Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

Het algemene doel van de volgende video is om een eenvoudige en betaalbare techniek te demonstreren voor het produceren van een goede opbrengst van eiwitten of eiwitcomplexen met behulp van een zoogdierexpressiesysteem. Dit wordt bereikt door HEC 2 93 F-cellen in suspensie te kweken in een bevochtigde schudkuvette met een atmosfeer die op 5% koolstofdioxide wordt gehouden. Als tweede stap worden de cellen tijdelijk getransfecteerd met een of meer expressieplasmiden met een hoog kopienummer.

Met behulp van het transfectiemiddel polyethyleen EIN of PEI, werden de cellen 48 uur lang laten groeien voordat ze werden geoogst. Vervolgens wordt eiwitzuivering uitgevoerd met behulp van affiniteitshars, gevolgd door gelfiltratie om het eiwitcomplex van belang te zuiveren om structurele en functionele studies uit te voeren. Uiteindelijk maakt dit betaalbare en eenvoudige zoogdierexpressiesysteem expressie en zuivering van eiwitten en eiwitcomplexen mogelijk die moeilijk te expresseren zijn in bacteriecellen.

Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is de gemak en veelzijdigheid voor het uitdrukken van eiwitcomplexen. Het is bijna net zo eenvoudig als het maken van eiwitten in bacteriën, vooral omdat je eiwitexpressievectoren kunt mixen en matchen. De methode kan aanvankelijk op kleine schaal worden gebruikt om de expressie van eiwitcompressen te testen, maar het is gemakkelijk schaalbaar om een goede opbrengst van eiwitcompressen te produceren. Voor structurele en functionele studies is het belangrijkste succescriterium het gezond houden van de cellen, vrij van bacteriële of gistaandoeningen.

Omdat antibiotica in de media uw eiwitopbrengst aanzienlijk verminderen. Om te beginnen, verwijder een cryo-vial met één milliliter HEC 2 9 3 F-cellen met een dichtheid van 20 miljoen cellen per milliliter uit de vloeibare stikstof en ontdooi snel in een waterbad van 37 graden Celsius. Breek eventuele klonten op door een paar keer op en neer te pipetteren en pipet de hele inhoud in een 250 milliliter conische celkweekkolf met 34 milliliter voorverwarmd medium.

Plaats de cultuur in een bevochtigde orbitale schudkuip bij 37 graden Celsius, 120 RPM en 5% koolstofdioxide na 48 uur. Controleer de cellevensvatbaarheid door trianblauw. De normale cellevensvatbaarheid bij dit stadium is ongeveer 70% wanneer de cellen een telling van ongeveer 1 miljoen cellen per milliliter hebben bereikt.

Masseer ze tot een eindtelling van 0,35 miljoen cellen per milliliter in een 250 milliliter conische celkweekkolf met 60 milliliter voorverwarmd medium. Blijf de cellen elke 48 uur masseren of wanneer ze een telling van ongeveer 2 miljoen cellen per milliliter bereiken. Hier wordt een staal van Trian blauwe Trian HEC 2 9 3 F-cellen bij 2,3 miljoen cellen per milliliter van een voorraad getoond die klaar is om te worden gezaaid voor transfectie. Cellen mogen alleen aanwezig zijn als enkele of zich delende cellen. Als cellen overgroeid zijn, vormen ze grote klonten en hebben ze een zeer lage levensvatbaarheid zoals in deze afbeelding wordt getoond.

Als cellen clusters vormen, kunnen deze worden verbroken door krachtig te vortexen gedurende 25 seconden. Om de grootschalige culturen te beginnen, zaai de cellen bij een half miljoen cellen per milliliter in een eindvolume van 300 milliliter in elke liter rollenfles. Incubeer gedurende 24 uur in een bevochtigde orbitale shaker bij 37 graden Celsius, 135 RPM en 5% koolstofdioxide totdat de cellen een dichtheid van 1 miljoen cellen per milliliter bereiken.

Pipet vervolgens een totaal van 300 microgram gefilterde gesteriliseerde DNA in 30 milliliter fosfaatgebufferd zout of PBS en vortex krachtig gedurende drie seconden. Voeg vervolgens 1,2 milliliter van 0,5 milligram per milliliter. Gefilterde gesteriliseerde PEI toe aan de PBSDNA-oplossing en vortex krachtig gedurende nog eens drie seconden.

Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur voordat u het mengsel aan de cellen toevoegt volgens cot. Transfectie incubeer de cellen in een bevochtigde orbitale schudkuip gedurende nog eens 48 uur bij 37 graden Celsius, 135 RPM en 5% koolstofdioxide na 48 uur. Oogst intracellulaire eiwitten door cellen te centrifugeren bij 3000 keer G gedurende vijf minuten.

Als de cellage niet direct wordt gebruikt, kan deze worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de zuivering van eiwitcomplexen uit de kern waarbij een van de eiwitten een flag-tag heeft. Om de zuivering te beginnen, schorten de celpalette op in ongeveer 40 milliliter voorgekoelde lysisbuffer per liter cultuur, door meerdere keren op en neer te pipetteren en een glashomogenisator te gebruiken om gedurende drie cycli van 15 seconden aan en 15 seconden uit te sonificeren.

Centrifugeer vervolgens uw 108.000 keer G gedurende 25 minuten bij vier graden Celsius en bewaar de supinate. Evenwichtig vervolgens 1,2 milliliter anti-flag gepakte aroshars per liter cultuur door drie keer te wassen met resin-evenwichtingsbuffer. Incubeer het supinaat, dat de volledige cellextract vertegenwoordigt, met de affiniteitshars in een of meer 50 milliliter centrifugeerbuizen door gedurende 30 tot 120 minuten zachtjes te roteren bij vier graden Celsius. Na incubatie centrifugeer gedurende een minuut bij 3000 keer G bij vier graden Celsius. Gooi het supinaat weg en breng de hars over in een 15 milliliter centrifugeerbuis en was met in totaal 45 milliliter voorgekoelde buffer, centrifugeer één keer en gooi het supinaat weg. Herhaal het wassen en centrifugeren met behulp van buffer met hoog zoutgehalte, gevolgd door buffer met laag zoutgehalte en TEV-afsnijdingsbuffer.

Zorg ervoor dat elke wasbeurt voldoende is om de hars volledig te resuspenderen, maar niet langer. Verzamel vervolgens een 10 microliter staal van hars en verdun in één volume twee keer eiwitbelastingbuffer voor analyse om het gebonden eiwitstaal te vertegenwoordigen. Gebruik geen reducerende middelen, omdat deze het antilichaam van de hars zullen losmaken