Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gecombineerde proteomische aanpak te gebruiken om potentiële prognostische markers en/of therapeutische doelen bij menselijke ziekten te identificeren. Dit wordt bereikt door primaire leukemiecellen van patiënten met perifere bloed, die een goede of slechte prognose hebben, te isoleren en zowel CD 19 als CD vijf oppervlaktemarkers te gebruiken voor proteomische analyse als tweede stap. Leukemiecellysaten worden opgelost door tweedimensionale elektroforese of twee de, en de vergelijking van proteomische kaarten maakt het mogelijk om plekken te identificeren die differentieel tot expressie worden gebracht tussen goede en slechte prognosepatiënten, die vervolgens kunnen worden geïdentificeerd door massaspectrometrie of ms.

Vervolgens kunnen verschillende assays worden gebruikt om de rol van de geïdentificeerde eiwitten in de natuurlijke geschiedenis van de ziekte te valideren en te ontleden. De resultaten tonen aan dat verschillende fosforylatiestatus van HS één gedetecteerd door twee de gels, correleert met het klinische resultaat van de patiënten. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van chronische lymfatische leukemie omdat het kan helpen om eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij de progressie van de ziekte die kunnen worden gebruikt als prognostisch marker en/of therapeutische doelen. Deze procedure zal samen met me worden gedemonstreerd.

Pamela liep naar de technicus in het laboratorium en een postdoc van een extern laboratorium. Voordat met deze procedure wordt begonnen, wordt perifeer bloed verzameld in vacutainer bloedopnamebuizen met natriumheparine. Breng het bloed over in een buis van 15 milliliter en voeg menselijk B-celverrijkingscocktail toe met 50 microliter per milliliter vol bloed. Meng vervolgens goed en incubeer gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.

Na incubatie, verdunt u het monster met een gelijk volume PBS plus 2%FBS-mix voorzichtig en zorg ervoor dat u het bloed voorzichtig over de vlieg op de call legt zonder de interface te breken. Centrifugeert het monster gedurende 20 minuten bij 400 keer G op kamertemperatuur zonder pauze. Wanneer u klaar bent, zuigt u voorzichtig het interface af om de cellen te recupereren en plaatst u ze in een nieuwe buis.

Was de cellen eenmaal met PBS na centrifugatie en supernatant verwijdering. Resus. Suspendeer de pellet in het resterende supernatant door de buis handmatig heen en weer te schudden na verdunning. Tel de cellen met behulp van de Trian blauwe exclusiemethode met compleet RPMI-medium.

Voeg vervolgens de volgende antilichamen toe aan 100 microliter van de gezuiverde celsuspensie in een faxbuis. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in het donker. Na het wassen van het monster met vier milliliter PBS, controleert u de zuiverheid door middel van flowcytometrie.

Controleer het percentage van de chronische lymfatische leukemie of CLL-cellen, die CD 19 en CD vijf op hun oppervlak co-expriment. Zorg ervoor dat de preparaten praktisch geen NK t-lymfocyten en monocyten bevatten door het percentage van CD drie, CD 14 en CD 1656 in de plot te controleren, die op dit moment bijna nul zouden moeten zijn. Solubiliseer CLL-cell pellets met een eindvolume van 380 microliter tweedimensionale elektroforesepuffer.

Breng een milligram van de eiwitmonsters aan op 18 IPG strips om iso-elektrofocussering uit te voeren. Na de run, brengt u de strips in evenwicht in twee milliliter evenwichtingsbuffer, aangevuld met 2% verse DTT gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Na het weggooien van de oplossing, voegt u twee milliliter evenwichtingsbuffer toe, aangevuld met 2,5% I oto-acetaat.

Incubeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten op kamertemperatuur op een schuddende platform. Droog de strips vervolgens op papier zonder het gel aan te raken om de overtollige oplossing te verwijderen. Eenmaal droog, laadt u elke strip bovenop een negen tot 16% gradiënt SDS-paginagel.

Voeg een kleine hoeveelheid SDS-elektroforesebuffer toe aan de bovenkant van het gel om het laden van de strip te vergemakkelijken. Vervolgens sluit u de gel af door ongeveer vijf milliliter 0,8% agar-oplossing toe te voegen om drijvend van de strip te voorkomen. Zodra de elektroforese-eenheid is geassembleerd, vult u deze met SDS-elektroforesebuffer.

Voer vervolgens de run uit bij 60 milliampère per gel gedurende vier uur, vier graden Celsius, of door een koelsysteem te gebruiken. Nadat u de gel uit de elektroforese-eenheid heeft gehaald, plaatst u deze in de juiste kleuringsbox. Bereid ongeveer 200 milliliter van elke oplossing voor.

Voeg elke oplossing voorzichtig toe aan de kleuringsbox die de gel bevat. Voer alle incubaties uit op een schuddende platform. Verwijder na het kleuren de stopoplossing en laat de gel in een oplossing van 1% azijnzuur tot acquisitie.

Voor de migratietest, resus- suspendeer de eerder gezuiverde cellen. Bereid in compleet RPMI de onderste transwell-kamer voor door 600 microliter compleet RPMI toe te voegen met of zonder de specifieke stimuli. Om de geïnduceerde en de spontane migratie te meten, plaatst u de bovenste kamer erop en laat u het systeem 30 minuten bij 37 graden Celsius in de incubator gelijkmaken.

Wanneer u klaar bent, zaait u 10 tot zes cellen per 200 microliter in de bovenste kamer en incubeert u de plaat gedurende vier uur bij 37 graden Celsius in de incubator. Verwijder na incubatie de bovenste kamer en verzamel het medium in de onderste kamer. Was vervolgens de onderste kamer eenmaal met één milliliter PBS.

Na het verzamelen van het PBS in een buis, centrifugeert u het monster gedurende vijf minuten bij 300 keer G na verwijdering van het supernatant. Resuspendeer het monster in 500 microliter PBS door middel van flowcytometrie. Tel het aantal gemigreerde cellen na één minuut acquisitie.

Controleer het aantal cellen in een bi-dimensionaal stipplot door de zijdeverspreiding van de cellen en het aantal gebeurtenissen te bekijken dat in één minuut wordt gevisualiseerd, wat het aantal is dat u voor berekeningen moet gebruiken.