Collectie, Isolatie, en Flowcytometrische analyse van de menselijke Endocervicale Monsters
6 juli 2014
Het gebruik van cytobrush-sampling om lymfocyten en monocyten uit de endocervix te verzamelen is een minimaal invasieve techniek die monsters levert voor analyse van de immuniteit van het vrouwelijke genitale kanaal. In dit protocol beschrijven we het verzamelen van cytobrush-monsters en het isoleren van immuuncellen voor flowcytometrie-analyses.
Het algemene doel van deze procedure is om cervicale mononucleaire cellen te isoleren uit een endocervical schraapje met behulp van een cyto-borstel. Eenmaal geïsoleerd, kunnen deze cellen worden gebruikt in meerdere analyses, inclusief flowcytometrie, waarbij u het fenotype en de functie van immuuncellen in het vrouwelijk genitale kanaal kunt bepalen. De verzameling van cyto-borstel- en cervicale lavage-monsters is een niet-invasieve procedure die moet worden uitgevoerd door een gynaecoloog of een getrainde arts.
De cervicale vaginale lavage wordt als eerste uitgevoerd, waarbij de endocervix wordt gewassen met twee milliliters PBS, die vervolgens wordt verzameld uit de achterste fornix na de lavage. Het holle uiteinde van een cervicale schraper wordt tegen de baarmoederhals geplaatst en geroteerd om de cervicale opening of het cervicale os te bemonsteren. Vervolgens wordt de cyto-borstel in de endocervical OS ingebracht en 360 graden geroteerd.
Het gebruik van zachte druk zal helpen om ervoor te zorgen dat er geen bloedbesmetting van het monster is. De cyto-borstel in de schraper worden verzameld in een buis met vijf milliliters PBS. Na transport op ijs wordt het monster snel gevormd om de cellen van de cyto-borstel te scheiden.
Zodra u de monsters met media hebt gewassen, worden ze vervolgens gefilterd door een honderd micron nylonfilter. Dit maakt de verzameling van de lymfocyten, monocyten en epitheelcellen uit het monster mogelijk. De cellen zijn nu klaar om te worden gekleurd met antilichamen tegen oppervlakte-eiwitten, en zodra ze zijn gefixeerd, kunnen ze op de flowcytometer worden gebruikt.
We zullen u laten zien hoe we de resulterende gegevens analyseren om het fenotype van zowel de CD vier als CD acht T-celpopulaties te beoordelen die aanwezig zijn in de baarmoederhals. Hallo, ik ben een promovendus in het lab van Dr.Keith folk. Ons onderzoek richt zich op het verband tussen immuunactivatie en HIV-gevoeligheid, evenals op de progressie van de ziekte.
Omdat de meeste HIV-infecties nu plaatsvinden door heteroseksuele omgang, zijn we ook geïnteresseerd in het bepalen van de correlaties van bescherming tegen HIV-overdracht naar het vrouwelijke genitale kanaal. Helaas kan het verzamelen van monsters uit het genitale kanaal erg uitdagend zijn, evenals redelijk invasief voor deelnemers aan het onderzoek. Het gebruik van cyto-borstels om CMC's of cervicale mononucleaire cellen te verzamelen, is een snellere en eenvoudiger methode in vergelijking met andere protocollen zoals biopsieën.
In deze video zullen we u laten zien hoe u CMC's kunt isoleren en voorbereiden voor gebruik in flowcytometrie of andere downstream toepassingen. Na verzameling worden de cyto-borstel en schraper getransporteerd in vijf milliliters koude PBS. Het is belangrijk om de monsters op ijs te transporteren tot het moment van verwerking, wat niet meer dan twee uur na monsterverzameling mag zijn.
Eventuele monsters die op dit moment besmet zijn met bloedsporen, moeten worden uitgesloten van verdere analyse om de cellen van de cyto-borstel te scheiden. Vorm de buis gedurende 45 seconden op hoog niveau, omdat er nog steeds cellen op de cyto-borstel en schraper achterblijven. Ze moeten handmatig worden verwijderd.
Trek een nieuw paar handschoenen aan en gebruik de cyto-borstel om eventueel resterend materiaal van de schraper te schrapen. Na het weggegooien in een bleekoplossing, gebruikt u uw duim en wijsvinger om alle resterende cellen uit de cyto-borstel te verwijderen door op en neer te knijpen over de falkenbuis. Na het weggegooien van de cyto-borstel, verwisselt u uw handschoenen voordat u een ander monster bereidt, gebruikt u een overdrachtpijpje om de zijden van de buis met PBS te wassen en zorgt u ervoor dat al het monster wordt verzameld.
Plaats een honderd micron nylonfilter over een nieuwe Falcon-buis en gebruik de pijp om het hele volume van de PBS-oplossing te filteren. Voeg vijf milliliters RPMI-medium zonder FBS toe aan de originele buis.
Gebruik de pijp om de zijden van de buis grondig te wassen om eventueel aanwezig slijm of puin te verwijderen. Draag vervolgens het medium over naar het filter. Gebruik een deel van het gefilterde medium om de bodem van het filter te wassen voordat u het in bleek gooit.
Om de geïsoleerde cellen te pelleteren. Centrifugeert u de monsters gedurende 10 minuten bij 1500 r pm om te voorkomen dat de pellet loskomt. Vergeet niet om de centrifuge-rem uit te schakelen als de cellen worden gebruikt voor flowcytometrie.
Bereid de blokkeringsoplossing voor die nodig is om niet-specifieke antilichaambinding te voorkomen. Gedurende de centrifugeerstap gebruikt u 100 microliters blokkeringsoplossing per monster. De blokkeringsoplossing bevat 93,2 microliters fax, wassen of PBS plus 2%FBS vijf microliters FBS en 1,8 microliters muis IgG.
Na het spinnen zal in de meeste monsters met levensvatbare cellen een zichtbare pellet aanwezig zijn. In sommige gevallen kan de pellet vrij groot zijn. In andere monsters kan hij nauwelijks zichtbaar zijn.
De grootte van de pellet is niet altijd gerelateerd aan de celopbrengst. Giet voorzichtig het supernatant en zorg ervoor dat u de cellen niet verstoort. Resuspendeer de pellet door voorzichtig te roeren. Was de cellen met vijf milliliters PBS en herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1500.
RRP M met de rem uit, decant nogmaals het supernatant en resuspendeer het pellet zoals eerder. Op dit punt zijn de cellen klaar om te worden gecryopreserveerd of voor het kleuren op het oppervlak. Het is gunstig om niet-specifieke binding te blokkeren door cellen te incuberen met een blokkeringsoplossing die eerder tijdens een centrifugatie werd bereid. Nadat de celpellet is gesuspendeerd, voegt u honderd microliters blokkeringsoplossing toe aan het monster en mengt u grondig.
De resterende protocolstappen kunnen in een 96-wellplaat of faxbuis worden uitgevoerd. Afhankelijk van de grootte van de CMC-pellet. Breng de blokkeringsoplossing en het cellenmengsel over in een faxbuis.
Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gedurende de 10 minute
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een minimaal invasieve techniek voor het verzamelen van lymfocyten en monocyten uit de endocervix met behulp van cytobrush-bemonstering. De geïsoleerde cellen kunnen worden geanalyseerd op immuunfunctie in het vrouwelijke genitale kanaal.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Gynaecologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Cytobrush-bemonstering is een niet-invasieve methode.
- Het maakt het mogelijk om immuuncellen uit het vrouwelijke genitale kanaal te verzamelen.
- Flowcytometrie kan worden gebruikt om deze cellen te analyseren.
- Het begrijpen van immuuncellfunctie is cruciaal voor de gezondheid van de vrouwelijke reproductie.
Doel van het onderzoek
- Om cervicale mononucleaire cellen uit endocervical monsters te isoleren.
- Om analyse van immuuncelfenotype en -functie mogelijk te maken.
- Om een protocol te bieden voor gynaecologen en getrainde artsen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van cervicale lavage-monsters met behulp van PBS.
- Bemonstering van de cervicale os met een cervicale schraper.
- Gebruik van een cyto-borstel om cellen uit de endocervical os te verzamelen.
- Flowcytometrie voor verdere analyse van geïsoleerde cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van cervicale mononucleaire cellen.
- Haalbaarheid van het gebruik van cytobrush-bemonstering in klinische omgevingen.
- Mogelijkheid voor het analyseren van immuunresponsen in het vrouwelijke genitale kanaal.
- Gedemonstreerde methode voor niet-invasieve monsterverzameling.
Conclusies
- Cytobrush-bemonstering is effectief voor immuuncelisolatie.
- Biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de immuniteit van het vrouwelijke genitale kanaal.
- Kan het begrip van reproductieve gezondheid en ziekte verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding mucosal immunity in the female genital tract is critical for evaluating HIV transmission risk and vaccine efficacy. This protocol enables minimally invasive collection and phenotypic analysis of cervical mononuclear cells, supporting target validation in infectious disease research. The approach provides quantitative immune profiling that informs mechanistic de-risking of mucosal vaccine candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lymphocyte and monocyte phenotypes in the endocervical microenvironment.
- Operational Value: Provides a reproducible method for isolating viable immune cells from minimally invasive cytobrush samples.
- Predictive Value: Supports assessment of immune activation markers like CD69 and HLA-DR, which correlate with HIV susceptibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized single-cell suspensions suitable for flow cytometric analysis of surface and intracellular markers.
- Operational Value: Includes defined steps for cell dissociation, filtration, and washing to ensure sample consistency across donors.
- Assay Readiness: Enables coupling with cervical-vaginal lavage for simultaneous soluble mediator analysis (e.g., cytokines, chemokines).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links ex vivo phenotypic data from human endocervical samples to mechanisms of mucosal immune regulation.
- Biomarker Alignment: Permits quantification of HIV co-receptors (e.g., CCR5) and checkpoint markers (e.g., PD-1) relevant to transmission and pathogenesis.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Facilitates evaluation of immune environments that may influence vaccine take or breakthrough infection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by providing primary human tissue-derived immune cells for hypothesis testing prior to model-based screening.
- Discovery Biology: Enables direct phenotypic profiling of CD4+ and CD8+ T-cell subsets in the female genital tract, a key site for HIV transmission.
- Screening: Produces standardized cell preparations that support reproducible antibody staining and flow cytometric readouts.
- Analytics: Delivers quantitative frequency and expression data for immune phenotypes, enabling inter-sample comparison and gating strategy development.
- Translational Research: Connects cellular phenotype data with soluble mediator profiles from cervical-vaginal lavage to define local immune milieu.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, minimally invasive sampling technique applicable across infectious disease and vaccine development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing human-relevant mucosal immune data.
- Operational Value: Standardizes sample processing steps (e.g., vortex dissociation, filtration, centrifugation) to minimize variability.
- Strategic Value: Reduces reliance on invasive biopsies, improving sample acquisition feasibility in clinical studies.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by characterizing mucosal immune activation states that may predict vaccine efficacy or HIV susceptibility.
Implementation Considerations
- Requires training in cytobrush technique and sterile sample handling to avoid blood contamination.
- Depends on access to flow cytometry and antibody panels validated for cervical mononuclear cells.
- Necessitates cold chain maintenance (ice transport, 4°C processing) to preserve cell viability.
- Involves exclusion criteria for blood-contaminated samples to ensure data integrity.
- Requires optimization of antibody titration and viability gating due to higher doublet rates and variable lymphocyte yields compared to PBMCs.
