Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Het algemene doel van het volgende experiment is om TRO's van een wilde type bacteriestam te produceren die groeien in minimaal zouten medium aangevuld met glucose. Dit wordt bereikt door een transpo-zone in de wilde type gastheerstam te transformeren om een canna mycine resistente populatie bacteriën te verkrijgen met willekeurige transpositie op invoegsels. Vervolgens worden transformanten gescreend door replica plating, waarbij TRO's worden geïdentificeerd die groeien op rijk medium, maar niet groeien op minimaal zouten medium aangevuld met glucose.

Vervolgens wordt het genomische DNA van de mutant gedigesteerd, gelieerd en getransformeerd in e coli om een plasmide te verkrijgen dat het transpozon bevat, geflankeerd aan beide uiteinden door segmenten van het onderbroken gen. Resultaten worden verkregen die de veronderstelde identiteit van het onderbroken gen tonen op basis van DNA-sequencing en analyse met behulp van een basic local alignment search tool. Het transpozon dat in deze techniek wordt gebruikt, heeft een replicatie-oorsprong, een kanamycine-resistent gen en mozaïek-einden.

Voor transpositie van eiwitbinding. Het mist het transpositie-eiwitgen en daarom moeten we dit transpositiegen toevoegen aan het transposon-DNA-fragment, en vervolgens wordt het complex tussen het transposon-DNA en het eiwit geëlektroporeerd in de gastheer. De belangrijkste voordelen van elektroporatie zijn het elimineren van de noodzaak voor transductie of conjugatie.

Het ontbreken van een transpositie-gen produceert meestal stabiele invoegsels en de aanwezigheid van een replicatie-oorsprong en een CIN-resistentiegen maakt het gemakkelijk om het gemuteerde gen te identificeren, dat wordt hersteld als een recombinant plasmide. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiële fysiologie, zoals het identificeren van genen die nodig zijn voor de biosynthese van aminozuren, nucleïnezuren en vitaminen. Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen ik op zoek was naar metaalresistentiegenen in enterobacter-soorten YSU en besloot het te integreren in een microbiële fysiologielab dat ik aan het ontwikkelen was. Om competente cellen te elektroporeren met behulp van een overnachtcultuur van enterobacter-soorten.

YSU bereid een verdunning van 1 op 20 in vers LB-medium en incubeer bij 30 graden Celsius en 120 RPM tot een OD 600 tussen 0,4 en 0,6. Wanneer de cellen de juiste dichtheid hebben bereikt, koel ze af op ijs gedurende vijf minuten en centrifugeer vervolgens bij vier graden Celsius en 7.000 Gs gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en gebruik een gelijk volume ijskoud water om te resuspenderen.

Schors de cellen, centrifugeer bij vier graden Celsius en 7.000 Gs gedurende vijf minuten. Na herhaling van de wasstap, gooi het supernatant weg en schors de cellen met ijskoud water in een volume dat gelijk is aan het volume van de cellenpellet. Voeg vervolgens 0,5 microliter van de transpo-zone toe aan 40 microliter cellen.

Plaats vervolgens het celtranspo-zonemengsel in een ijskoud elektroporatievat en tik het mengsel naar de bodem van de Q Vet. Schok de cellen bij 25 micro phs, 200 ohm en 2,5 kilovolt. Voeg onmiddellijk 960 microliters van gefilterd steriel SOC-medium toe, gemengd door op en neer te pipetten, voordat u de cellen overbrengt naar een steriele 1,5 milliliter microfugebuis. Incubeer de cellen bij 30 graden Celsius en 120 RPM gedurende 45 tot 60 minuten.

Spreid vervolgens 100 microliter cellen uit op een LB-kan-agarplaat voordat u de plaat overnacht bij 30 graden Celsius incubeert om transformanten aan te brengen. Plak een raster op het deksel van een lege 100 bij 15 millimeter Petri-schaal. Trek een lijn op de bodem van een LB-kan-agarplaat en gebruik een klein stukje plakband om het te bevestigen aan het rasterdeksel, zodat het raster zichtbaar is door de auger Met een steriele tandenstoker.

Kies een enkele transformant en plaats deze in het midden van een vierkant in het raster. Plaats een andere transformant in een aangrenzend vierkant en ga zo door tot de plaat vol is. Incubeer vervolgens overnacht bij 30 graden Celsius. Dit is de masterplaat voor elke plaat die is gerasterd.

Maak een stapel van drie verse augerplaten genummerd van één tot drie. Nummer één voor LB-kan, nummer twee voor M negen-kan. En nummer drie voor LB-kan. Droog de platen omgekeerd overnacht bij 37 graden Celsius voor gebruik.

Na het trekken van een lijn op de bovenkant van elke plaat, zoals eerder gedemonstreerd, gebruikt u 70% ethanol om het replica-plaatgereedschap af te vegen en plaatst u een steriele veltijn-vierkant erop voordat u het veltijn-vierkant vastklemt. Richt vervolgens de lijn op de masterplaat uit met een lijn getekend op de klem en plaats de plaat bovenop het veltijn-vierkant. Oefen zachtjes druk uit om de bacteriën van de plaat over te brengen naar het veltijn-vierkant.

Lign vervolgens de lijn getrokken op plaat nummer een met de lijn op de klem en plaats deze bovenop het veltijn-vierkant. Oefen zachtjes druk uit om de bacteriën van het veltijn-vierkant over te brengen naar plaat. Verwijder plaat nummer een.

Gooi het veltijn-vierkant weg in een beker met water en plaats een schone, steriele veltijn op het replica-plaatgereedschap. Zoals eerder, richt de lijn op plaat nummer een uit met de lijn op de klem en plaats deze bovenop het nieuwe veltijn-vierkant. Oefen zachtjes druk uit om de bacteriën van plaat nummer een over te brengen naar het veltijn-vierkant.

Verwijder plaat nummer een, lijn de lijn getrokken op plaat nummer twee uit met een lijn op de klem en plaats deze bovenop het veltijn-vierkant. Oefen zachtjes druk uit om de bacteriën van het veltijn-vierkant over te brengen naar plaat. Verwijder plaat nummer twee na het herhalen van het proces voor plaat nummer drie, en incubeer de platen overnacht bij 30 graden Celsius. Kolonies die groeien op beide LB-kan-platen, maar niet groeien op M negen-platen, worden bes