F) na 5 uur, voeg 25 ul van 2 mg / ml oplossing van luciferine aan elk putje van Vero-cellen. Lees luminescentie en bereken Viral Expression Units. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2 Verwachte standaard curve van VSV Δ 51-Fluc. Luciférase uitdrukking was measured 5 uur overdracht bericht supernatant op vijf verschillende punten in een goed gebruik van een lichtmeter en bioluminescentie werd uitgedrukt in gemiddelde relatieve licht (RLU). De gemiddelde RLU werd uitgezet tegen bekende invoer pfu / ml aan de niet-lineaire regressie lossen en genereren Hill vergelijking. Het gemiddelde van twee repliceren bochten en standaard error bars worden getoond (r 2 = 0,9993). <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 Vergelijking van standaard plaque assay met titers die verkregen door high-throughput-methode. (A) Virale titers in pfu / ml verkregen door standaard plaque assay op Vero-cellen vergeleken met de berekende virale titers (VEU / ml) van dezelfde monsters getitreerd met de high-throughput luciferase assay. (B) lineair verband tussen VEU / ml en titer verkregen via standaard plaque assay. Lineaire regressie-curve en de determinatiecoëfficiënt (R2) getoond. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig4highres.jpg" width="500" /> Figuur 4 Voorbeeld levensvatbaarheid. Levensvatbaar monster voor overdracht supernatant op Vero-cellen werd bepaald door het bepalen van cellulaire metabolische activiteit met een commercieel verkrijgbare Resazurin oplossing. Raw fluorescentiewaarden werden genormaliseerd aan die van onbehandelde, geïnfecteerde putjes. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51890/51890fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5 Verwachte standaardcurven met HSV, Vaccinia- en AAV virussen. Luciférase expressie werd gemeten op vijf verschillende punten in een goed gebruik van een lichtmeter en bioluminescentie werd uitgedrukt in gemiddelde relatieve lichteenheden (RLU). (A) HSV standaardcurve werd toegevoegd aan Vero-cellen uitgeplaat 24 uur eerder bij een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen per putje (100 pl) en luciferase meting werd 17 h na supernantant overdracht (R2 = 0,9489, n = 1). Een Hill vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de niet-lineaire regressie. (B) Vaccinia standaardcurve werd toegevoegd aan Vero-cellen uitgeplaat 24 uur eerder een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen per putje (100 pl) en gedurende 2,5 uur bij 37 ° C, waarna luciferase metingen werden uitgevoerd (R2 = 0,9892). Een lineaire vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de lineaire regressie. (C) AAV standaardcurve werd toegevoegd aan humane longcarcinoom cellen (A549) uitgeplaat 24 uur eerder bij een dichtheid van 2,5 x 10 4 cellen per putje (100 pl) en luciferase meting werd 24 uur na infectie. Een Hill vergelijking werd gegenereerd door het oplossen van de niet-lineaire regressie. De gemiddeldevan vijf repliceren bochten en standaard error bars worden getoond (R2 = 0,9926).

Dit artikel presenteert een methode op basis van luciferase-expressie met hoge doorvoer voor het titreren van verschillende RNA- en DNA-virussen met behulp van geautomatiseerde en handmatige vloeistofbewogen.

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het schatten van virale titers van een virus met een luciferase-tag met behulp van een high-throughput kwantificatiemethode. Dit wordt bereikt door het supernatant van de te titeren monsters, evenals een virale standaardcurve, over te brengen naar een permissieve cellijn om luciferase-expressie mogelijk te maken. Als tweede stap kan Resazurin worden toegevoegd aan de oorspronkelijke monsters, wat zal worden gebruikt om de celviabiliteit te beoordelen.Vervolgens, na een passende incubatietijd, wordt luciferine aan de cellen toegevoegd om de bioluminescentie te kwantificeren. De resultaten tonen de hoeveelheid virus in het monster aan op basis van de luciferase-expressie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals plaque-titratie, is dat een groot aantal monsters snel en gelijktijdig kan worden verwerkt. Deze methode kan ook worden uitgebreid naar luciferase-expresserende virussen die geen plaques vormen, aangezien deze niet afhankelijk is van plaquevorming. Een uitlezing van de cytotoxiciteit van cellen kan eenvoudig in de workflow worden opgenomen en kan nuttig zijn in de context van een drugscreen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Vanessa, Ramya en Colin, drie promovendi uit mijn laboratorium.Voer eerst infecties uit met VSV-Delta 51 dat Firefly Luciferase tot expressie brengt in 96-wells weefselkweekplaten. Supernatanten van deze platen worden na een passende incubatietijd getitreerd. Bereid 24 uur voor de titrering een suspensie van Vero-cellen voor met een concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter in DMEM met 10% FBS, 30 millimolair HEPES en 1% penicilline-streptomycine. Zaai 2,5 × 10⁴ cellen uit in witte 96-wells platen met een vaste, platte bodem met behulp van een microplaatdispenser. Reinig ter voorbereiding van de celsuspensie een cassette van de microplaatdispenser door de slang te spoelen met 50 milliliters steriel water.Vul vervolgens de lijnen van de microplate-dispenser met de cel-suspensie en laat vijf milliliter van de cel-suspensie doorstromen. Selecteer een programma dat 100 µL in elke put van een witwandige 96-well plaat doseert. Doseer en herhaal indien nodig voor aanvullende platen. Zaai daarnaast een paar putten in een 96-well heldere plaat met witte bodem om de gezondheid en dichtheid van de cellen te verifiëren.Spoel de cellen na afloop terug in de oorspronkelijke container. Reinig de cassette door 50 milliliters 70% ethanol en vervolgens 50 milliliters warm steriel water door de slang te laten lopen. Incubeer de cellen daarna gedurende 24 uur bij 37 degrees Celsius in een bevochtigde 5%carbon dioxide incubator.Stel een standaardcurve van VSV-Delta-51 op in serumvrij DMEM, zodanig dat de uiteindelijke concentratie plaque-vormende eenheden per milliliter na overdracht op Vero-cellen als volgt is. Bereid 50 microliters van elke concentratie per plaat met Vero-cellen voor, plus een extra 10%. De standaardcurve kan worden overgebracht naar een 96-deep-wellplaat. Controleer vervolgens de Vero-cellen in de 96-wellplaat met transparante bodem onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat de monolagen voor ten minste 95% confluent zijn. Breng 25 microliters van het supernatant van het monster over op de Vero-cellen in de platen met witte wanden met behulp van een 12-kanaals multichannelpipet, waarbij 25 microliters van elke verdunning van de standaardcurve wordt toegevoegd aan de Vero-cellen in de twee aangewezen kolommen. Centrifugeer de platen vijf minuten bij 430 g bij kamertemperatuur. Incubeer de platen vervolgens gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% carbon dioxide-incubator.Voeg op dit punt resazurine toe in een hoeveelheid gelijk aan 10% van het volume in elke well van de 96-well plaat met monsters die virus en cellen bevatten. Lees na twee tot vier uur het signaal uit en noteer dit met een fluorescentieplaatlezer met 530 tot 560 voor excitatie en 590 voor emissie. Rapporteer de cellevensvatbaarheid van het monster volgens de volgende formule.Bereid 30 minuten voor het einde van de incubatie van vijf uur de Luciferine voor om een oplossing van twee milligram per milliliter in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing te verkrijgen. Bescherm de oplossing tegen licht. Voeg na de incubatieperiode van vijf uur 25 µL Luciferine toe aan elke put met Vero-cellen in de witte vaste platen met een geautomatiseerde dispenser die is geïntegreerd in de luminometer. Lees de platen af met de volgende parameters.Schud vijf seconden en wacht 30 seconden. Lees de luminescentie af bij een passende vaste gevoeligheid of belichtingstijd, en noteer en sla vervolgens de gekwantificeerde bioluminescente intensiteit op. Als er een automatische dispenser is gebruikt om luciferine toe te voegen, spoel dan de luciferine uit en spoel de lijnen door met steriel water. Los voor nauwkeurige resultaten de niet-lineaire regressie op om een Hill-vergelijking op basis van de standaardcurven te genereren.Pas deze vergelijking toe op de getitreerde monsters om de virale expressie-eenheden te berekenen. De resultaten van een typische standaardcurve van VSV-Delta 51 worden hier getoond. Met een niet-lineaire regressieanalyse met vier parameters is een Hill-plot gegenereerd, waarmee onbekende input plaque-vormende eenheden kunnen worden geïnterpoleerd. Virale titers verkregen via een standaard plaque-assay op Vero-cellen werden vergeleken met de berekende virale titers van dezelfde monsters die zijn getitreerd met de high-throughput luciferase-assay. De monsters waren afkomstig van een experiment waarbij diverse chemicaliën werden gebruikt om de replicatie en verspreiding van VSV-Delta-51 in 786-0 cellen te versterken. De lineaire correlatie tussen titers en virale expressie-eenheden met een R-kwadraat van 0,8083 en een Pearson R-score van 0,899 is hier afgebeeld. Typische gegevens over celcytotoxiciteit, verkregen uit een metabolische assay, worden hier getoond voor 786-0 cellen die vóór infectie met VSV-Delta-51 met chemicaliën zijn behandeld. Typische standaardcurves verkregen met herpes simplex virus, vaccinia virus en adeno-geassocieerd virus, die allen vuurvlieg-luciferase tot expressie brengen, worden hier weergegeven.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om high-throughput screenings van verbindingenbibliotheken uit te voeren in combinatie met het virus van interesse om titers en cytotoxiciteitsgegevens te genereren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de standaardcurve correct te verdunnen, aangezien dit cruciaal is voor de interpolatie van virale expressie-eenheden.Vergeet niet dat het werken met levende virussen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er tijdens het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een biologische veiligheidskabinet en het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale titers kunnen worden geschat met behulp van een high-throughput kwantificeringsmethode op basis van de expressie van een luciferase-transgen, waarbij bioluminescentie wordt gemeten ter interpolatie van onbekende virale expressie-eenheden aan de hand van een standaardcurve. De cytotoxiciteit van het monster kan gelijktijdig worden bepaald door middel van een passende viabiliteitsassay.

high-throughput-titration-of-luciferase-expressing-recombinant-viruses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Te maken lentivirussen, zijn DNA-vectoren getransfecteerd in humane 293 cellen. Na de oogst en het concentreren van de supernatant, is virustiter bepaald door fluorescentie expressie met een flowcytometer.

Lentivirus Productie

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Determining Optimal Target Cell Density Using a Luciferase-Based Pseudovirus Infection Assay

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates an in vitro technique to detect hepatitis B virus (HBV) infection via a recombinant HBV reporter system. Upon infecting host cells, the recombinant viral genome expresses the luciferase reporter enzyme, which produces bioluminescence upon oxidizing its substrate — helping detect viral infection.

An In Vitro Recombinant Virus Reporter System for the Detection of Viral Infection

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

This video demonstrates an assay to study the translation regulation in poxvirus-infected cells. Uninfected and virus-infected cells were co-transfected with mRNAs encoding for firefly luciferase (Fluc) and Renilla luciferase (Rluc), with the Fluc mRNA containing a 5' Poly(A) leader sequence. Upon adding bioluminescent substrates on lysed cells, measure the signal from both the luciferases to identify the translational advantage of the Fluc mRNA in virus-infected cells, conferred by the leader...

A Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-Infected Cells

We presenteren een snelle en goedkope screening methode voor het identificeren van transcriptiefactoren met behulp van high-throughput robotachtige transfecties en een zelfgemaakte dual-gloed luciferasetest. Dit protocol snel genereert direct naast elkaar functionele data voor duizenden genen en is gemakkelijk aanpasbaar aan een gen van belang te richten.

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van pseudotyped deeltjes in een BSL-2 omgeving waarin de proteïne van de piek van de hoogpathogene virussen Midden-Oosten respiratoir syndroom en het ernstig acuut respiratoir syndroom coronaviruses. Deze pseudotyped deeltjes bevatten een luciferase verslaggever gen waardoor kwantificering van virus host doelcellen indienststelling.

Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

We presenteren een protocol om mRNA vertaling verordening in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen met behulp van in vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay studie. De analyse kan voor het bestuderen van Vertaal regelgeving door CIS-elementen van een mRNA worden gebruikt, met inbegrip van 5 '-onvertaalde regio (Utr) en 3 '-UTR. Verschillende Vertaal initiatie modi kunnen ook worden onderzocht met behulp van deze methode.

In vitro Getranscribeerd RNA-based Luciferase reporter assay om te studeren vertaling regelgeving in familie pokkenvirus-geïnfecteerde cellen

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Om nieuwe regelgevers van transcriptiefactoren te identificeren, ontwikkelden we een benadering om arrayed lentivirale of retrovirale RNAi-bibliotheken te screenen met behulp van een dual-luciferase-gebaseerde transcriptie-verslaggever test. Deze aanpak biedt een snelle en relatief goedkope manier om honderden kandidaten in één experiment te screenen.

Identificatie van Transcription Factor Regulators met behulp van Medium-Throughput Screening van arrayed bibliotheken en een Dual-Luciferase-Based Reporter

Leer een high-throughput luciferase-methode voor virustitratie met geautomatiseerde vloeistofhandling. Deze techniek verwerkt snel meerdere monsters en beoordeelt tegelijkertijd celviabiliteit.

High-throughput Titratie van Luciferase-expressie Recombinant virussen

Meer video's verkennen