Name: Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Leer myeloïde celgedrag visualiseren in darmtumoren van Apc Min/+ muizen met behulp van spinning disk confocale microscopie. Deze techniek biedt inzicht in tumor-immuniteit en mogelijke therapeutische strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Ying Yu bedanken voor Apc Min / + muizen genotypering. Deze studie werd ondersteund door fondsen van INSERM en subsidies (CA057621 en AI053194) van de National Institutes of Health.

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de procedures die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), UCSF goedgekeurd. Alle imaging experimenten waren niet-overleving procedures en de dieren werden gedood onmiddellijk na afloop van beeldopname. 1 Generatie van Muizen OPMERKING: Apc Min / + muizen, die een mutatie op de Apc-gen, ontwikkelen spontaan 50-100 adenomen in de dunne darm. <ol><li> Cross Apc Min / + muizen met de ACTB-ECFP lijn, die ECFP expressie onder de actine promoter, en verder met de c-fms-EGFP lijn, die EGFP expressie onder de c-fms, teneinde het myeloïde cellen te detecteren. Heterozygote dieren ACTB-ECFP en c-fms-EGFP worden gebruikt om fluorescentie te detecteren. </li><li> Gebruik muizen op 3-4 maanden oud op de foto duidelijk opspoorbaar adenomen. </li></ol> 2 Voorbereiding van de Materialen Voor de operatie LET OP: De gegevens van de microscoop set-up hebben eerder beschreven 6,7. <ol><li> Microscoop <ol><li> Zet de verwarming deken. Zet de argon laser voor 488 nm excitatie en het vaste stof 405 nm, 561 nm en 640 nm lasers. Zet de microscoop, de draaiende schijf besturingseenheid, de AOTF, de laser besturing en de camera-controller. </li><li> Open de microscoop sluiter, die de LED rood wordt. Zet de computer en de camera software. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Zorg ervoor dat het podium insert is schoon. Anders schoon met water en zeep en vervolgens droog. </li><li> Neem twee dekglaasjes en gebruiken lab tape om ze vast op de insert. Plaats het element op het podium en maak hem schoon met alcohol doekjes. </li><li> Met behulp van lab tape, hechten de verwarming deken aan de rechterkant van het podium. </li><li> Controleer de integriteit van het rubber membraan op de neus en vervang indien necessary. Positie en bevestig de neuskegel voor isofluraananesthesie levering aan het dier met behulp van gaas en lab tape. </li></ol></li><li> Isofluraananesthesie System <ol><li> Vul de isofluraan tank. </li><li> Schakel de stofzuiger en aan te passen tot 1,2 L / min. </li><li> Voeg gedestilleerd water aan de vernevelaar en sluit de vernevelaar aan de isofluraan systeem. </li><li> Schakel de zuurstof analyzer en sluit deze aan op de isofluraan systeem. Zet de zuurstoftank en ervoor zorgen dat de zuurstof analyser toont 100%. Pas de O 2 stroom tot 0,2 L / min. </li><li> Zet de stikstof tank en stel de stroom bij 0,8 l / min. Zorg ervoor dat de zuurstof analyser toont 21%. </li></ol></li><li> Voorbereiding van de operatie-instrumenten en het Platform <ol><li> Clean 2 paar dissectie pincet en een schaar met water en zeep. </li><li> Zet de hete kraal sterilisator en laat bereikt 250 ° C. Steriliseer de chirurgie gedurende 30 sec. Laat ze afkoelen. </li><li> Plaats een lab soaker op de operatie bank. </li><li> Gebruik een piepschuim deksel als een chirurgische platform. Dek af met een stuk van lab soaker. Bereid een tweede stuk van lab soaker te veranderen na het scheren van de muis. </li><li> Plaats de neuskegel met de lijn van de anesthesie op het overdekte piepschuim deksel, en bevestig deze aan de piepschuim deksel (niet op het lab soaker) met wat tape en gebruik twee naalden aan beide zijden van de neus tot het op zijn plaats te houden. </li><li> Assembleren betadine, alcohol doekjes, steriel gaas, superlijm, objectglaasjes, elektrisch scheerapparaat, en 4 stuks van lab tape. </li></ol></li></ol> 3 Bereiding van injecties <ol><li> Onder de motorkap bereidt een insulinespuit (28 G x ½ cm) met 7 pl stock AF647-geconjugeerd Ly-6G (GR1) antilichaam (1 mg / ml) in 100 pl van 2.000 kDa rhodamine-dextran (4 mg / ml ) voor de retro-orbitale injectie. Retro-orbitale injectie wordt aanbevolen in Apc Min / + muizen sinds bloedarmoede die zich ontwikkelt in deze dieren maakt de staart aderen difficuHet detecteren door de huid. </li><li> Bereid een tweede insuline spuit met 1 mg / kg atropine verdund in 150 ul PBS subcutaan (sc) injectie voor beeldvorming ter peristaltische bewegingen van de darm dempen. </li></ol> 4 Voorbereiding van de darm voor Imaging <ol><li> Controleer of de verdoving lijn naar de inductie kamer is geopend, en de lijnen naar de operatietafel en microscoop gesloten. </li><li> Breng het dier naar de anesthesie kamer. Sluit de anesthesie kamer en zet de isofluraan tot 4% (met 21% O 2). </li><li> Wanneer de muis ademt diep en langzaam (na 5-6 min), over te dragen aan de chirurgische fase op zijn flank en injecteer de Gr1 antilichaam oplossing en / of dextran oplossing retro-orbitaal. </li><li> Open de anesthesie regel gekoppeld aan de chirurgische platform. Sluit de lijn naar de anesthesie kamer en zet de muis op de rug met de neus in de anesthesie kegel. </li><li> Verminder de isofluraanconcentratie van 4% tot 2,5%. </li><li> Controleer of de muis goed is verdoofd door knijpen haar voetzool en het testen van de cornea reflex. </li><li> Voeg oogheelkundige smeren zalf op de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose. </li><li> Bevestig de ledematen van de muis om de chirurgische fase door het toevoegen lab tape. </li><li> Verwijder het haar van het ventrale oppervlak met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Verwijder ook het haar van de linker achterpoot van de oximeter voor overname te positioneren. Verwijder het lab soaker van de chirurgische podium en te vervangen door een schone om haar te voorkomen. </li><li> Ontsmet het ventrale oppervlak met alcohol doekjes en betadine. </li><li> Injecteer de atropine-oplossing (vanaf 3.2) v in een flank van de muis. </li><li> Wordt 1 cm ventrale middellijn incisie door de huid en het buikvlies met schaar en een pincet. Trek voorzichtig 3-4 cm van de darm en identificeren van een of meerdere tumoren op de foto. </li><li> Neem een ​​glas microscope glijbaan en positie een lus van de darm op het met een tumor op de top. </li><li> Voeg wat superlijm om enkele plaatsen langs de darm om het te hechten aan de dia. Wacht een min voor de lijm drogen. Gebruik een marker van een lijn op de dia wijst naar de tumor om de lokalisatie van de confocale vergemakkelijken. </li></ol> 5 Plaatsing van de muis in het werkgebied en Voorbereiding voor Image Acquisition <ol><li> Verwijder lab tape van de ledematen. </li><li> Open de anesthesie regel de microscoop podium en die dicht bij de chirurgische platform. </li><li> Breng de muis voorzichtig naar de microscoop podium met zijn buikzijde naar beneden en haar neus in de neuskegel. Bevestig de anesthesie lijn met wat lab tape. </li><li> Opnieuw positioneren van de muis en / of de schuif om de darm in het centrum van een van het deksel gleed ramen. Zachtjes tape van de glijbaan af met lab tape. </li><li> Bevestig de oximetersonde links onderdeel van de muisvolgt haar hart en de ademhaling en de arteriële zuurstofverzadiging niveaus. </li><li> Bedek de muis met de verwarming deken om onderkoeling te voorkomen. </li><li> Verlaag de isofluraan concentratie van 2,5% naar 1-1,5% voor de beeldvorming. </li></ol> 6 Overname van afbeeldingen met behulp van μManager Software <ol><li> Verhoog CSUX snelheid tot 2.500 toeren om de beeldkwaliteit in de configuratie-instellingen te verbeteren. </li><li> Gebruik het menu Doelstelling dropdown 10x 0,5 NA of 20X 0,75 NA Fluar lens objectief kiezen. </li><li> Kies de laser 405 nm van Color dropdown menu. </li><li> Klik op live en pas de scherpstelling aan met de microscoop. </li><li> Klik op Automatisch om de maximale en minimale pixel intensiteiten van de beeldweergave op basis van de extreme pixelwaarden in het beeld automatisch aan te passen. Een histogram van het beeld scherm van pixel intensiteiten wordt weergegeven in de grafiek in het onderste gedeelte van het hoofdvenster. </li><li> Pas de belichting camera in het venster Piper Configuratiescherm doorhet veranderen van het aantal klokken (Een klok is 33.333 msec). </li><li> Als het signaal te licht met de laagste blootstelling verminderen laserintensiteit de microscoop besturingseenheid. </li><li> Controleer de intensiteit van het signaal voor 488 nm, 561 nm en 640 nm laser lijnen. Pas laserintensiteit met eigen controle-eenheid van de laser (488 nm en 561 nm) of de microscoop regeleenheid. </li><li> In het venster Multi D Acquisitie, vink het vakje Time punten en typ in het aantal tijdstippen en het gewenste tijdsinterval. </li><li> Vink het vakje aan Z-stacks, kies &quot;relatieve Z&quot; en definieer Z-start en Z-end ten opzichte van de huidige positie. OPMERKING: Voor 10X of 20X objectief, beginnen met 3 Z vliegtuigen, 8 micrometer of 4 micrometer respectievelijk uit elkaar. </li><li> Vink het vakje Meerdere posities (XY) voor beeldvorming van meerdere locaties, klik op Bewerken lijst positie, markeer 4 tot 6 verschillende posities. </li><li> Vink het vakje aan kanalen en zenders uit Nieuw toevoegen en selecteer lasers lijnen uit het dropdown-menu en type in belichting voor elk kanaal (in veelvouden van 33.333 msec). </li><li> Controleer beelden opslaan in het venster &quot;Multi D overname&quot;. </li><li> Selecteer een map en alle verkregen beelden worden automatisch opgeslagen in de map met de naam voorvoegsel gegeven. Opmerking: Elke continue verwerving wordt over een aparte submap als afzonderlijke tiff files voor elke Z segment in elke kleur op elk tijdstip worden opgeslagen. </li><li> Spaar alle instellingen door te klikken op Instellingen opslaan in het venster Multi D Acquisition. </li><li> Klik verwerven in de Multi-dimensionale Acquisitie venster om acquisitie te beginnen. </li><li> Als de oximetersonde niet wordt gebruikt of niet meer goed werkt (als puls is niet stabiel of moeilijk op te sporen), controleer dan eerst of de anesthesie om de 15 minuten tijdens de beeldvorming procedure door te knijpen de voetzool en het controleren van de cornea reflex. Stel de anesthesie of de muis reageert op deze stimuli. </li><li> Na de overname, euthanaseren de muis door het verhogen van de isofluraan concentrantsoen tot 5%. Als er geen ademhalingsbewegingen zijn detecteerbaar, verwijdert u de muis van het podium en het uitvoeren van een cervicale dislocatie. </li></ol> 7 Analyse van de beelden met behulp van Imaris Software <ol><li> Conversie naar bestanden (aanvullende figuur 1A) ims <ol><li> Open de camera software, klik dan op Bestand vervolgens Batch Converter. </li><li> Klik op Bestanden toevoegen en selecteer het eerste bestand van de eerste positie. Herhaal dit voor elke positie. </li><li> Voor elk bestand geupload, klik op Instellingen en controleer of de instellingen &quot;t&quot; voor Time, &quot;c&quot; voor kanalen en &quot;z&quot; voor Z-stapels lijken in die volgorde. </li><li> Behalve in de gewenste map. Blader en maak een nieuw bestand geconverteerd. </li><li> Klik op Set voor iedereen en Start. </li></ol></li><li> Aanpassingen (aanvullende figuur 1B) <ol><li> Ga naar de specifieke Converted map en open het eerste bestand. </li><li> In venster Weergave aanpassen, stel de achtergrondcutoff signaal door aanpassing van de Min nummer voor elk kanaal indien nodig. </li><li> Indien nodig past u de intensiteit van het signaal door het wijzigen van het Max nummer (hoe lager het Max getal, hoe hoger de intensiteit van het signaal). OPMERKING: Aanpassingen van de signaalintensiteit / contrast staat het hoogtepunt van een cel gedrag of een compartiment om een ​​mooier visualisatie. Het maakt niet het resultaat zelf te veranderen. </li><li> Klik op Eigenschappen bewerken en Beeld. </li><li> Verander de x, y en z waarden (een 10X objectief, x en y = 0,712, z = 8 urn, een 20X objectief: x en y = 0,36, z = 4 micrometer). </li><li> Klik op Alle gelijke afstand tot tijd punten aan te passen. Voeg de startdatum en starttijd van de overname. Voeg de einddatum en eindtijd van de acquisitie (aanvullende figuur 1C). </li><li> Klik op de knop Afspelen om de film te bekijken. </li><li> Klik op Bewerken en Verwijderen tijdstippen om wazige beelden te wissen. </li><li> Om twee afzonderlijke overnames together in een film, ga naar het laatste tijdstip van de eerste film en klik op Bewerken&gt; Toevoegen tijdstippen naar het tweede bestand toe te voegen. </li></ol></li><li> Het opslaan als een film (aanvullende figuur 1D) <ol><li> Klik op Record, kies de mov extensie en een compressiefactor van 0. </li><li> Klik op Opslaan. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment%3A+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li>
<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li>
<li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li>
<li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088(2013).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li>
<li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li>
<li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation%2C+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li>
<li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+%28Smad4%29+and+Apc+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze paper wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor spinning disk confocale beeldvorming van myeloïde cel dynamiek in darmtumoren gedurende enkele uren in een levend dier, belicht vanuit de serosal kant van de darm. Om ontsteking te voorkomen en optimale fysiologische voorwaarden, beeldvorming van de darm moet worden gedaan op de intacte orgaan. Echter, weergave van de serosale zijde van de darm is een uitdaging, omdat het licht moet door verschillende weefsellagen zoals gladde sp...

Overweldigend bewijs blijkt nu dat de tumor micro-omgeving, bestaande uit heterogene celpopulaties, waaronder fibroblasten, endotheelcellen, immune en inflammatoire cellen, extracellulaire matrix en oplosbare factoren, speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van vaste tumoren door tot bijna alle kenmerken van kanker 1. Inderdaad, bij tumorprogressie, er voortdurend dynamische interacties tussen getransformeerde kankercellen en stromale cellen die zich ontwikkelen tot een micro gunstig maligniteit 2 genereren. Onder de immune cellen die de tumor micro infiltreren, myeloïde cellen zijn de meest voorkomende 3. Bestaande uit tumor-geassocieerde macrofagen (TAM), myeloide suppressor cellen (MDSCs), dendritische cellen (DC) en neutrofielen (PMN), myeloïde cellen worden gerekruteerd uit beenmerg en geleidelijk infiltreren tumoren vrijgeven cytokines, groeifactoren en proteasen die kan bevorderentumorgroei en verspreiding 4. De overspraak tussen kankercellen en myeloïde cellen is complex en dynamisch. Dus het begrip van de aard van hun interacties cruciaal voor het bepalen waarom deze cellen te promoten kankerprogressie plaats van deelnemen aan een anti-tumor immuunreactie, en kunnen helpen om nieuwe targets te beheersen vinden. Directe observatie door opklaren geeft informatie over mobiele dynamiek binnen de weefsels van levende muizen 5. Een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale systeem werd ontworpen om stromale cellen te bestuderen binnen borsttumoren 6. Deze benadering maakt langdurige continue beeldvorming en bevat diverse voordelen zoals (a) snelle beelden overname bewegingsartefacten minimaliseren, (b) langdurige anaesthesie, (c) vier kleuren overname verschillende celtypen volgen, (d) fluorescentielabelling verschillende tumorale componenten, en (e) observatie van verschillende tumor micro-omgevingen within dezelfde muis muis om de muis variabiliteit 7-9 voorkomen. Met deze technologie zijn andere cel gedrag vastgesteld in de mammaire tumor virus (MMTV)-promotor aangedreven polyoma midden T oncogen (PyMT) model dat geleidelijk van tumorigenese weergeeft. Regulatoire T-lymfocyten (Tregs, gevisualiseerd door de Foxp3 EGFP transgen) migreren bij voorkeur in de nabijheid van de bloedvaten terwijl DCS (CD11c-DTR-EGFP),-carcinoom geassocieerd fibroblasten (FSP1 + / + -EGFP) en myeloïde cellen (c-fms -EGFP) vertonen een hogere beweeglijkheid op de tumor periferie dan binnen de tumor. In de toestand van acute systemische hypoxie, cellen gemigreerd anders: Tregs stop migreren in tegenstelling tot myeloïde cellen die blijven bewegen 6. Bovendien, in hetzelfde muismodel, is aangetoond dat doxorubicine gevoeligheid verandert met tumor stadium is geneesmiddelverdeling verband met drugs respons en doxorubicinebehandeling verkrijgt men CCR2-afhankelijke rekrutering van myeloïde cellen tumoren. Aldus kunnen levende beeldvorming worden gebruikt om inzicht in drug reacties in situ en de biologie van chemoresistance 10,11 verkrijgen. Adenomateuze polyposis coli (APC) genmutaties vaak voorkomen in humane colorectale adenomen en carcinomen 12 en mutatie van een enkele kopie van het Apc-gen resultaten in familiaire adenomateuze polyposis (FAP), die een uitzonderlijk hoog risico op colonkanker 13 verleent. De muis stam Apc Min / + draagt ​​een truncatie mutatie op codon 850 van het APC-gen en spontaan ontwikkelt meerdere darmadenomen over de dunne darm 14-16. Langdurige intravitale beeldvorming van de darm is uitdagend door de invasiviteit van de procedure, aangezien het openen van de buikholte noodzakelijk om toegang tot de darm. Korte termijn live-imaging studies zijn eerder gepubliceerd op gezonde darm 17,18, maar langdurige directe waarneming van darmtumoren is niet gemeld. Een chirurgische ingreep is ontwikkeld en verfijnd om tumoren te visualiseren door het serosale oppervlak van de darm via de intravitale draaiende schijf microscopiesysteem voorheen het beeld borsttumoren 6,10. In dit document wordt een protocol beschreven waarmee men het gedrag van myeloïde cellen in de tumoren in de dunne darm te volgen met Apc Min / + muizen.

<table><tbody><tr><td>ApcMin/+ muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2.000 kDa Dextran, rood fluorescerend</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Stikstof</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF celkweekfaciliteit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline buffer</td><td>UCSF celkweekfaciliteit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis Ly-6G (GR1) antilichaam AF647</td><td>UCSF Monoklonaal antilichaamkern</td><td></td><td>Voorraad 1 mg/ml. Gebruik bij 7 &mu;g/muis</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Gebruik bij 1 mg/kg muis</td></tr><tr><td>Alcoholdoekjes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 inch insulinespuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium dekglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsdeken</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heetkralen sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Schakelaar AANP 30 min voor gebruik</td></tr><tr><td>Wattenstaafjes met katoen 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Verdovingssysteem</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage-inzet</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis Ox oximeter, software en sensoren</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Vernevelder</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal scankop</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time beeldvorming van myeloïde cellen dynamiek in apc min / + intestinale tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloïde cellen zijn de meest voorkomende immune cellen in tumoren en is aangetoond tumorprogressie promoten. Moderne intravitale beeldvormende technieken maken de observatie van live-cellulaire gedrag in het orgel, maar kan een uitdaging in sommige vormen van kanker als gevolg van organen en tumor toegankelijkheid zoals darm. Directe waarneming van darmtumoren is niet eerder gerapporteerd. Een hier beschreven chirurgische ingreep maakt directe observatie van myeloïde cel dynamiek binnen de darmtumoren in levende muizen met behulp van transgene fluorescerende reporter muizen en injecteerbare tracers of antilichamen. Voor dit doel, heeft een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale microscoop die op lange termijn continue beeldvorming met snelle beeldopname maakt gebruikt. Apc Min / + muizen die meerdere adenomen in de dunne darm te ontwikkelen zijn gekruist met c-fms-EGFP muizen myeloïde cellen te visualiseren en ACTB-ECFP muizenintestinale epitheelcellen van de crypten visualiseren. Procedures voor de etikettering verschillende tumor componenten, zoals bloedvaten en neutrofielen, en de procedure voor het positioneren van de tumor beeldvorming via serosale oppervlak beschreven. Time-lapse films samengesteld uit verscheidene uren beeldvorming kan de analyse van myeloïde celgedrag in situ in de intestinale micro.

Via draaiende schijf confocale microscopie, niet-tumorale en tumorweefsels in de dunne darm van Apc Min / +; ACTB-ECFP c-fms-ECFP muizen kunnen worden gevisualiseerd van het serosale oppervlak. Na de belichting, wordt de camera-software gebruikt voor het analyseren en aanpassen van de acquisitie (aanvullende figuur 1). Na intraveneuze (iv) injectie van fluorescent 2000 kDa dextran-rhodamine en Ly-6G 647 geconjugeerd antilichaam, bloedvaten en PMN respectievelijk kan worden g...

Door het gebruik van transgene reportermuizen en injecteerbare fluorescerende labels, maakt langdurige intravitale spinning disk confocale microscopie directe visualisatie mogelijk van het gedrag van myeloïde cellen in darmadnomen in het ApcMin/+ colorectaal kankermodel.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Het algemene doel van deze procedure is om de dynamica van myeloide cellen binnen de darmtumoren van een levend dier te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst fluorescente moleculen en atropine te injecteren in een PC min muis. In de tweede stap wordt de darm voorbereid voor beeldvorming en wordt de muis op het microscoopplatform geplaatst.In de laatste stap worden beelden van de tumor binnen het levende dier verkregen, uiteindelijk spindisc confocale. Microscopie kan worden gebruikt om het gedrag van myeloide cellen binnen de tumoren van levende PC min muizen gedurende enkele uren te visualiseren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het kankerveld te beantwoorden, zoals wat is de rol van menselijke cellen bij colorectale kanker?Begin door twee dekglasjes met lab tape vast te zetten op de stage-inzet van het microscoopbeeldvormingsplatform. Plaats vervolgens de inzet op de stage en maak deze schoon met alcoholdoekjes. Zet vervolgens de hete parelsterilisator op 250 graden Celsius en steriliseer de chirurgische instrumenten gedurende 30 seconden terwijl de gereedschappen afkoelen.Plaats dit schuimrubberen deksel tussen twee lab-soakers op de operatiebank. Wanneer de muis diep en langzaam ademt, plaats het dier dan op zijn zij op de chirurgische stage en retroorbitaal. Injecteer de DExT-streng, staaf Domine en GR één antilichaamoplossing.Na de injectie draai de muis op zijn rug met zijn neus in de anesthesie-kegel en gebruik een elektrische scheerapparaat om het haar van de ventrale oppervlakte en de linkerachterpoot van het dier te verwijderen. Wanneer het haar is verwijderd, plaats een nieuw lab-soaker op de chirurgische stage om haarbesmetting te voorkomen en desinfecteer vervolgens de ventrale oppervlakte van het dier met alcoholdoekjes en Betadine. Injecteer vervolgens subcutaan de atropine-oplossing in één flank van de muis en gebruik vervolgens een schaar en een pincet om een centimeter lange ventrale middenlijnsnede door de huid en het peritoneum te maken.Trek voorzichtig drie tot vier centimeter darm naar buiten en identificeer een of meerdere tumoren om te beeldvormen. Plaats vervolgens de lus van de darm met de tumor van belang op een glazen microscoopgleuf. Plaats een paar druppels superlijm langs de darm om deze aan het glasplaatje te bevestigen nadat de lijm een minuut is opgedroogd. Gebruik een marker om een lijn op het glasplaatje te tekenen die naar de tumor wijst om de lokalisatie ervan tijdens de beeldvorming te vergemakkelijken.Breng nu de muis voorzichtig over op de microscoopstage met zijn ventrale zij naar beneden en zijn neus in de neuskoker. Bevestig de anesthesielijn met lab tape en plaats vervolgens de opstelling opnieuw zodat de darm in het midden van een van de dekglasjes-vensters staat. Plak het dia voorzichtig vast en bevestig de oximeter-sonde aan de linkerpoot van de muis om zijn hart- en ademhalingssnelheid en de arteriële zuurstofverzadigingsniveaus te volgen.Bedek vervolgens de muis met de verwarmingsdeken om hypothermie te voorkomen en verlaag de ISO-fluorineconcentratie voor beeldvorming. Klik ten slotte in het meerdimensionale verwervingsvenster op verkrijgen om de verwerving te starten. Wanneer de verwerving is voltooid, wordt de film opgenomen en opgeslagen met behulp van een Mars-software.Door gebruik te maken van spindisc confocale microscopie kunnen niet-tumor en tumoraal weefsel worden gevisualiseerd. In de dunne darm van een PC min muis kan vanaf het serose oppervlak worden gevisualiseerd na intraveneuze injectie van fluorescente dextran rodine en een lymfocyt antigeen zes complex locus G 6 47 geconjugeerd antilichaam, respectievelijk kunnen bloedvaten en polymorfonucleaire cellen worden gedetecteerd. PIs-plekken die aggregaties van lymfatisch weefsel zijn en vol van myeloide cellen, kunnen ook gemakkelijk worden waargenomen.De Crips van de dunne darm zijn omgeven door bloedvaten en myeloide cellen. Tumoraal weefsel is vaak meer gevasculariseerd en meer geïnfiltreerd door myeloide cellen, en de structuur van de Crips is minder goed georganiseerd, afhankelijk van de grootte van de tumor. De expressie van actine ECFP door de gladde spierlaag kan soms een scherp focus van het darmepitheel moeilijk maken, zoals te zien is op deze afbeelding, kan de dynamica van myeloide cellen in tumoren real-time worden gevolgd gedurende enkele uren, zoals gedemonstreerd in deze film, terwijl G een positieve neutrofielen circuleren in bloedvaten en de weefsels patrouilleren.Andere myeloide cellen, meestal macrofagen, omringen de Crips en zijn minder modaal. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de dynamica van myeloide cellen binnen darmtumoren in levende dieren kunt visualiseren.

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We tonen de methode voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de milt met behulp van GFP transgene malariaparasieten en de kwantificering van de parasiet de mobiliteit en de bloedstroom binnen dit orgaan.

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

This video describes the imaging of resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Real-Time Analysis of Resident T-cell Migration in Different Tumor Regions Using Confocal Microscopy

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Hier presenteren we een robuuste en gedetailleerde methode van microtubulus dynamica analyse in cellen gesynchroniseerd in tijdens met behulp van Live-cel spinnen schijf confocale microscopie en MATLAB gebaseerde beeldverwerking.

Meting van de microtubulus dynamiek door draaiende schijf microscopie in monopolaire mitotische spindels

We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.

Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen

Het protocol presenteert een nieuw hulpmiddel om intravitale beeldvorming te vereenvoudigen met behulp van omgekeerde confocale microscopie.

Gestroomlijnde intravitale beeldvormingsbenadering voor langetermijnmonitoring van de dynamiek van epitheelweefsel op een omgekeerde confocale microscoop

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Leer myeloïde celgedrag visualiseren in darmtumoren van Apc Min/+ muizen met behulp van spinning disk confocale microscopie. Deze techniek biedt inzicht in tumor-immuniteit en mogelijke therapeutische strategieën.

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc Min / + Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie (Video) | JoVE Journal

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in Apc^{Min / +} Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Meer video's verkennen