Name: Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Leer eiwitisolatie uit embryonale muizenhartkleppen voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt western blot-analyse mogelijk vanuit beperkt weefselmateriaal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Andrea Portbury en Davin Townley-Tilson bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript en de NIH (subsidie # R01HL061656) voor de financieringsondersteuning.

OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. 1 Accijnzen de aortaklep <ol><li> Met een goedgekeurde euthanasie techniek voor het embryonale stadium plaats, euthanize een zwangere muis met pups op de gewenste embryonale dag (E) van ontwikkeling. </li><li> Gebruik van 70% ethanol aan de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til de huid en spieren van de onderbuik omhoog en van de inwendige organen en ontleden onderste buikholte van het wijfje open toegang tot de baarmoeder hoorn mogelijk. </li><li> Om de baarmoeder hoorn op te halen, houdt u de baarmoederhals met een pincet en knip voorzichtig caudaal van de tang. Til de baarmoeder hoorn, snijden elke bindweefsel dat de hoorn op zijn plaats houdt, en voltooi de verwijdering door het snijden van de kruising van de baarmoeder hoorn met de eileider. </li><li> Plaats de uitgesneden uterushoorn in een petrischaal met cold 0,1 M Tris buffer (pH 7,6) en spoelen indien nodig. Snij vervolgens de baarmoedertak geopend lengte-wijs om de embryonale zakken bloot. </li><li> Om het embryo bloot opengesneden een embryonale sac op de kruising van de placenta en de embryo en de navelstreng schepen de embryo lossnijden. Plaats de ontleed embryo in een tweede petrischaal met koude 0,1 M Tris buffer. Zet de eerste petrischaal met de resterende undissected embryo ijs tot klaar voor de volgende embryo. </li><li> Om borstwand toegang binnen het embryo te verbeteren, onthoofden het embryo. Als genotypering is nodig, te verwijderen en op te slaan een extra stuk weefsel in een Eppendorf buis geplaatst op ijs. </li><li> Plaats het embryo op zijn rug, en snijd de borstwand verticaal langs de kant van de ribbenkast, bij een voorpoot en horizontaal boven het membraan naar het hart te visualiseren. Open vervolgens de borstwand naar het hart bloot te leggen. </li><li> Met behulp van een tang te houden hoog langs de grote vaten, til het hart met behulp van een tang, en de vaten onder te snijden. Hetn, bezuiniging de tang naar het hart bevrijden. Als de longvaten ongesneden blijven, kunnen de longen worden verwijderd met het hart en dienen alvorens verder worden verwijderd. </li><li> Snij en verwijder de longslagader boven het niveau van de afsluiter; in de embryonale stadia hierin beschreven, de longslagader enigszins ondoorzichtig, hetgeen helpt bij het onderscheid van het klepgebied. Snij net onder de pulmonaalklep, het vermijden van de trabeculated ventriculaire myocard en verzamelen zoals beschreven in stap 1.10 als dit gebied is ook van belang. Hier en in de volgende stap gebruikt capillaire werking overtollige Tris buffer verwijderd van het interessegebied trekken vóór verzamelen in lysis buffer. </li><li> Verwijder voorzichtig de aorta distaal van de aortaklep, juist boven het niveau van de afsluiter; zoals de longslagader, de aorta blijft enigszins ondoorzichtig op deze embryonale stadia, hulp bij de verwijdering ervan. Snij net onder de aortaklep, opnieuw de trabeculated ventriculaire myocard vermijden, en de overdracht van delos met een tang om een ​​Eppendorf buis met 2 ui lysis buffer (in de tabel Materials beschreven) die protease en fosfataseremmers op ijs. </li><li> Herhaal stappen 1,6-1,10 totdat de kleppen zijn uitgesneden uit alle embryo, verzamelen elke klep in een aparte Eppendorf buis. Als alle embryo hetzelfde genotype kunnen alle kleppen worden opgevangen in een Eppendorf buis. </li><li> Als genotypering wordt uitgevoerd om te bepalen welke kleppen poolen moeten onmiddellijk monsters in lysis buffer bij -80 ° C tot verder gebruik. Monsters kunnen vervolgens worden samengevoegd na genotypering (stap 2.1.1). </li></ol> 2 Protein Extraction <ol><li> Ontdooi verzamelde weefsels op ijs en centrifugeer bij 13.100 xg gedurende 1 min naar de weefsels in lysis buffer verzamelen op de bodem van de buis. <ol><li> Als embryo&#39;s werden het genotype, gebruik maken van een pipet om voorzichtig te verzamelen en het zwembad lysis buffer met de klep regio&#39;s van embryo&#39;s met gelijkaardige genotypes. Om een ​​sterke b zorgenen, het bundelen van 3-4 klepgebieden van E13.5 embryo&#39;s per monster wordt aanbevolen. </li><li> Als alle embryo&#39;s waren van hetzelfde genotype en al klepgebieden werden gebundeld in stap 1.10, lyseren het gehele monster, zoals beschreven in stap 2.2. </li></ol></li><li> Controleer het volume van het resulterende samengevoegde monster en voeg lysis buffer tot een totaal volume van 40 ui; Vervolgens, verstoren en homogeniseren monsters met behulp van 5 mm rvs kralen in Eppendorf buizen. Bedien de lyser 2-4 minuten bij 50 Hz, volgens instructies van de fabrikant. Spin buizen kort (~ 13.100 xg gedurende 1 min), en doorvoermonsters nieuwe buizen, met achterlating van de onoplosbare brokstukken. </li><li> Voorbereiden en afzonderlijke monsters voor SDS-PAGE en daaropvolgende transfer voor western blot analyse volgens een protocol zoals Eslami e.a. 9. Vloeipapier voor een laad-controle-eiwit is essentieel voor eiwit kwantificering. </li></ol>

<ol><li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li>
<li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li>
<li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li>
<li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells%3A+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li>
<li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-ordinating+Notch%2C+BMP%2C+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development%3A+the+pulmonary+push+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li>
<li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De mogelijkheid om eiwit niveaus hartklep regio&#39;s te kwantificeren in de vroege embryonale muis en kuiken biedt een extra instrument voor het begrijpen van de kritische cellulaire signalering evenementen voor klep ontwikkeling. Ons protocol hierin beschreven verschilt niet veel van de standaard eiwitisolatie procedures. Echter, door het wijzigen van een aantal belangrijke stappen, hebben we met succes gefosforyleerd eiwitten verkregen uit zeer kleine steekproeven. Om dit resultaat te bereiken, zijn de volgende stapp...

In staat zijn om eiwit expressie niveaus te identificeren en te kwantificeren is een standaard techniek voor dier-en cel-gebaseerde experimenten. Ondanks een langdurige interesse in vroege embryonale ontwikkeling hartklep, evalueren eiwitexpressie in dit specifieke weefsel tijdens ontwikkeling momenteel beperkt tot immunohistochemie in zowel het kuiken en muis 1,2. Een deel van de moeilijkheid kwantificeren eiwitexpressie in de ontwikkeling kleppen meeste modelorganismen (bijvoorbeeld kuiken en muis) is de kleine omvang van de kleppen die de hoeveelheid eiwit die kan worden verkregen beperkt. Zo kwantitatieve analyses, onderzoekers normaliter afhankelijk RNA-extractie en amplificatie voor daaropvolgende kwantitatieve PCR of microarray-analyse 2-5. Echter, RNA en eiwit expressie niveaus niet geheel correlatieve 6, dus gericht op RNA expressie kan geen strenge wegens de vele veranderingen die optreden in een bepaalde signaleringroute op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling. Op basis van deze grens in de momenteel beschikbare methoden het doel van deze procedure is een protocol voor het betrouwbaar om voldoende hoeveelheden eiwitten van de muis embryonale ontwikkeling hartklep gebieden voor kwantitatieve analyse van veranderingen die optreden in verschillende signalisatiewegen belang te ontwikkelen de rijping van dit weefsel. Embryonale kleppen zijn reeds algemeen ontleed uit muizen voor RNA isolatie en vervolgens genexpressieanalyse 2-5. Echter, deze studies beperkt tot het gebruik genexpressie als uitlezen van signaleringsroute activatie, waarbij de detectie van sporen posttranslationele eiwit modificaties die stroomafwaartse signalering beïnvloeden niet toestaat. De RNA-isolatietechnieken als uitgangspunt, begonnen we met het ontleden van de gebieden van belang. Omdat onze interesse was het opsporen van gefosforyleerd eiwitten die indicatief zijn voor het signaleren pat warenHWAY activiteit gedurende een bepaalde periode aortaklep ontwikkeling (E13.5-14.5), voerden we alle dissecties in fosfaatvrije Tris buffer en de kleppen in een Tris-gebaseerde lysis buffer met fosfatase en proteaseremmers verzameld. In het specifieke geval enkel de aortaklep gebieden werden opgevangen, maar de pulmonaalklep regio kan gemakkelijk worden verkregen op hetzelfde moment. De klep gebieden werden vervolgens gehomogeniseerd en gecombineerd met een monsterbuffer die momenteel wordt gebruikt voor eiwitexpressie bij volwassen hartkleppen 7 bestuderen. Via kleine monstervolumes (bijvoorbeeld 2 ui) en samenbrengen klepgebieden van embryo&#39;s met hetzelfde genotype, waren we in staat om gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitten detecteren embryonale dag 13.5 8. Omdat de klep gebieden worden ingevroren en opgeslagen in lysis buffer, kan embryo genotyperen indien nodig voordat bundelen. Deze techniek verbreedt de set van tools die beschikbaar zijn voor het evalueren van cel signaling wegen tijdens de ontwikkeling en biedt een kwantitatieve compliment voor immunohistochemie, in het bijzonder voor de ontwikkeling van hartkleppen. Deze techniek moet niet alleen nuttig om ontwikkelingsstoornissen cardiologen, maar ook voor alle ontwikkelings-biologen die werken met een vroeg stadium embryo&#39;s geïnteresseerd zijn in regio&#39;s die beperkte weefsel bevatten.

<table><tbody><tr><td>Tijdszwangere muis</td><td></td><td></td><td>Te disseceren in het embryonale stadium van belang</td></tr><tr><td>Stereoscopisch microscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M Tris, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincet, #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie naaldhouders</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13560</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie naalden</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13561-10</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet, 20 &mu;l, met tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyse buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>Voeg 1 tablet toe aan 10 ml lyse buffer</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen kralen</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eiwit isolatie van het ontwikkelen van embryonale mouse heart valve gewest

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot-analyse is een veel gebruikte techniek voor het detecteren en kwantificeren van eiwitniveaus. Echter, voor kleine weefselmonsters kan deze analysemethode niet voldoende gevoelig zijn om een eiwit van belang te detecteren. Om deze moeilijkheden te overwinnen, hebben we protocollen onderzocht voor het verkrijgen van eiwitten uit volwassen menselijke hartkleppen en deze protocollen aangepast voor de zich ontwikkelende vroege embryonale muisvarianten. In het kort, worden de embryonale aortische klepregio's van de muis, inclusief de aortaklep en de omringende aortawand, verzameld in het minimale mogelijke volume van een Tris-gebaseerde lysbufer met proteaseremmers. Indien vereist op basis van de kweekstrategie, worden embryo's gegenotypiseerd voordat vier embryonale aortische klepregio's voor homogenisatie worden gepoold. Na homogenisatie wordt een SDS-gebaseerde monsterbuffer gebruikt om het monster te denatureren voor gebruik op een SDS-PAGE-gel en daaropvolgende western blot-analyse. Hoewel de eiwitconcentratie te laag blijft om te kwantificeren met behulp van spectrofotometrische eiwitkwantificeringsassays en er monster overblijft voor verdere analyses, kan deze techniek worden gebruikt om met succes gefosforyleerde eiwitten via western blot te detecteren en semi-kwantificeren uit gepoolde monsters van vier embryonale dag 13,5 muis aortaklepregio's, waarvan elk ongeveer 1 μg eiwit oplevert. Deze techniek zal van voordeel zijn voor het bestuderen van celsignaleringspadactivering en eiwitexpressieniveaus tijdens vroege embryonale muisklepontwikkeling.

Met behulp van deze voorbereiding techniek, waren we in staat om gefosforyleerd Smad- 1,5,8 (pSmad) op te sporen in enkele aortaklep regio van E13.5 embryo&#39;s. Zoals getoond in figuur 1A, het eiwit geïsoleerd uit zelfs een enkele klepgebied volstaat een zwakke band pSmad detecteren. Intensiteit van het signaal toeneemt evenredig met het aantal klepgebieden die worden samengevoegd. Belangrijk is dat de pSmad / β-actine-ratio blijft vrijwel constant over de verschillende steekproefomvang <st...

De analyse van eiwitexpressie in jonge embryonale muiskleppen is belemmerd door het beperkte beschikbare weefsel. Dit manuscript biedt een protocol voor het bereiden van eiwitten uit zich ontwikkelende embryonale muisklepgebieden voor western blot-analyse.

Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te isoleren en te extraheren uit embryonale hartkleppen. Dit wordt bereikt door eerst een embryo van een zwangere muis te isoleren. In de tweede stap wordt het hart uit het embryo gedissecteerd en in de laatste stap worden de hartkleppen verzameld.Het weefsel wordt gelyseerd en het resulterende eiwitmonster wordt voorbereid voor verdere analyse. Uiteindelijk kan western BLO-analyse worden gebruikt om eiwitexpressieniveaus te beoordelen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de dissectiestappen moeilijk te leren zijn vanwege de kleine compacte vorm van het zich ontwikkelende hart.Op de gewenste embryonale ontwikkelingsdag, gebruik 70% ethanol om de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til vervolgens de huid en spieren van de onderbuik op en weg van de inwendige organen, en snij de onderbuikholte open om toegang te krijgen tot de baarmoederhoorn. Houd vervolgens de baarmoederhals vast met een pincet en snijd voorzichtig de baarmoederhals tot aan de punten.Til vervolgens de baarmoederhoorn op en snijd eventueel bindweefsel door dat de hoorn op zijn plaats houdt en voltooi de verwijdering door de verbinding van de baarmoederhoorn met de uct door te snijden. Plaats de gedissecteerde baarmoederhoorn in een petrischaal met koud 0,1 molair tris-buffer en spoel indien nodig. Snijd vervolgens de baarmoederhoorn door.Open de lengte in om de embryozakken bloot te leggen. Om een embryo bloot te leggen, snijd een embryozak open op de overgang van de placenta en het embryo en snijd de navelstrengvaten door om het embryo te bevrijden. Plaats het gedissecteerde embryo in een tweede petrischaal met koud 0,1 molair tris-buffer en zet de eerste petrischaal met de resterende ongedisseceerde embryo's terug op ijs tot de volgende embryodissectie.Na decapitering, plaats het embryo op zijn rug en snijd de borstwand verticaal langs de zijkant van de ribbenkast nabij een voorpoot en horizontaal boven het diafragma. Om het hart te visualiseren, open de borstwand. Houd vervolgens het pincet hoog langs de grote vaten, til het hart op en snijd de vaten eronder door.Snijd vervolgens boven het pincet om het hart te bevrijden. Als de longvaten ongesneden blijven, verwijder de longen met het hart voordat u verdergaat met de embryonale stadia hierin beschreven, de longslagader is licht opake. Na identificatie van de slagader, snijd en verwijder deze boven het niveau van de klep.Snijd nu net onder de longklep, vermijd het ECD ventriculaire myocardium en verwijder overtollig tris-buffer uit de belangrijke regio. Voordat de klep in een einorbuis wordt geplaatst die twee microliters lysisbuffer bevat, zoals de longslagader, zal de aorta er licht opake uitzien. Na identificatie, snijd net onder de aortaklep.Vermijd opnieuw het trabeculate ventriculaire myocardium. Verwijder eventueel overtollig tri-oplossing en breng vervolgens de klep over naar de einorbuis met lysisbuffer en longweefsel. Nadat al het weefsel is verzameld, plaats de monsters onmiddellijk bij min 80 graden Celsius tot verder.Gebruik voor de eiwitextractie, ontdooi de verzamelde weefsels op ijs en pellet de monsters gedurende een minuut bij 13.100 Gs bij vier graden Celsius. Controleer het volume van het resulterende monster en gebruik lysisbuffer om het totale volume op 40 microliter te brengen. Voeg vervolgens vijf millimeter roestvrijstalen kralen toe om de monsters te verstoren en homogeniseer ze in een lyr gedurende twee tot vier minuten op 50 hertz, volgens de instructies van de fabrikant.Na homogenisatie, draai de buisjes kort en breng de monsters over naar nieuwe buisjes, waarbij het onoplosbare deeg wordt achtergelaten voor verdere experimentele analyse. Met behulp van deze bereidingstechniek kan gefosforyleerd smad 1 5 8 worden gedetecteerd in enkele aortaklepregio's van E 13.5 embryo's. Bijvoorbeeld, het eiwit dat is geïsoleerd uit zelfs een enkele klepregio is voldoende om een ​​zwakke p smad-band te detecteren, waarbij de signaalintensiteit evenredig toeneemt met het aantal klepregio's dat wordt gepoold.Belangrijk is dat de p smad beta-actineverhouding duidelijk constant blijft over de verschillende monstersgroottes vanwege de lage eiwitniveaus. Hetzelfde membraan kan niet worden verwijderd en opnieuw worden onderzocht voor totaal smad. Echter, een apart membraan dat totaal smad een en beta-actine vertoont, vertoont hetzelfde expressiepatroon. Deze klepregio's zijn bijna volledig vrij van verontreinigd ventriculaire myocardium door deze bereidingstechniek in combinatie met monsters van het rechter ventrikel, de marker voor ventriculaire myocardium, een NP is niet detecteerbaar in aortaklepregio's, terwijl deze marker gemakkelijk in het ventrikel wordt gedetecteerd.Verder is de marker voor ventriculair myocardium myosine lichte keten twee V ook gemakkelijk detecteerbaar in het ventrikelmonster, maar nauwelijks detecteerbaar in de aortaklepregio's, wat de nauwkeurigheid van de dissectie onderstreept. Na deze dissectie kunnen andere metingen zoals QPCR of RN AIC worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke downstream genen worden beïnvloed tijdens de verschillende ontwikkelingsstappen.

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel geeft een methode voor het isoleren en kweken van kwartels of kippen...

Isolatie en Cultuur van Aviaire Embryonic Valvulaire Progenitor Cellen

In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.

Isoleren Primaire Melanocyte-achtige cellen van de Muis van het Hart

In this video, we demonstrate the isolation of aortic valve interstitial cells from the heart of an adult mouse using a two-step collagenase procedure and their subsequent culture in low volume of growth media.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: An Enzymatic Method to Isolate and Culture VICs from Mouse Aortic Valve

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

De mogelijkheid om endotheelcellen van hartkleppen (VEC's) te isoleren, is van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van klepontwikkeling, onderhoud en ziekte.  Hier beschrijven we de isolatie van VEC's van embryonale en volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van FACS, wat studies mogelijk maakt om de bijdrage van VEC's in ontwikkelings- en ziekteprocessen te bepalen.

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze methode voor de reproduceerbare isolatie en langdurige kweek van volwassen muis-cardiomyocyten met een hoge opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid.

Isolatie, Cultuur en Transductie van Adult Mouse Cardiomyocytes

In vitro modellen van coronaire angiogenese kan worden gebruikt voor de ontdekking van de cellulaire en moleculaire mechanismen van coronaire angiogenese. In vitro explantculturen van sinusvenosus- en endocardiumweefsels laten een robuuste groei zien in reactie op VEGF-A en vertonen een vergelijkbaar patroon van COUP-TFII-expressie als in vivo.

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.

Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Leer eiwitisolatie uit embryonale muizenhartkleppen voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek. Deze methode maakt western blot-analyse mogelijk vanuit beperkt weefselmateriaal.

Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

Meer video's verkennen