Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest
23 september 2014
De analyse van eiwitexpressie in jonge embryonale muiskleppen is belemmerd door het beperkte beschikbare weefsel. Dit manuscript biedt een protocol voor het bereiden van eiwitten uit zich ontwikkelende embryonale muisklepgebieden voor western blot-analyse.
Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te isoleren en te extraheren uit embryonale hartkleppen. Dit wordt bereikt door eerst een embryo van een zwangere muis te isoleren. In de tweede stap wordt het hart uit het embryo gedissecteerd en in de laatste stap worden de hartkleppen verzameld.
Het weefsel wordt gelyseerd en het resulterende eiwitmonster wordt voorbereid voor verdere analyse. Uiteindelijk kan western BLO-analyse worden gebruikt om eiwitexpressieniveaus te beoordelen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de dissectiestappen moeilijk te leren zijn vanwege de kleine compacte vorm van het zich ontwikkelende hart.
Op de gewenste embryonale ontwikkelingsdag, gebruik 70% ethanol om de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til vervolgens de huid en spieren van de onderbuik op en weg van de inwendige organen, en snij de onderbuikholte open om toegang te krijgen tot de baarmoederhoorn. Houd vervolgens de baarmoederhals vast met een pincet en snijd voorzichtig de baarmoederhals tot aan de punten.
Til vervolgens de baarmoederhoorn op en snijd eventueel bindweefsel door dat de hoorn op zijn plaats houdt en voltooi de verwijdering door de verbinding van de baarmoederhoorn met de uct door te snijden. Plaats de gedissecteerde baarmoederhoorn in een petrischaal met koud 0,1 molair tris-buffer en spoel indien nodig. Snijd vervolgens de baarmoederhoorn door.
Open de lengte in om de embryozakken bloot te leggen. Om een embryo bloot te leggen, snijd een embryozak open op de overgang van de placenta en het embryo en snijd de navelstrengvaten door om het embryo te bevrijden. Plaats het gedissecteerde embryo in een tweede petrischaal met koud 0,1 molair tris-buffer en zet de eerste petrischaal met de resterende ongedisseceerde embryo's terug op ijs tot de volgende embryodissectie.
Na decapitering, plaats het embryo op zijn rug en snijd de borstwand verticaal langs de zijkant van de ribbenkast nabij een voorpoot en horizontaal boven het diafragma. Om het hart te visualiseren, open de borstwand. Houd vervolgens het pincet hoog langs de grote vaten, til het hart op en snijd de vaten eronder door.
Snijd vervolgens boven het pincet om het hart te bevrijden. Als de longvaten ongesneden blijven, verwijder de longen met het hart voordat u verdergaat met de embryonale stadia hierin beschreven, de longslagader is licht opake. Na identificatie van de slagader, snijd en verwijder deze boven het niveau van de klep.
Snijd nu net onder de longklep, vermijd het ECD ventriculaire myocardium en verwijder overtollig tris-buffer uit de belangrijke regio. Voordat de klep in een einorbuis wordt geplaatst die twee microliters lysisbuffer bevat, zoals de longslagader, zal de aorta er licht opake uitzien. Na identificatie, snijd net onder de aortaklep.
Vermijd opnieuw het trabeculate ventriculaire myocardium. Verwijder eventueel overtollig tri-oplossing en breng vervolgens de klep over naar de einorbuis met lysisbuffer en longweefsel. Nadat al het weefsel is verzameld, plaats de monsters onmiddellijk bij min 80 graden Celsius tot verder.
Gebruik voor de eiwitextractie, ontdooi de verzamelde weefsels op ijs en pellet de monsters gedurende een minuut bij 13.100 Gs bij vier graden Celsius. Controleer het volume van het resulterende monster en gebruik lysisbuffer om het totale volume op 40 microliter te brengen. Voeg vervolgens vijf millimeter roestvrijstalen kralen toe om de monsters te verstoren en homogeniseer ze in een lyr gedurende twee tot vier minuten op 50 hertz, volgens de instructies van de fabrikant.
Na homogenisatie, draai de buisjes kort en breng de monsters over naar nieuwe buisjes, waarbij het onoplosbare deeg wordt achtergelaten voor verdere experimentele analyse. Met behulp van deze bereidingstechniek kan gefosforyleerd smad 1 5 8 worden gedetecteerd in enkele aortaklepregio's van E 13.5 embryo's. Bijvoorbeeld, het eiwit dat is geïsoleerd uit zelfs een enkele klepregio is voldoende om een zwakke p smad-band te detecteren, waarbij de signaalintensiteit evenredig toeneemt met het aantal klepregio's dat wordt gepoold.
Belangrijk is dat de p smad beta-actineverhouding duidelijk constant blijft over de verschillende monstersgroottes vanwege de lage eiwitniveaus. Hetzelfde membraan kan niet worden verwijderd en opnieuw worden onderzocht voor totaal smad. Echter, een apart membraan dat totaal smad een en beta-actine vertoont, vertoont hetzelfde expressiepatroon. Deze klepregio's zijn bijna volledig vrij van verontreinigd ventriculaire myocardium door deze bereidingstechniek in combinatie met monsters van het rechter ventrikel, de marker voor ventriculaire myocardium, een NP is niet detecteerbaar in aortaklepregio's, terwijl deze marker gemakkelijk in het ventrikel wordt gedetecteerd.
Verder is de marker voor ventriculair myocardium myosine lichte keten twee V ook gemakkelijk detecteerbaar in het ventrikelmonster, maar nauwelijks detecteerbaar in de aortaklepregio's, wat de nauwkeurigheid van de dissectie onderstreept. Na deze dissectie kunnen andere metingen zoals QPCR of RN AIC worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke downstream genen worden beïnvloed tijdens de verschillende ontwikkelingsstappen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het isoleren en extraheren van eiwitten uit embryonale hartkleppen bij muizen. De methode pakt de uitdagingen aan bij het analyseren van eiwitexpressie als gevolg van de beperkte beschikbaarheid van weefsel.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Cardiovasculair onderzoek
Achtergrond
- Proteïne-expressieanalyse in embryonale weefsels wordt vaak beperkt door de monstergrootte.
- Inzicht in proteïneniveaus in hartkleppen is essentieel voor ontwikkelingsstudies.
- Western blot-analyse is een veelgebruikte techniek voor het beoordelen van proteïne-expressie.
- Het dissekeren van kleine weefsels, zoals embryonale harten, kan technisch uitdagend zijn.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor eiwitextractie uit embryonale muishartkleppen.
- Om western blot-analyse te faciliteren voor het bestuderen van eiwitexpressieniveaus.
- Om de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid bij eiwitanalyse van beperkte monsters te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van embryo's uit drachtige muizen.
- Dissectie van het hart uit het embryo.
- Verzamelen van hartkleppen voor eiwitextractie.
- Lysering van weefsel om eiwitmonsters voor analyse voor te bereiden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van eiwitten uit embryonale hartkleppen.
- Voorbereiding van monsters die geschikt zijn voor western blot-analyse.
- Demonstratie van dissectietechnieken voor effectief leren.
- Beoordeling van eiwitexpressieniveaus in ontwikkelend hartweefsel.
Conclusies
- Het protocol maakt een effectieve bestudering van de eiwitexpressie in embryonale hartkleppen mogelijk.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor het beheersen van de dissectietechnieken.
- Deze methode kan het onderzoek naar hartontwikkeling en aanverwante vakgebieden verder bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Eiwitisolatie uit beperkte hoeveelheden embryonaal weefsel maakt het mogelijk om de activering van signaalroutes in vroege ontwikkelingsmodellen te detecteren. Deze aanpak ondersteunt de validatie van targets door semi-kwantitatieve gegevens te verschaffen over gefosforyleerde eiwitten uit samengevoegde, gemicrogedissecteerde klepgebieden. De methode pakt een belangrijke flessenhals in preklinisch onderzoek aan, waarbij schaarste aan monsters de mechanistische risicoreductie van cardiovasculaire targets belemmert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen bij de ontwikkeling van hartkleppen mogelijk via de detectie van gefosforyleerde signaleringsproteïnen zoals pSmad1/5/8.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor proteïne-extractie uit vier aortaklepregio's van muizen in stadium E13.5, waarbij elke regio ~1 µg proteïne oplevert.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door een semi-kwantitatieve beoordeling van pathway-activatie in ziekterelevante embryonale systemen mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische monsters voor op downstream western blot-analyse, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen bij fenotypische screening mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Standaardiseert lyse- en homogenisatieprotocollen met behulp van een Tris-gebaseerde buffer met proteaseremmers en SDS-monsterbuffer voor denaturatie.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform over verschillende ontwikkelingsmomenten mogelijk door weefsel te poolen om beperkingen door een lage eiwitopbrengst te overwinnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt eiwitexpressiegegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie door consistente pSmad/β-actin-ratio's over verschillende monstergroottes.
- Mechanische risicoreductie: Vermindert ambiguïteit bij target engagement door uitsluiting van het ventriculaire myocard te bevestigen via de afwezigheid van MYL2V- en ANP-markers in klepregio's.
- Predictieve betrouwbaarheid: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door eiwitexpressiepatronen te koppelen aan ontwikkelingsstadia met behulp van interne controles.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, door mechanistische read-outs te bieden uit ziekte-relevante embryonale systemen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-toetsing en pathway-verduidelijking door detectie van gefosforyleerde signaleringsproteïnen in klepweefsel.
- Screening: Levert assay-klare monsters met gestandaardiseerde proteïne-extractie, wat reproduceerbare western blot-resultaten mogelijk maakt voor compound-screening.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen via chemiluminescente signaalintensiteit proportioneel aan de proteïnepoolgrootte, ter ondersteuning van comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Handhaaft continuïteit van embryonale ontdekking naar preklinische modellen door pathway-specifieke expressiepatronen te behouden die detecteerbaar zijn in afzonderlijke blots voor totaal Smad en β-actine.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbare capaciteit voor proteïne-isolatie in embryonale cardiovasculaire studies, waardoor redundante protocolontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij doelwitvalidatie door de detectie van gefosforyleerde eiwitten met een lage abundantie uit gemicrodissecteerde weefsels mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gedefinieerde lysisvolumes, homogenisatie op basis van beads en consistente monstervoorbereiding voor western blot.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit bij vroege cardiovasculaire doelwitbeoordelingen te verminderen.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering door semi-kwantitatieve gegevens over pathway-activatie uit embryonale klepregio's te verschaffen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microdissectie van embryonale hartstructuren om klepregio's te isoleren zonder contaminatie door ventriculair myocardium.
- Afhankelijk van instrumentatie voor homogenisatie (lyser met roestvrijstalen kraaltjes) en centrifugatie bij 13,100 × g voor monsterclarificatie.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams van de lysisbuffervolumes (40 µL eindvolume) en het gebruik van protease-remmers om monsterconsistentie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het protocol op andere embryonale weefsels of ontwikkelingsstadia buiten de aortaklepregio's in stadium E13.5.
- Bevat praktische beperkingen, zoals het onvermogen om het totaalproteïne via spectrofotometrie te kwantificeren vanwege de lage opbrengst, waardoor men afhankelijk is van semi-kwantitatieve western blot-analyse.
