Name: Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer hoe je reticulospinale axonen van lampreien isoleert om calciumstromen te meten aan individuele presynaptische terminale. Deze methode biedt directe toegang tot het release face membraan voor elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is ondersteund door NINDS, RO1NS52699 en MH84874 aan SA. 
We willen Dr. Dave Featherstone (Afdeling Biologische Wetenschappen, Universiteit van Illinois in Chicago) bedanken voor het verstrekken van de hechtlijm die we gebruikten in het immunohistochemisch werk. We danken Michael Alpert voor zijn commentaren en het corrigeren van het manuscript.

1 Bereiding van poly-D-lysine hydrobromide <ol><li> Bereid 1 mg / ml poly-D-lysine hydrobromide in 0,1 M boraatbuffer (pH 8,5). </li><li> Aliquot en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 2 Poly-lysine Coating Coverslips Opmerking: Voer alle reiniging en coating stappen in een laminaire stroming kamer. <ol><li> Plaats dekglaasjes in een petrischaal met 1 N zoutzuur (HCl) gedurende 2 uur. </li><li> Zuig alle HCl en spoel af met 70% ethanol (EtOH) 2-3x. </li><li> Laat in 70% EtOH gedurende 1 uur. </li><li> Zuig al 70% EtOH en spoel af met 100% EtOH 2-3x. </li><li> Laat in 100% EtOH gedurende 2 uur. Aspireren alle EtOH. </li><li> Dep droog met een papieren filter en de lucht drogen voor een paar seconden. </li><li> Plaats O / N in 1 mg / ml poly-lysine oplossing. </li><li> Rinse coverslips volgende dag met Millipore water 4-5x. </li><li> Droging polylysine gecoate dekglaasjes op glas rollen in een schone petrischaal. </li><li> Voor immunohistochemistry Gebruik 35 x 10 mm petrischaal deksels. Bereid Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) omzoomd maaltijden door gieten PDMS (elastomeer en verharder 10: 1 in gewicht) in de schaal tot een dikte van 0,3 cm en staan ​​bij 30 ° CO / N te stellen. Zodra dit is ingesteld, snijd een 2 cm bij 1 cm inzet in het PDMS. Schoon en de vacht van de inzet met poly-lysine volgens dezelfde stappen als hierboven genoemd voor dekglaasjes. </li><li> Store poly-lysine gecoate dekglaasjes en gerechten vallen in de laminaire stroming kamer tot gebruik (tot 2 weken, maar bereiken het beste lijm resultaten door periodiek het voorbereiden om de 3-4 dagen). </li><li> Bereid een PDMS blok, het ruggenmerg pin in de vibrerende weefsel snijmachine. Mix Elastomeer A en B Elastomeer 1: 1 gew. Giet in een 100 x 15 mm petrischaaltje laten O / N ingesteld op 30 ° C. Snijd een rechthoekig stuk van de PMDS en lijm het aan het snijden bodemplaat met epoxy lijm. Laat de lijm aan de vaststelling van de PDMS op zijn plaats zetten en snijd meerdere dunne delen van het oppervlak van een platte verkrijgenoppervlak om het weefsel op de pin. </li></ol> 3 Acute Dissociatie van Lamprey Spinal Cord naar Geïsoleerde Reticulospinal Axonen Opbrengst <ol><li> Verdoven van een ammoecoete of volwassene lamprei (Petromyzon marinus) met tricaïne methaansulfonaat (MS-222, 100 mg / L). Voeg verdoving in het water, in een plastic beker met een deksel afgedekt met het lamprey worden opgeofferd. </li><li> Onthoofden prikken in koude (4 ° C) Ringer&#39;s oplossing met de volgende samenstelling (in mM): 130 NaCl, 2,1 KCI, 2,6 CaCl2, 1,8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolariteit 270 mOsm) en verwijder body muur spieren dorsale oppervlak van het ruggenmerg bloot. </li><li> Verwijder meninx primitiva uit het dorsale oppervlak van het ruggenmerg met behulp van fijne tang. Verwijder niet ventrale meninx primitiva in dit stadium. </li><li> Snijd het ruggenmerg in 1 cm lange stukken. </li><li> Speld een ruggenmerg stuk met behulp van fijne insect pinnen, dorsale zijde naar boven, op een PDMS bekleed snijden basis plate (zie 2.12) in een trillende tissue slicer cupje met ijskoude Ringer&#39;s oplossing. </li><li> Verwijder een centraal gedeelte van de dorsale kolom van het ruggenmerg door het snijden langs de rostro-caudale as met het blad, met achterlating intact dorsale kolom secties in de rostrale en caudale einden om als handgrepen tijdens het dissociatieproces Figuur 2a en Figuur 2b. Gebruik langzaamste stand aan dat snijden en een diepte-instelling dat alleen de dorsale kolom verlaten van de onderliggende reticulospinal axon kolom onbeschadigd Figuur 2b verwijdert toelaat. </li><li> Incubeer gesneden ruggenmerg stukjes bij kamertemperatuur gedurende 45 min in een cocktail van 1 mg / ml protease (Type XIV van Streptomyces griseus) en 1 mg / ml collagenase bereid (type IA van Clostridium histolyticum) in Ringer&#39;s oplossing (aangepast van El Manira &amp; Bussières , 1997 17). </li><li> Pin-enzymen behandelde ruggenmerg stukken met behulp van fijne pennen in een PDMS gevoerde petrischaal containing koud (4 ° C) oplossing van Ringer. </li><li> Verwijder ventrale meninx primitiva met fijne tang. </li><li> Knip laterale stukken ruggenmerg met een scalpel in het midden van het gesneden dorsale gedeelte waardoor de centrale kolom van reticulospinal axonen intact in het ruggenmerg Figuur 2d. </li><li> Breng een druppel immersie olie op de lens. </li><li> Plaats de poly-lysine gecoate dekglaasje (Figuur 3a, bovenstuk, rode rechthoek) in de gleuf van het opname kamer Figuur 3 en vacuüm smeer alle randen (ruimte tussen rode en blauwe rechthoeken in figuur 3a, om een afdichting te vergemakkelijken. Screw de top op zijn plaats. Plaats de kamer in de inzet van de opname rig. </li><li> Voeg Ringer-oplossing in de opname kamer met behulp van een Pasteur pipet. </li><li> Sluit de uitstroom buis van de druk fles met antivries oplossing voor de thermo-elektrische koeling apparaat ingang buizen. Sluit de output slang van de thermo-elektrische koelinrichting aan het invoereinde van de uitwendige koelmantel en de uitgang naar het reservoir figuur 3b. </li><li> Leg een stukje van het ruggenmerg op een moment in de opname kamer en voorzichtig te scheiden van het ruggenmerg onderhoud ervan langs het dekglaasje te allen tijde het gebruik van Teflon coating tang totdat axonen zijn geïsoleerde figuur 2e en figuur 2f. </li><li> Breng het opnamesysteem temperatuur tot 10 ° C door het passeren van de druk (stikstofgas wordt geduwd in de fles) antivriesoplossing (door verplaatsing), via de thermo koelinrichting, door de buitenste koelmantel van de opname kamer Figuur 3b. </li><li> Laat axonen te herstellen gedurende 1 uur na dissociatie bij 10 ° C. </li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figuur 2 Schematische beschrijving van dissociatie protocol voor isolatie van reticulospinal axonen. (A) Verwijdering van dorsale kolom. De pijl geeft de richting van snijden van het weefsel. De dorsale hoorns gekenmerkt door het alfabet D (rode tekstkleur), terwijl de ventrale hoorn van het alfabet V (rode tekstkleur). (B) Dorsale kolom verwijderd in het centrale gedeelte van het ruggenmerg blootstellen van de reticulospinal axonen (groene lijnen ). De ventrale hoornen, die intact blijven na het snijproces, worden gekenmerkt door het alfabet V (rode tekstkleur). (C) 45 min behandeling met protease en collagenase enzymen cocktail (1 mg / ml). (D) snijden laterale stukken van het ruggenmerg; aangeeft positie, richting en omvang van laterale snede. (e) mechanische dissociatie van ruggenmerg. Pijlen geven de positie van de tang en de richting van de scheiding van kracht tijdens dissociatie. (F) Franstalve voorbeeld van gedistantieerd reticulospinal axon voorbereiding. Groene pijlen markeren gebieden van acuut los reticulospinal axonen zonder postsynaptische processen. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3 Schematische voorstelling van de opname kamer voor elektrofysiologische experimenten. Afmetingen zijn uitgedrukt in inches. Rode rechthoek getoond in basepiece diagram (a) geeft positionering van dekglaasje in het dekglaasje groef in de basepiece. Het gebied tussen de rode en blauwe rechthoek, in de basepiece diagram (a) is waar de hoogvacuüm vet toegepast. (B) toont de samengestelde opname kamer. 4 etikettering en identificatie van Presynaptische Terminals met FM 1-43 <ol><li> Label presynaptische terminals, door het opnemen van FM 1-43 in vesicles tijdens synaptische exo-endocytose tijdens hoge K + depolarisatie. Perfuseren preparaat met 5 uM FM 1-43 (in 5 ml Ringer&#39;s oplossing die 30 mM KCl). </li><li> Perfuseren preparaat met 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml Ringer&#39;s oplossing) om overtollig FM kleurstof) 18. </li><li> Perfuse voorbereiding met Ringer-oplossing gedurende 15 minuten aan een Remant kleurstof en de Advasep afgespoeld. </li><li> Afbeelding 100 X olie immersie objectief (NA 1,25) op een omgekeerde fluorescentie microscoop, in combinatie met een digitale CCD camera en beeld acquisitie software micromanager, middels standaard fluorescentie beeldvorming protocollen. </li><li> Identificeer fluorescent gelabelde presynaptische terminals te richten voor het opnemen van figuur 4c en figuur 4d. </li></ol> 5 immunohistochemie van Geïsoleerde Reticulospinal Axonen <ol><li> Vul gerecht inzet (Protocol paragraaf 2.10.) Met tweewaardige-ion (Ca 2 + en Mg 2 +) gratisRinger&#39;s oplossing. </li><li> Fabriceren patch pipetten in een P-87 micropipet trekker. Plaats een kleine hoeveelheid lijm hechting aan een einde van de poly-lysine bijvoegsel met een patch pipet (1,5 mm glas buitendiameter) en aanzuigleiding (met een siliconenslang 0,89 mm binnendiameter met een micropipet tip aan het zuigeinde). </li><li> Voeren dissociaties volgens dezelfde procedure als genoemd in dienst Protocol 3 Figuur 2. Plaats het ene uiteinde van het ruggenmerg op de hechting lijm en druk deze voorzichtig met een tang om het sterk hechten aan het oppervlak. Breng een druppel lijm hechting aan het andere uiteinde van de inzet en voorzichtig rekken het ruggenmerg tot axonen gedissocieerd en hechten de vrije ruggenmerg uiteinde door voorzichtig te slepen via hechting lijm. Vast te zetten door zachtjes te drukken met de tang. </li><li> Exchange tweewaardige bevrijden Ringer-oplossing met regelmatige Ringer-oplossing door perfusie. </li><li> Laat axonen om te herstellen voor 20 min na dissociation bij 10 ° C. </li><li> Fix gedissocieerd axons in 4% paraformaldehyde (PFA) {bereid in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2.7, Na2HPO 4 10, KH 2PO 4 1,8, pH 7,4) gedurende 20 min}. Filter PFA oplossing vóór gebruik door passage door een 0,2 uM spuitfilter. </li><li> Spoel de PFA door perfunderen 0,1 M glycine (in PBS) gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer in 0,1% Triton-X (in PBS) gedurende 10 minuten. </li><li> Was te doorstromen PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Blok met 5% niet-vette melk (in PBS) gedurende 6 uur bij 4 ° C. </li><li> Opslaan in primair antilichaam aan VACK plaats (1: 200 verdunning in PBS) en incubeer gedurende 20 uur bij 4 ° C. </li><li> Was te doorstromen PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Blok met 5% niet-vette melk (in PBS) gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Opslaan in secundair antilichaam (1: 400 verdunning in PBS) en incubeer in het donker gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Was te doorstromen met PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Blokkeren met 1% Bovine Serum Albumin (in PBS) gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg in Alexa Fluor 488 phalloidin (5 eenheden / ul werken concentratie; voorraad voorbereid in methanol 200 Eenheden / ml). </li><li> Was te doorstromen met PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Beeld met behulp van 100X water immersie lens op confocale microscoop. </li></ol> 6 elektrofysiologische opname <ol><li> Fabriceren aluminosilicaatglas patch pipetten (pipet weerstand 2-5 MQ) in een P-87 micropipet trekker. Ontwerp patch pipet zodanig dat pipettip omvat hele presynaptische terminal diameter. </li><li> PDMS coat patch pipetten door dompelen van de patch pipet onder 50-60 psi druk in PDMS 23 (voeg een siliconenslang, 0,89 mm binnendiameter, verbonden met stikstofgas cilinder, naar de achterzijde van de patch pipet) en droog met een warmte- gun. Anders handmatig laag de pipet met PDMS, aanbrengen coating zo dicht bij de tip mogelijk, onder een samengestelde microscoop. </li><li> Brand polish patch pipetten met een microforge (een custom-built platina filament gemonteerd op het podium van een samengestelde microscoop). </li><li> Identificeer geïsoleerde axonen demonstreren bestempeld presynaptische terminals met behulp van fluorescentie microscopie. </li><li> Vul opname-oplossing (ontworpen om Ca 2 + stromen te isoleren; 10 mM CaCl2 of 90 mm ​​BaCl2 als ladingdrager, HEPES gebufferde pH 7,6, osmolariteit 270 mOsm) in de patch pipet met behulp van een injectiespuit. </li><li> Steek patch pipet in de pipet houder en positie boven een bad met een gemotoriseerde manipulator MP225. Sluit voorzichtig de patch pipet in het bad en tegen het gezicht van een fluorescent geïdentificeerd presynaptische terminal. </li><li> Vooraf de patch pipet langzaam tot er contact wordt gemaakt met het membraan. Op dit moment bereiken een gigaohm afdichting van zachte mond zuigen door een buis bevestigd aan de pipet houder. </li><li> De extreem lage ruis niveau dat nodig is voor het opnemen van enkel kanaal Ca 2 + stromen te bereiken, gebruikt u een Axopatch 200B met een gekoelde headstage voor de opnames. Voorbeeld data op 20-50 kHz en filter met een 5 kHz Bessel-filter. Uitvoeren van data-acquisitie met een Axograph X. </li><li> Gebruik een standaard stap protocol, in stappen van 10 mV als stimulus. Neem ook een pre-puls in het protocol, voorafgaande aan de stap protocol voor maximale activering van Ca2 + kanalen waarborgen. Voorzien van een 10 mV lek stap in de stap protocol voor post-analyse aftrekken van lekstromen. </li></ol>

<ol><li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+calcium+action+during+neuromuscular+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The timing of calcium action during neuromuscular transmission.</a> Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).</li>
<li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neurotransmission+at+fast+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain.</a> Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).</li>
<li>Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+signal+for+transmitter+secretion+from+presynaptic+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+Paris%22%5BJournal%5D)">Calcium and transmitter release.</a> Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).</li>
<li>Delaney, K. R., Shahrezaei, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncaging+Calcium+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Uncaging Calcium in Neurons.</a> Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).</li>
<li>Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+patch+clamp+capacitance+recordings+from+the+calyx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 244(2007).</li>
<li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calyx-type+synapse+of+the+chick+ciliary+ganglion+as+a+model+of+fast+cholinergic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).</li>
<li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+L+type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).</li>
<li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+calcium+channels+and+acetylcholine+release+at+a+presynaptic+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal.</a> Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).</li>
<li>Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-type+Ca%282%2B%29+channels+carry+the+largest+current+implications+for+nanodomains+and+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).</li>
<li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell+attached+recordings+at+a+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li>
<li>Sheng, J., He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+number+critically+influences+synaptic+strength+and+plasticity+at+the+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone.</a> Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).</li>
<li>Photowala, H., Freed, R., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+function+of+vesicle+clusters%2C+active+zones+and+Ca2%2B+channels+in+the+lamprey+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+569%22%5BJournal%5D)">Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal.</a> The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).</li>
<li>Rovainen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+interactions+of+reticulospinal+neurons+and+nerve+cells+in+the+spinal+cord+of+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey.</a> Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).</li>
<li>Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+influx+independent+depression+of+transmitter+release+by+5+HT+at+lamprey+spinal+cord+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses.</a> The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).</li>
<li>Stanley, E. F., Goping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+calcium+current+in+a+vertebrate+cholinergic+presynaptic+nerve+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal.</a> The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).</li>
<li>El Manira, A., Bussières, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+in+lamprey+sensory+and+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).</li>
<li>Kay, A. R., Alfonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1+43+in+C+elegans+lamprey+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat.</a> 24 (4), 809-817 (1999).</li>
<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li>
<li>Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pools+of+actin+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dual pools of actin at presynaptic terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).</li>
<li>Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+organization+of+lamprey+reticulospinal+synapses+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions.</a> The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).</li>
<li>Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Recording+in+the+Drosophila+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+exceptionally+low+noise+single+channel+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A method for exceptionally low noise single channel recordings.</a> Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen enkele concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten die bekend moeten worden gemaakt.

Onze dissociatie protocol is belangrijk door het afstaan ​​van geïsoleerde reticulospinal axonen verstoken van postsynaptische projecties figuur 2f, maar die toch behouden functionele presynaptische terminals Figuur 4c en figuur 4d. De afwezigheid van postsynaptische processen tegen de presynaptische terminal maakt directe opname toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan aan enkele presynaptische terminals, die eerder niet mogelijk in het centrum van syn...

Synaptische transmissie is een zeer snelle en nauwkeurige werkwijze. Actiepotentiaal invasie van de presynaptische terminal leidt tot het openen van VGCCs gelegen in de release gezicht membraan, de daaruit voortvloeiende toename van de presynaptische Ca 2 + als de trigger voor de vesikel fusie en de afgifte van neurotransmitters 1. Al deze stappen uitgevoerd binnen honderden microseconden 2, en dus vereisen strakke ruimtelijke koppeling van VGCCs aan de vesikel fusie machine 3. Presynaptische Ca 2 + fluxen zijn voornamelijk gekenmerkt door beeldvorming benaderingen met behulp van Ca 2 + gevoelige kleurstoffen 4. Integratie Ca2 + buffers dat Ca2 + moduleren in presynaptische neuronen is gebruikt om het verband tussen presynaptische calcium en neurotransmissie 3 indirect karakteriseren. Bovendien moduleren presynaptische vrije Ca2 + concentratie uncaging Ca2 + 5 of opname macroscopic Ca 2 + stromingen zijn gebruikt in combinatie met de maatregelen van de vesikel fusie en / of vrijgave; zoals capaciteit metingen 6 of postsynaptische reacties 2 op dezelfde vraag aan te pakken. Echter, het karakteriseren van Ca 2 + stromen direct bij de release gezicht, de gespecialiseerde afdeling van de presynaptische membraan waar membraandepolarisatie wordt vertaald in Ca 2 + stromen triggering synaptische vesikel fusie en de neurotransmitter release, is een integraal onderdeel van het verkrijgen van een nauwkeurige meting van de Ca 2 + vereiste voor synaptische vesikel fusie. Bovendien is de mogelijkheid om direct te karakteriseren Ca2 + stromingen individuele presynaptische terminals, in combinatie met nauwkeurige simultaanmeting van vesikel fusie en vrijheid maakt een nauwkeurige opheldering van de timing tussen het tijdsverloop van de actiepotentiaal, presynaptische Ca2 + stroom, vesikel fusie en de release. De toegang tot de release gezicht membraanis niet beschikbaar in de meeste presynaptische terminals worden gesloten en aanhechting van de postsynaptische dendrieten. Deze ontoegankelijkheid is een belangrijk obstakel in de karakterisering van VGCCs omdat het voorkomt directe metingen van stroom bij individuele presynaptische terminals. Directe karakterisering van presynaptische Ca 2 + stromen op individueel presynaptische terminals is tot nu toe niet mogelijk geweest in het centrum van synapsen en is alleen op twee calyceal soort presynaptische terminals; kelk-achtige synaps van het kuiken ciliaire ganglion 7-10 en rat kelken 11,12. In alle andere presynaptische terminals waaronder de reus reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg 13, heeft het gebrek aan toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan het gebruik van indirecte benaderingen noodzakelijk zoals Ca 2 + imaging aan presynaptische Ca 2 + fluxen te bestuderen. <img alt="Figuur 1" fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figuur 1 Lamprey gigantische reticulospinal synaps. (A) Dwarsdoorsnede van lamprei ruggenmerg aangeeft dorso-ventrale richting. Reticulospinal axonen zijn gemarkeerd met groene asterix. (B) 3-D reconstructie van de reticulospinal synaps in de lamprei ruggenmerg tonen presynaptische reticulospinal axon waardoor talrijke en passant contacten (gemarkeerd met groene pijlen) op de postsynaptische neuron 13. Presynaptische terminals zijn gelabeld met Alexa Fluor 488 hydrazide geconjugeerd phalloidin (groen), terwijl de postsynaptische neuron is gevuld met Alexa Fluor 568 hydrazide (rood). Lamprei gigantische reticulospinal axonen, gelegen in het ventrale gebied van het ruggenmerg parallel aan de rostrale-caudale as Figuur 1a, vorm meerdere en passant synaptische contacten op neuronen van despinale ventrale hoorn 14 Figuur 1b 13. Macroscopische whole-cell Ca 2 + stromen zijn opgenomen vanuit reticulospinal axonen in de intacte ruggenmerg 13,15. Echter, eerdere blind pogingen directe meting van Ca2 + stromen in reticulospinal axons in de intacte lamprey ruggenmerg middels cel verbonden patch clamp techniek onsuccesvol 13 gebleken wegens gebrek aan toegang tot de presynaptische afgifte gezicht membraan wegens de tegengestelde postsynaptische processen Figuur 1b. De release gezicht membraan eerder ontsloten door verwijdering van het postsynaptische neuron 11, mechanische verstoring van de synaps vóór opname 12 of enzymatische behandeling in combinatie met mechanische dissociatie 16. Gezien de complexe organisatie van het ruggenmerg, zou het uiterst moeilijk blijkt om de postsynaptische neuron te identificeren en schuif het mechanisch of verstoren the synaps. Vandaar dat we besloten om enzymatische behandeling 17, gevolgd door mechanische dissociatie gebruiken. Met deze aanpak hebben we een acuut gedissocieerde voorbereiding van de lamprei ruggenmerg die levensvatbare geïsoleerde reticulospinal axonen met functionele presynaptische terminals zonder enige postsynaptische processen oplevert ontwikkeld, waardoor onbeperkte toegang tot individuele presynaptische terminals. In combinatie met een standaard omgekeerde microscoop en fluorescentie beeldvorming, het stelt ons in staat om te identificeren en te richten op individuele fluorescent-geïdentificeerde presynaptische terminals, met een patch pipet met een opname oplossing die Ca 2 + stromen Figuur 4c en figuur 4d isoleert, voor het opnemen van het gebruik van cel- bijgevoegde voltage-clamp techniek. Ca 2 + stromingen zijn rechtstreeks opgenomen in de presynaptische vrijlating gezicht membraan van individuele presynaptische terminals figuur 4f. Dit is een significant doorbraak op het gebied van synaptische transmissie omdat het het eerste opname uitgevoerd bij centrale synapsen worden uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>0.2 &micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>De hechtmiddel voor hechtingen dat we in onze experimenten hebben gebruikt, werd ons door een ander laboratorium verstrekt. Het wordt niet langer geproduceerd. We hebben een Histoacryl Hechtmiddel voor toekomstig gebruik verkregen van Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW > 300.000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 160</td><td>Om voor te bereiden, meng elastomer A en elastomer B 10:1 in gewicht</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184&nbsp;</td><td>Om voor te bereiden, meng elastomer en uithardingsmiddel 10:1 in gewicht</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociatie van lamprey reticulospinal axonen naar opnemen inschakelen van de release gezicht membraan van individuele functionele presynaptische terminals

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptische transmissie is een zeer snel proces. Actiepotentiaal gedreven instroom van Ca 2 + in de presynaptische terminal, door middel van spanningsafhankelijke calciumkanalen (VGCCs) gelegen in de release gezicht membraan, is de trigger voor de vesikel fusie en de afgifte van neurotransmitters. Cruciaal voor de snelheid van de synaptische transmissie is de ruimtelijke en temporele synchronie tussen de aankomst van de actiepotentiaal, VGCCs en de neurotransmitter vrijkomen machines. De mogelijkheid om direct op te nemen Ca 2 + stromen vanaf de release gezicht membraan van individuele presynaptische terminals is absoluut noodzakelijk voor een juist begrip van de relatie tussen de presynaptische Ca 2 + en neurotransmitters. Toegang tot de presynaptische vrijlating gezicht membraan voor elektrofysiologische opname is niet beschikbaar in de meeste bereidingen en presynaptische Ca 2 + bericht is gekenmerkt met behulp van beeldvormende technieken en macroscopische huidige meteNTS - technieken die niet beschikken over voldoende tijdsresolutie om Ca 2 + toegang te visualiseren. De karakterisering van VGCCs direct bij enkele presynaptische terminals niet mogelijk was in het centrum van synapsen en is tot nu toe met succes alleen bereikt in de kelk-achtige synaps van het kuiken ciliaire ganglion en in kelken rat. We hebben met succes aangepakt dit probleem in de gigantische reticulospinal synaps van de lamprei ruggenmerg door het ontwikkelen van een acuut gedissocieerde voorbereiding van het ruggenmerg dat geïsoleerde reticulospinal axonen levert met functionele presynaptische terminals verstoken van postsynaptische structuren. We kunnen fluorescent labelen en identificeren van individuele presynaptische terminals en richten ze voor opname. Met behulp van deze voorbereiding, hebben we direct gekenmerkt VGCCs bij de release gezicht van individuele presynaptische terminals met behulp van immunohistochemie en elektrofysiologie benaderingen. Ca 2 + stromingen zijn rechtstreeks opgenomen in de release gezicht membraan of individuele presynaptische terminals, de eerste van die opname uit te voeren bij de centrale synapsen uitgevoerd.

<html> Deze dissociatie protocol levert gezonde en functionele geïsoleerde reticulospinal axonen verstoken van postsynaptische projecties figuur 2f, maar die toch behouden functionele presynaptische terminals staat opgeroepen synaptischeblaasjeseiwit exo-en endocytose figuur 4c en figuur 4d. Secties van de geïsoleerde regio&#39;s van de reticulospinal axonen kan duidelijk worden geïdentificeerd onder een lichtmicroscoop duidelijk van alle andere neuronale processen ongeh...

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van geïsoleerde reticulospinale axonen met functionele presynaptische terminals om de registratie van calciumstromen rechtstreeks vanaf het afgiftevlak van de membraan mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst het ruggenmerg uit de lichaamsholte van de lampe te extraheren en vervolgens de dorsale kolom van het ruggenmerg te verwijderen als tweede stap. Het snijvlakweefsel wordt behandeld met een mengsel van protease- en collagenase-enzymen om het bindweefsel los te maken en het dissociatieproces te vergemakkelijken.Vervolgens worden de laterale banen van het met enzymen behandelde ruggenmerg op het middelpunt doorgesneden om de dissociatiekracht te lokaliseren. Het ruggenmerg wordt acuut gedissocieerd door het voorzichtig te scheiden totdat de reticulospinale axonen geïsoleerd zijn. Er worden resultaten verkregen die de levensvatbaarheid van de geïsoleerde reticulospinale axonen en de registratie van calciumstromen rechtstreeks vanaf het afgiftevlak van de individuele presynaptische terminals aantonen.Het grote voordeel van deze techniek boven het beeldvormen van presynaptische calciumtransient is dat de stromen direct kunnen worden opgelost aan de presynaptische afgiftevlak membraan. Dit kan niet worden bereikt met conventionele beeldvormingstechnieken. De ongehinderde toegang tot de afgiftevlak membraan bij individuele presynaptische terminals stelt ons in staat om talrijke benaderingen toe te passen om aspecten van neurotransmitter bij deze processen te bestuderen.Enkelvoudige iCal-beeldvorming met quantumdots die membraancapaciteitsveranderingen meten en gelijktijdige meting van calciumstromen, maakt een nauwkeurige meting van synaptische vertraging mogelijk. Begin deze procedure door een amite of volwassen lamprei te anesthesieren met trica methaansulfonaat bij 100 milligram per liter. Vervolgens onthoofd de lamprei in vier graden Celsius Ringer-oplossing.Verwijder vervolgens de lichaamswandspieren om het dorsale oppervlak van het ruggenmerg bloot te leggen. Verwijder vervolgens de betekenis prima tiva. Verwijder in dit stadium niet de ventrale betekenis priva.Snijd daarna het ruggenmerg in stukken van een centimeter lang. Prik vervolgens een stuk ruggenmerg met de dorsale kant naar boven op een A-P-D-M-S uitgelijnde snijbaanplaat in een vibram kamer met ijskoude Ringer-oplossing. Verwijder vervolgens een centraal gedeelte van de dorsale kolom van het ruggenmerg en laat de intacte dorsale kolom achter.Snijd aan de rostrale en coddle-uiteinden om tijdens het dissociatieproces als handvatten te dienen. Gebruik de langzaamste snelheidsinstellling bij het snijden en een diepinstelling die alleen de dorsale kolom verwijdert, waardoor de onderliggende reticulaire spinale axonkolom onbeschadigd blijft. Daarna incubeer de gesneden stukken ruggenmerg gedurende 45 minuten op kamertemperatuur in een cocktail van een milligram per milliliter protease en een milligram per milliliter collagenase bereid in Ringer-oplossing.Plaats vervolgens de behandelde ruggenmergstukjes in een A-P-D-M-S uitgelijnde Petri-schaal met vier graden Celsius Ringer-oplossing. Verwijder vervolgens de ventrale betekenis priva met fijne pincetten. Snijd de laterale banen van het ruggenmerg op het middelpunt van het gesneden dorsale gedeelte met een scalpelblad.Plaats vervolgens een druppel onderdompelingsolie op de lens. Plaats vervolgens de met polylysine beklede deksel in de gleuf van de opnamekamer en verzegel de randen met vacuümvet. Schroef de bovenkant op zijn plaats en plaats de kamer in de inzet.Voeg op de opnameopstelling Ringer-oplossing toe aan de opnamekamer met behulp van een weidepijpje. Verbind vervolgens de uitlaatbuis van de drukfles met antivriesoplossing naar de inlaatbuis van het thermo-elektrisch koelapparaat. Verbind vervolgens de uitlaatbuis van het thermo-elektrisch koelapparaat naar het inlaateinde van de buitenste koelmantel en het uitlaateinde naar de reservoir R. Plaats de ruggenmergstukjes een voor een in de opnamekamer.Scheid ze voorzichtig terwijl u ze te allen tijde langs de afdekslip houdt totdat de axonen geïsoleerd zijn. Breng de opnameoplossingtemperatuur naar 10 graden Celsius door de onder druk staande antivriesoplossing door de buitenste koelmantel van de opnamekamer te laten lopen. Laat de axonen een uur herstellen bij 10 graden Celsius na dissociatie.Bij deze procedure perfundeert u het monster met vijf micromolar FM 1 43 in Ringer-oplossing met 30 millimolar kaliumchloride. Perfundeer vervolgens het monster met een milligram per milliliter ADV zeven in Ringer-oplossing. Om overtollig FM-kleurmiddel te verwijderen voordat het wordt geperfundeerd met Ringer-oplossing gedurende 15 minuten.Beeld vervolgens het monster af met een 100 x olieduiklens, een digitale CCD-camera en de beeldverwervingssoftware micromanager. Identificeer individuele fluorescent gelabelde presynaptische terminals voor opname. Bij deze procedure fabriceert u de Illumina silicaatglas patchpijpjes in een P 87 micropijpjestrekker.Ontwerp de patchpijp zodat de pijpjespunt de volledige diameter van het presynaptische terminaal omvat S bescherm de patchpijpjes door ze onder een druk van 50 tot 60 PSI in PDMS te dompelen en ze te drogen met een hittepistool. Polijst vervolgens de patchpijpjes onder de fluorescentiemicroscoop met behulp van een microsmidsvuur. Identificeer de geïsoleerde axonen met gelabelde presynaptische terminals.Vul vervolgens de patchpijp met de opnameoplossing. Plaats met behulp van een spuit een patchpijp in de pijpjeshouder en positioneer deze boven het bad. Gebruik een gemotoriseerde manipulator om de patchpijp voorzichtig in het bad te laten zakken en positioneer deze tegen het gezicht van een fluorescent geïdentificeerd presynaptisch terminaal.Breng de patchpijp langzaam vooruit tot het contact maakt met het membraan. Vorm op dit punt een giga ohm-afdichting door voorzichtig te zuigen door een buis die aan de pijpjeshouder is bevestigd. Gebruik voor data-acquisitie een standaard stapprotocol in stappen van 10 millivolt als stimulus.De acuut gedissocieerde reticulospinale axonvoorbereiding kan worden gebruik

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Dit artikel beschrijft drie zenuwstelsel bereidingen met behulp van bloedzuigers: intracellulaire opname van neuronen in ventrale ganglia, het kweken neuronen van ventrale ganglia, en het opnemen van een patch van geïnnerveerde huid sensorische gebieden in kaart.

Intracellulaire opname, Sensory Velden bij, en het kweken geïdentificeerde neuronen in de Leech, Hirudo medicinalis</i

Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van de muis Musculus levator auris longus (LAL) spier graag spontane, zenuw-opgeroepen postsynaptisch potentieel (current-clamp) en stromingen (spanning-klem) op de motorische eindplaat. Gebruik van deze techniek kan belangrijke inzicht verwerven in de mechanismen van synaptische transmissie onder normale en zieke voorwaarden.

Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden

Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.

Elektrofysiologische onderzoeken van Retinogeniculate en Corticogeniculate Synapse functie

Leer hoe je reticulospinale axonen van lampreien isoleert om calciumstromen te meten aan individuele presynaptische terminale. Deze methode biedt directe toegang tot het release face membraan voor elektrofysiologisch onderzoek.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals (Video) | JoVE Journal

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Meer video's verkennen