Name: Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer een methode om calciumsignalen in Arabidopsis te monitoren op cellulair en geheel-plant niveau met behulp van genetisch gecodeerde indicatoren. Deze techniek biedt inzicht in plantreacties op abiotische stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn B. Stevenson dankbaar voor de technische assistentie en Dr. Marc R. Knight voor het verstrekken van de Aequorin transgene lijn. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1 Aequorin Based Ca 2 + Imaging Met behulp van de FAS-systeem <ol><li> Bereid zaailingen voor luminescentie beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die Aequorin met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton-100. Zaai de steriele zaden op een vierkante plaat (10 x 10 cm vierkante Petrischaal met rooster) met volle sterkte MS (Murashige en Skoog basaal zoutmengsel), 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een groeikamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen (Figuur 1A). </li><li> Breng de zaailingen op een film. Een zelfklevende folie (Figuur 1B) bovenop 7-10 dagen oude zaailingen groeien op de plaat. Duw de film van de hand om ervoor te zorgen dat de zaailingen zich houden aan de film (figuur 1C). Schil de film voorzichtig zodat de zaailingen blijven gehandeld op grond van de film (figuur 1D en 1E) </li><li> Incubeer de zaailingen met cofactor. Leg het eendhered zaailingen op de vierkante plaat (10 x 10 cm) die 15 ml van 2 ug / ml h-CTZ (coelenterazine) in water. Incubeer de zaailingen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur gedurende de nacht (Figuur 1F). </li><li> Bereid je voor op luminescentie beeldvorming. Neem de film uit de h-CTZ oplossing en snijd het in het midden, de vorming van twee stukken. Leg elk stuk van de film met zaailingen zijde naar boven in twee verschillende platen. Laat de platen in het donker gedurende 5 minuten. </li><li> Acquire luminescentie afbeeldingen. In het donker plaats de twee platen naast elkaar op het stadium van het luminescentiebeeldvorming (figuur 1G). Acquire beelden onmiddellijk na toevoeging van 20 ml van stimuli oplossing aan de platen tegelijk. </li><li> Analyseer luminescentie afbeeldingen. Kies dezelfde weergave bereik voor alle luminescentie afbeeldingen. Snijd de regio van belang (ROI) en het genereren van de beelden als JPEG-bestanden (Figuur 2A). Als alternatief, exporteren de beelden als SPE-bestanden en ze te importeren in deImageJ beeldanalyse software. Set metingen voor de berekening van de gemiddelde grijswaarde van ROI. Selecteer dezelfde grootte van ROI gebied en meet de gemiddelde grijze en presenteren van gegevens als staafdiagrammen (figuur 2B). </li></ol> 2 live cell confocale Imaging Ca 2 + <ol><li> Bereid zaailingen voor confocale beeldvorming. Steriliseren zaden van Arabidopsis planten die case12 met 10% bleekwater oplossing met 0,01% Triton. Zaai de steriele zaden op een plaat met full kracht MS-zouten, 1% sucrose en 1,2% agar. Plaats platen verticaal in een kweekkamer na stratificatie bij 4 ° C gedurende 2 dagen. </li><li> Setup Imaging Chambers <ol><li> Monteer een imaging kamer met een glijbaan en dekglaasje (kamer A). Leg een stuk water gedrenkt watten op het midden van de dia. Daarna brengt een of twee 5 dagen oude zaailingen van de plaat op de bovenkant van water gedrenkt watten. Plak kleine stukjes klei elke hoek van een dekglaasje, eend plaats dekglaasje bovenop zaailingen een spleet (ruimte) tussen het dekglaasje en schuif (figuur 3A, linkerpaneel) creëren. Sluit een uiteinde van polyethyleen buis (0,58 mm diameter) met een 1 ml spuit en plaats het andere uiteinde van buis direct naast de kamer. Houd de slang vast met tape (Figuur 3A, rechter paneel). </li><li> Monteer een imaging kamer met behulp van een kamer van plexiglas (kamer B). <ol><li> Een dun laagje siliconenvet ongeveer twee polyethyleenbuizen (0,58 mm diameter) en druk op de gecoate buizen in de kanalen aan elke zijde van de kamer van plexiglas (Figuur 3B linkerpaneel). Een dun laagje siliconen vet op het oppervlak van de kamer die de buis groeven bevat en op een dekglaasje aan het vet een zijde van de kamer opening (uitgesneden) te verzegelen. </li><li> De overdracht van een vijf dagen oude zaailing van de plaat in de kamer en leg een stukje watten gedrenkt met water op de top of de zaailing. Verspreid siliconenvet op het andere oppervlak van de kamer, en de druk op een andere dekglaasje op de top te dichten. Sluit het uiteinde van een van de buizen een 1 ml spuit. Laat het uiteinde van de andere buis open (figuur 3B rechter paneel). </li></ol></li><li> Bereid een imaging kamer met behulp van een chambered afdekglas (kamer C). Steriliseer de chambered deksel glas met 70% ethanol en laat het op de motorkap tot het droog is. Voeg 0,6 ml of 0,2 ml onverdund MS medium bevattende 1% sucrose en 0,5% Phytagel in elk putje van een 2-well ruimte of 8-well kamer (Figuur 3C rechter paneel), respectievelijk. Steriliseren zaden en zaaien direct in een chambered deksel glas met een dunne laag van heldere gel en laat ze verticaal groeien gedurende 5 dagen (Figuur 3C). </li></ol></li><li> Verwerven van beelden met behulp van een confocale microscoop. Om stress stimuli, zoals zout, koud of peroxide toepassen injecteer langzaam ongeveer 200 ui 150 mM NaCl, ice-cold water of 1 mM H 2 O 2-oplossing in de kamer (kamer A of B) vlak voor het ophalen van afbeeldingen of zacht voeg 500 ul of 100 ul stimulus oplossing voor het putje van een 2 of 8-well kamer, respectievelijk . Maak foto&#39;s onmiddellijk na het aanbrengen van de stimulus-oplossing met behulp van een omgekeerde Nikon A1R confocale laser scanning microscoop met een 20X water immersie objectief (numerieke apertuur 0.75). Verzamel een tijdreeks afbeeldingen 4 sec intervallen met excitatie en emissie golflengten van 488 nm en 500-550 nm, respectievelijk, en met een resolutie van 512 x 512. </li><li> Beeldanalyse Met Nikon Elements, ROI&#39;s werden getrokken rond elke cel (of het oppervlak) van belang. Totaal intensiteit in elk ROI gemeten tijd met het dialoogvenster tijdmeting box (ImageJ kunnen in plaats daarvan worden gebruikt). Totale intensiteit metingen werden uitgevoerd en verwerkt in Datagraph. Ca 2 + spike amplitude werd gedefinieerd als de piek intensiteit min rusten intensiteit, duur als the tussen aanvang en de voltooiing van een piek, en zolang de tijdsinterval tussen aangrenzende piek pieken van twee pieken. t-test werd gebruikt om de gemiddelden te vergelijken. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben een FAS-systeem gedemonstreerd voor het opnemen van de ruimtelijke en temporele Ca2 + respons van Arabidopsis zaailingen. Deze FAS Ca2 + opnamesysteem een eenvoudige, gevoelige en robuuste benadering die kan worden aangepast voor het meten Ca2 + dynamica veroorzaakt door verschillende stimuli naast de abiotische stress stimuli die hier worden gepresenteerd. Met behulp van dit systeem kunnen we gemakkelijk weefsel-of stimuli-specifieke ruimtelijke en temporele Ca 2 + ...

De plant cel reageert op het milieu via signalering die cel acties coördineert. Een vroege signaaltransductie gebeurtenis in antwoord op omgevingsstimuli een voorbijgaande Ca2 + stijging. Het patroon, of de handtekening van een tijdelijke toename van vrije Ca 2 +-concentratie wordt gekenmerkt door zijn amplitude, frequentie en duur. Verschillende ruimtelijke en temporele Ca 2 + handtekeningen regelen verschillende cellulaire activiteiten 1. Specifieke stimuli, zoals hitte, kou, zout, droogte, licht, of plantenhormonen, kunnen fine-tunen van de ruimtelijke en temporele activiteit van gelokaliseerde Ca 2 +-kanalen en / of vervoerders, wat resulteert in specifieke Ca 2 + handtekeningen. Hoewel Ca 2 + transporters zijn goed gekarakteriseerd, is er weinig bekend over de moleculaire identiteit en de hoedanigheid van de Ca 2 +-kanalen in planten 1. Genetische screens voor mutanten met veranderde Ca2 + respons op stimuli benadrukken kan een effectieve ca. zijnOACH voor het identificeren van de componenten die Ca 2 + handtekeningen te componeren. Onlangs gebaseerd verscheidene aequorine Ca2 detectiesystemen ontwikkeld dat genetische screens vergemakkelijken Ca2 + signaleringscomponenten in reactie op pathogenen attack en abiotische stress 2-4. Aequorine werd eerst gebruikt voor het detecteren Ca2 + signalen in planten in de vroege jaren 1990 5. Sindsdien aequorine is gericht op verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytoplasma 5, 6 nucleus, chloroplasten 7, tonoplast 8, 9 mitochondria en stroma 10, alsmede verschillende celtypen in de root celspecifieke Ca 2 monitoren + signalen 11. Aequorin gebaseerd Ca 2 + metingen onthullen de ruimtelijke en temporele Ca2 + respons van een populatie van cellen op stimuli benadrukken. In de meeste gevallen, de Ca2 + responsen van afzonderlijke cellen unsynchronized in de reagerende weefsel 4. Daarom garandeert Aequorin Ca 2 + opname niet noodzakelijk verslag van de Ca 2 + signaal in individuele cellen. In de afgelopen jaren, genetisch gecodeerde fluorescent eiwit (FP) gebaseerde Ca2 + indicatoren, zoals geel kameleon (YC) 12 en gevallen12 13 zijn gebruikt om Ca 2 + studeren signalerend met hoge subcellulaire resolutie. YCS zijn fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) gebaseerde Ca 2 +-indicatoren, met GVB en YFP varianten toegevoegd door de Ca 2 + -bindende eiwit calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Calmoduline ondergaat een vormverandering als het bindt aan Ca 2 +, daardoor brengt GVB en YFP dichter bij elkaar, wat resulteert in een verhoogde energie-overdracht (verbeterde FRET). De FRET level tijd, ruwweg berekend als de verhouding van YFP de GVB signaalintensiteiten, weerspiegelt de intracellulaire Ca2 + dynamiek. Verschillende YC versies zijn gebruikt in planten. YC3.6 was targeted naar het cytosol 14,15, kern 16, mitochondria 17 en plasmamembraan 18, en YC4.6 en D4ER waren gericht naar de ER 15,19, en D3cpv was gericht op de peroxisomen 20. Transgene planten die YCS laat de live-cell imaging van Ca 2 + dynamiek binnen de verschillende cellulaire compartimenten van verschillende celtypen. CASEs (vermoedelijk Ca lcium se nsor) zijn enkel circulair gepermuteerde fluorescerende eiwitten (cpFPs) drager zijn van een calmoduline en-calmoduline bindingspeptide M13. Na binding aan Ca2 + CASEs conformationele veranderingen ondergaan, leidend tot een toename van fluorescentie-intensiteit. De correlatie tussen fluorescentie respons van de behuizing en Ca2 + concentratie maakt intracellulair Ca2 + dynamiek kwantitatief te meten. De Case12 variant heeft 12-voudige toename van fluorescentie in de Ca 2 + -saturated vormen. N. benthiminana planten kortstondig expressing Case12 of Arabidopsis planten stabiel tot expressie Case 12 werden gebruikt om Ca 2 + signalering studeren in de verdediging en abiotische stress 4,21. Asynchrone ruimtelijke en temporele Ca 2 +-oscillaties in de cellen reageren op pathogeen aanval, of om uitdroging van stress zijn geopenbaard met Case12 gebaseerd Ca 2 + imaging. Hier, gedetailleerde instructies voor Aequorin gebaseerd luminescentie beeldvorming van weefsel-en stimuli specifieke Ca 2 + dynamiek in Arabidopsis zaailingen, en voor confocale beeldvorming van cytosol en nucleaire Ca presenteren we 2 + dynamiek in Arabidopsis wortel cellen die zaak 12 luminescentie beeldvorming van FAS uiten kan worden aangepast aan de stress geïnduceerde Ca2 + dynamiek analyseren intacte planten of weefsels hier niet beschreven, of aan gemutageniseerde Arabidopsis plantpopulaties screenen voor mutanten met veranderde stress veroorzaakte Ca 2 +-signalen. De live cell Ca 2 + imaging setup kan worden aangepast aan Ca analyseren2+ dynamiek binnen de verschillende subcelluar compartimenten of in verschillende celtypes met andere Ca 2 +-indicatoren.

<table><tbody><tr><td>10 cm x 10 cm vierkante Petri-schaaltje</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende film</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisjes</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Siliconenvet</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>2-kamerige gekamerde dekglazen </td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>8-kamerige gekamerde dekglazen</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Luminescentie beeldvormingssysteem</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd confocale laser-scanning microscoop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R </td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon Elements </td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 is de nieuwste versie</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose bleekmiddel</td><td>Elke lokale winkel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS zout</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

meten ruimtelijke en temporele ca 2 + signalen in arabidopsis planten

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ontwikkelings-en omgevingsfactoren veroorzaken Ca 2 + schommelingen in plantencellen. Stimulus-specifieke ruimtelijke en temporele Ca 2 + patronen worden waargenomen door cellulaire Ca2 +-bindende eiwitten die Ca 2 + signaleringscascades initiëren. We weten echter nog weinig over hoe stimulus specifieke Ca 2 +-signalen worden gegenereerd. De specificiteit van een Ca2 + signaal kan worden toegeschreven aan de verfijnde regulering van de activiteit van Ca2 + kanalen en / of transporteurs in reactie op een bepaalde stimulus. Om deze cellulaire componenten te identificeren en begrijpen van hun functies, is het cruciaal om systemen die een gevoelige en robuuste opname van Ca 2 +-signalen op zowel het weefsel en cellulaire niveau te gebruiken. Genetisch gecodeerd Ca 2 +-indicatoren die gericht zijn op verschillende cellulaire compartimenten hebben een platform voor live cell confocale beeldvorming van cellulaire Ca2 + signalen voorzien. Hier beschrijven we instructies voor het gebruik van twee Ca 2 + detectiesystemen: aequorin gebaseerd FAS (film lijm zaailingen) luminescentie Ca 2 + imaging en case12 gebaseerd live cell confocale fluorescentie Ca 2 + imaging. Luminescentie beeldvorming met behulp van de FAS-systeem biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige detectie van de ruimtelijke en temporele Ca 2 +-signalen op het weefsel niveau, terwijl de live cell confocale beeldvorming met behulp Case12 biedt gelijktijdige detectie van cytosol en nucleaire Ca 2 +-signalen met een hoge resolutie.

Mannitol, NaCl en H 2 O 2 werden gebruikt als proxies voor uitdroging, zout en oxidatieve stress stimuli, respectievelijk. Om te controleren of de zware metaalionen CU2 + synergie met een van deze drie stressstimuli vergeleken we de Ca2 + voor iedere stimuli in de aanwezigheid of afwezigheid van Cu2 +. Zoals getoond in figuur 2, FAS luminescentiebeeldvorming gebleken dat Arabidoposis zaailingen anders reageerde op uitdroging, zout en oxidatieve stre...

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te demonstreren voor het bewaken van calciumsignalen op zowel cellulair als geheel plantniveau. Dit wordt bereikt door eerst zaailingen te laten groeien op de MS agarplaat of direct in de beeldvormingskamer. De tweede stap is om de zaailingen over te brengen naar een klevend film of om ze in de beeldvormingskamer te houden.Vervolgens worden stimuli toegepast op de zaailingen om calciumsignalen te induceren. Uiteindelijk wordt levensduur luminescence of fluorescentiebeeldvorming gebruikt om de calciumrespons van het hele zaailing of het cytosolische nucleaire calcium respectievelijk op verschillende stimuli te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals enkelvoudige plantvoorkomst is dat de filmklevende zaailingassay eenvoudig, gevoelig en robuust is.Daarom kan deze techniek worden aangepast aan de high throughput screening voor mutanten met gewijzigde calciumsignaalresponsen. Bovendien, vergeleken met flat based calciumbeeldvorming, vermijdt het gebruik van GFP-gebaseerde genetisch gecodeerde calciumindicator gecompliceerde microscopische instellingen en berekeningen. Deze methode biedt inzicht in calciumsignalering tijdens de stressrespons in Arabidopsis, maar kan ook worden gebruikt in andere contexten zoals tijdens ontwikkeling of verdediging in andere plantmodellen.Het demonstreren van deze methode zal schitteren. Een student uit ons lab Om deze procedure te beginnen, steriliseren de zaden van een konijnopsisplanten die een quain expresseren met 10% bleekmiddeloplossing bevattend 0.01%Triton 100, zaai de zaden op een vierkante plaat met volledige sterkte MS 1% sucrose en 1.2% agar. Plaats vervolgens de platen verticaal in een groeikamerraam na stratificatie van vier graden Celsius gedurende twee dagen.Vervolgens worden de zaailingen overgebracht naar een film. Plaats een klevend film op de zeven tot 10 dagen oude zaailingen die op de plaat groeien. Duw de film voorzichtig met de hand om ervoor te zorgen dat de zaailingen aan de film hechten.Vervolgens wordt de film voorzichtig verwijderd zodat de zaailingen aan de film blijven hechten. Vervolgens worden de zaailingen geïncubeerd met de cofactor door de A-hechtende zaailingen op een vierkante plaat met 15 milliliter twee microgram per milliliter HCTZ in water te plaatsen. Incubeer de zaailingen bij kamertemperatuur gedurende vier uur tot overnachting.Om voor te bereiden op luminescenebeeldvorming, haal de film uit de HCTZ-oplossing en snijd hem in het midden om twee stukken te vormen. Plaats de twee stukken film met de zaailingen omhoog in twee verschillende platen. Laat vervolgens de platen vijf minuten in het donker om luminescenebeelden in het donker te verkrijgen.Plaats twee platen naast elkaar op het podium van het luminescenebeeldvormingssysteem. Verkrijg beelden onmiddellijk na het toevoegen van 20 milliliter stimuli-oplossing gelijktijdig aan de platen. Om de luminescenebeelden te analyseren, kies dezelfde weergavebereik voor alle luminescenebeelden, knip het ROI en genereer de beelden als jpeg-bestanden.Alternatief, exporteer de beelden als SPE-formaatbestanden en importeer ze in de image J beeldanalysesoftware. Stel de metingen in voor het berekenen van de gemiddelde grijze waarde van ROI selecteer dezelfde grootte van ROI-gebied. Meet vervolgens de gemiddelde grijze waarde en presenteer gegevens als staafdiagrammen.Om zaailingen voor confocale beeldvorming voor te bereiden. Steriliseer de zaden van de opsisplanten die case 12 expresseren met 10%bleekoplossing bevattend 0.01%Triton. Zaai de steriele zaden op een plaat met volledige sterkte MS-zouten, 1%sucrose en 1.2%agar.Plaats vervolgens de platen verticaal in een groeikamerraam na stratificatie bij vier graden Celsius gedurende twee dagen. Maak ondertussen een beeldvormingskamer samen met een dia en een dekglas. Plaats een stukje waterdoorweekte watten op de bovenkant van de dia.Vervolgens wordt een of twee vijf dagen oude zaailingen van de plaat overgebracht naar het midden van de dia. Plak vervolgens kleine stukjes klei in elke hoek van het dekglas en plaats het dekglas op de zaailingen om een opening tussen het dekglas en de dia te creëren. Verbind vervolgens het ene uiteinde van de polyethyleenbuis met een een milliliter spuit en plaats het andere uiteinde van de buis direct naast de kamer.Houd de buis op zijn plaats met tape om een beeldvormingskamer samen te stellen met een plexiglaskamer. Verspreid een dunne laag siliconenvet rond twee polyethyleenbuizen en druk de gecoate buizen in de kanalen aan elke kant van de plexiglaskamer. Verspreid vervolgens een dunne laag siliconenvet op het oppervlak van de kamer die de buisgroeven bevat en plaats een dekglas op het vet om een kant van de kameropening te verzegelen.Vervolgens wordt een vijf dagen oude zaailing van de plaat overgebracht naar de kamer en wordt een stukje katoen gedrenkt in water op de zaailing geplaatst. Verspreid de siliconenvet op het andere oppervlak van de kamer en druk een ander dekglas op de bovenkant om te verzegelen. Verbind vervolgens het uiteinde van een van de buizen met een een milliliter spuit en laat het uiteinde van de andere buis open.Om een beeldvormingskamer met een gekamerde dekglas voor te bereiden, steriliseer eerst het gekamerde dekglas met 70%ethanol en laat het in de kap tot het droog is bij 0.6 milliliter of 0.2 milliliter van volledige sterkte MS. Medium bevattend 1% sucrose en 0.5%fightergel in elke put van een tweedelige kamer of een achtdelige kamer respectievelijk. Steriliseer vervolgens de zaden en zaai ze direct op een gekamerde dekglas bevattend een dunne laag heldere gel en laat ze vijf dagen verticaal groeien. Voor beeldverwerving.Gebruik een confocale microscoop om stressstimuli toe te passen door langzaam 200 microliter 150 millimolair natriumchloride, ijskoud water of een millimolair waterstofperoxide-oplossing in de kamer te injecteren net voor het verkrijgen van beelden. Vang de beelden onmiddellijk op nadat de stimulusoplossing is toegepast. Gebruik een omgekeerde confocale laserscanningmicroscoop met een 20 x

measuring-spatial-and-temporal-ca2-signals-in-arabidopsis-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Dit protocol beschrijft een methode om de hypothese te testen dat de omkering van het effectieve geomagnetische veld (GMF) differentiële genexpressie induceert en de morfologie van Arabidopsis thaliana verandert. Een triaxial octagonaal systeem van Helmholtz spoelparen werd gebruikt om kunstmatig omgekeerde GMF-condities in de plantengroeikamerber te genereren.

Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ontwikkeling en Gene Expression

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het analyseren van calcium signalen in planten die zijn gegenereerd door het voeren van hemipteran insecten, zoals bladluizen. Arabidopsis thaliana getransformeerd met de GFP calcium biosensor GCaMP3 toestaan voor de real-time in vivo imaging van calcium dynamiek met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Real-time In Vivo opname van Arabidopsis Calcium signalen tijdens insecten voeden met behulp van een fluorescerende Biosensor

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

Gibberelline perceptie Sensor 1 (GPS1) is de eerste Förster resonance energie overdracht gebaseerde biosensor voor het meten van de cellulaire niveaus van Gibberelline fytohormonen met een hoge Spatio resolutie. Dit protocol rapporteert over de methode om te visualiseren en te kwantificeren van cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de genetisch gecodeerde nlsGPS1 biosensor in Arabidopsis hypocotyls en wortel tips.

Visualiseren cellulaire Gibberelline niveaus met behulp van de NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe de CFDA te laden in verschillende sites van de onderste delen van Arabidopsis. Vervolgens presenteren we de resulterende distributie patroon van CF in de scheuten.

Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

Extracellulaire glutamaat-geactiveerde systemische calcium signalering is van cruciaal belang voor de inductie van plantenverdedigingsreacties op mechanische wond- en herbivore-aanval in planten. Dit artikel beschrijft een methode om de ruimtelijke en temporele dynamiek van beide factoren te visualiseren met behulp van Arabidopsis thaliana-planten die calcium- en glutamaatgevoelige fluorescerende biosensoren uitdrukken.

Wide-Field, Real-Time Beeldvorming van lokale en systemische wondsignalen bij Arabidopsis

Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Niet-invasieve test voor bepaling van de kinetiek van chlorofylbiosynthese tijdens vroege stadia van de-etiolatie van Arabidopsis

Dit is een demonstratie van hoe biologische membranen kan worden begrepen het gebruik van elektrische modellen. We tonen ook aan procedures voor de registratie actiepotentialen uit het ventrale zenuw snoer van de rivierkreeft voor student-georiënteerde laboratoria.

Modelleren van biologische membranen met Circuit Boards en meten van elektrische signalen in Axonen: Student Laboratorium Oefeningen

Leer een methode om calciumsignalen in Arabidopsis te monitoren op cellulair en geheel-plant niveau met behulp van genetisch gecodeerde indicatoren. Deze techniek biedt inzicht in plantreacties op abiotische stress.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca^{2 +} Signalen in Arabidopsis Planten

Meer video's verkennen