Name: Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer anastasis detecteren in zoogdiercellen met live-cell microscopie en biosensoren. Deze methode volgt omkering van apoptose na cytochroom c-release en caspase-activatie voor inzicht in celoverleving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann en Rev. Dr. James Voelz voor het suggereren van het woord &quot;Anastasis&quot; om omkering van apoptose te beschrijven; Douglas R. Groen voor HeLa-cellen die op stabiele wijze cytochroom c-GFP; Charles M. Rudin en Eric E. Gardner voor H446 cellen; Heather Lam voor hulp in cartoon tekening op de video; Yee Hui Yeo voor waardevolle bespreking van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), de Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright beurs 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation fellowship (HLT), NIH verleent NS037402 (JMH) en NS083373 (JMH), en Universitaire Commissie Subsidies van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Anastasis verwijst naar het verschijnsel waarbij cellen die celdood route geactiveerd vervolgens omgekeerde stervensproces en overleven. Hier hebben we aangetoond dat live cell imaging kan worden gebruikt om te bevestigen dat het dezelfde individuele cellen in feite apoptotische celdood proces om te keren in een laat stadium, en dan verder overleven en reproduceren. De protocollen worden enkele geoptimaliseerde celtypespecifieke behandelingsomstandigheden apoptose induceren en maken een groot deel van de cellen aan de o...

Apoptose (Grieks voor &quot;vallen tot de dood&quot;) wordt over het algemeen aangenomen dat het een one-way proces eindigt in cel zelfmoord 1-7 zijn. Genetische verstoring van pro-dood-genen resulteert in de overleving van extra cellen die anders zouden sterven in gehele dieren, waaronder cellen die reeds de apoptose pathway 8,9 hebben geopend. Ook genetische manipulaties laat gezonde cellen van zoogdieren die op kunstmatige wijze weer te geven &quot;eet me&quot; signalen of die hechting verliezen hun extracellulaire matrix tot de dood door hele cellen fagocytose of entosis respectievelijk 10,11 ontsnappen. Echter, wij en anderen hebben aangetoond dat zonder genetische manipulatie normale gezonde zoogdiercellen en cellijnen kunnen herstellen van de vroege stadia van apoptose 12-15. Gebruik van tools om individuele cellen te volgen, hebben we verder aangetoond herstel van late stadia van apoptose 12,13, na cellen belangrijke checkpoints die typisch zijn verstrekenly markeren de &quot;point of no return&quot; 2-6. Deze checkpoints van laat stadium apoptose omvatten mitochondriale release van cytochroom c, activering van caspases, nucleaire fragmentatie, en de vorming van apoptotische lichamen. Wij keurden een Grieks samengesteld woord &quot;Anastasis&quot;, wat betekent &quot;oplopend tot leven&quot;, om deze omkering van apoptose beschrijven aan de rand van celdood 2-6. Tenzij de gehele stervenden-herstelproces wordt waargenomen door live cell imaging, is het een uitdaging om cellen die Anastasis uit cellen die nooit meegemaakt apoptotische gebeurtenissen hebben ondergaan onderscheiden. Decennia van werk is gebleken dat de morfologische kenmerken van de cel zelfmoord door apoptose worden gedreven door evolutionair geconserveerde biochemische en moleculaire gebeurtenissen 16-19. Deze gebeurtenissen bevorderen zelfvernietiging van cellen om ontwikkelings- en homoeostatic processen in eencellige en meercellige organismen te reguleren door het elimineren van beschadigde of dangerous cellen 16-19. Terwijl apoptotische cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door standaard morfologische, biochemische en moleculaire manifestaties van apoptose 1,5,6,16,20, momenteel is er geen bekende marker specifiek Anastasis 12,13. Belangrijk cellen die anastasis hebben ondergaan lijken normale gezonde cellen, en cellen die net beginnen omkeren apoptose verschijnen apoptotische stervende cellen 12,13 zijn. Zo worden nieuwe instrumenten nodig zijn om met zekerheid dat een bepaalde overlevende cel eerder had meegemaakt actieve apoptotische processen. Apoptose wordt algemeen aangenomen als een onomkeerbare cascade omdat het een snelle en massale vernietigingsproces. Hoewel het enkele minuten zou kunnen nemen om voor sommige cellen om apoptose te starten, zodra mitochondriën apoptotische factoren zoals cytochroom c in het cytosol 21,22 hebben vrijgegeven, kan caspasen worden geactiveerd binnen 5 minuten 23,24, gevolgd door cytoplasmatische ennucleaire condensatie binnen 10 min 25-27, en celdood kort daarna 25-27. Geactiveerde caspasen orkestreren apoptose door splitsing en inactiveren belangrijke structurele en functionele componenten ten behoeve van cellulaire afbraak 2,28, zoals endonuclease inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen activeert ook pro-apoptotische factoren, zoals Bcl-2 familielid BID, die translokeert mitochondriën mitochondriale afgifte van cytochroom c 31,32 bevorderen. Caspaseactiviteit resulteert ook in celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine als een &quot;eet me&quot; signaal voor het bevorderen van afblazen van stervende cellen door macrofagen of buur cellen via fagocytose 33. Bovendien apoptotische gebeurtenissen maken mitochondriën disfunctioneel, verstoren cellulaire bio-energetica en metabolisme 34,35,36. Zo, het herstel van de vernietiging lijkt intuïtief onwaarschijnlijk. Anders originele verwachtenties, kunnen cellen de apoptotische celdood proces om te keren, zelfs in een laat stadium. Door het continu bewaken van het lot van de stervende cellen in cultuur, zagen we de omkeerbaarheid van laat stadium apoptose in een reeks van primaire cellen en cellijnen 12,13. Verwijdering van de dood stimulans toegestaan ​​herstel van de openlijke kenmerken van apoptose, zoals mitochondriale fragmentatie, chromatinecondensatie, DNA-schade, plasmamembraan blebbing, celoppervlak blootstelling van fosfatidylserine, vrijkomen van mitochondriale cytochroom c, caspaseactivering, kernfragmentatie, cel krimp, en de vorming van apoptotische lichamen. Deze waarnemingen verhogen onbeantwoorde vragen over de functies, gevolgen en mechanismen van Anastasis. Om deze vragen te beantwoorden, een voorwaarde is om betrouwbaar cellen die Anastasis hebben ondergaan identificeren. Hier beschrijven we live microscopie methoden en een caspase biosensor voor de detectie van cellen die eerder omgekeerd laat stadium apoptose en then overleefde.

<table><tbody><tr><td>LSM780 confocal microscopy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparent CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 independent medium</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescently labeled annexin V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategieën voor tracking anastasis, a cell survival verschijnsel dat apoptose keert

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Grieks voor &quot;oplopend tot leven&quot;) verwijst naar het herstel van stervende cellen. Voordat deze cellen terug te krijgen, hebben ze gepasseerd belangrijke checkpoints van apoptose, waaronder mitochondriale fragmentatie, release van mitochondriale cytochroom c in het cytosol, de activering van caspases, chromatinecondensatie, DNA-schade, kernfragmentatie, plasmamembraan blebbing, celinkrimping, blootstelling celoppervlak fosfatidylserine en vorming van apoptotische lichamen. Anastasis kan optreden wanneer apoptotische stimuli voor het overlijden worden verwijderd, waardoor stervende cellen apoptose en mogelijk andere dood mechanismen te keren. Daarom lijkt Anastasis om fysiologische genezingsprocessen dat ook zou kunnen ondersteunen beschadigde cellen op ongepaste wijze te betrekken. De functies en mechanismen van Anastasis zijn nog onduidelijk, gehinderd gedeeltelijk door de beperkte hulpmiddelen voor het opsporen van gebeurtenissen uit het verleden na het herstel van de ogenschijnlijk gezonde cellen. Strategieën om Anasta detecterensis zal onderzoeken van de fysiologische mechanismen, de gevaren van ondoden cellen bij de ziekte van pathologie, en mogelijke therapieën mogelijk te Anastasis moduleren. We beschrijven hier effectieve strategieën met levende cel microscopie en zoogdieren caspase biosensor voor het identificeren en volgen anastasis in zoogdiercellen.

Om de omkering van apoptose bestuderen, worden weefselcultuurcellen eerst blootgesteld aan een dood stimulans voor apoptose in gang. Wanneer de cellen vertonen kenmerken van apoptose, wordt vers kweekmedium vervolgens op wegspoelen van de stimulus en incubeer de stervende cellen te herstellen (figuur 1A) mogelijk. Hier, de hamvraag wordt aangepakt, is hoe ver de individuele stervende gekweekte cellen kan evolueren in de richting van apoptose ondergaan Anastasis nog steeds. Deze vraag kan definitief word...

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Het algemene doel van deze procedure is om de omkering van het apoptotische celdoodproces en gekweekte cellen te detecteren en te volgen door middel van live cel microscopie. Gezonde cellen verspreiden zich op het substraat en bevatten tubulaire filamenteuze mitochondriën rond de kern. Wanneer cellen echter zelfmoord plegen door middel van apoptose, vertonen de stervende cellen unieke morfologische kenmerken om de omkering van apoptose te detecteren en te volgen.Cellen worden geplaatst in glazen bodem celcultuur schalen. De volgende stap is het uitvoeren van live celkleuring om mitochondriën en kernen te labelen. Dit maakt het mogelijk om morfologische kenmerken van gezonde en apoptotische cellen te detecteren.Door middel van live cel microscopie worden de gelabelde gezonde cellen vervolgens blootgesteld aan een doodsstimulus om apoptose te induceren. Wanneer apoptose wordt gedetecteerd, worden de stervende cellen gewassen en vervolgens geïncubeerd met vers celcultuurmedium om celherstel mogelijk te maken, live cel beeldvorming wordt gebruikt om de omkering van apoptose en de gevolgen ervan zoals celreparatie en overleven te detecteren en te volgen, respectievelijk, respectievelijk. Apoptose is een type geprogrammeerde celdood die een essentiële rol speelt bij het elimineren van ongewenste of gevaarlijke cellen in ons lichaam.Dit gesynthetiseerde celproces wordt over het algemeen als onomkeerbaar beschouwd omdat eenmaal het is begonnen, de cel zeker zal sterven, echter hebben we ontdekt dat in feite de stervende cel de celdoodproces kan omkeren en vervolgens kan overleven en zich ontwikkelen. Ze hebben mogelijke kritische stappen die gedwongen zijn om het punt van lage terugkeer te zijn, zoals cyto C, release, case-based activering, nucleaire fragmentatie en apoptotische lichaamsvorming. Na overleg met Griekse experts hebben we een term geadopteerd, een stasis, wat opleving van het leven betekent.Om het fenomeen van het omkeren van apoptose en andere celdoodprocessen te beschrijven, is anthesis moeilijk te detecteren omdat de cel die de apoptose omkeert eruitziet als normale gezonde cellen. Echter, door continue live cel microscopie, kunnen we anastasis detecteren die plaatsvindt in een groot deel van de cellen. Het beheersen van deze techniek is belangrijk omdat het ons in staat stelt om de herschepping van anthesis te bestuderen.We stellen voor dat anthesis mogelijk schade aan het weefsel kan genezen, maar het zou ook beschadigde cellen kunnen toestaan om te overleven en kankers te vormen. Daarom zou het identificeren van mechanismen die anesthesie controleren ons nieuwe benaderingen kunnen bieden om injecteerbare ziekten zoals kanker, hartfalen en degeneratie te behandelen door celdood en overleving te mediëren Om anastasis te detecteren en te volgen. Na apoptotic gebeurtenissen wordt time-lapse live cel microscopie uitgevoerd om te volgen welke cellen apoptose kunnen omkeren na inductie van tijdelijke celdood.Om te beginnen, voegt u één milliliter poly de lycine oplossing toe aan een 35 millimeter celcultuur schaal met een dunnere glazen bodem. Na een minuut incubatie om het glazen oppervlak te coaten, zuigt u de oplossing op en wast u het glas met twee milliliters fosfaat gebufferd zoutoplossing Om cellen voor te bereiden, probeert u eerst trypsine, heela cellen bij 80 tot 90% confluëntie Na het loslaten van de cellen, voegt u 10 milliliter 37 graden Celsius medium toe om de cellen te suspenderen. Vervolgens brengt u de cel suspensieoplossing over naar een 10 milliliter steriele buis om te centrifugeren bij 160 keer G gedurende één tot twee minuten.Na de centrifugatie, zuigt u voorzichtig het medium op. Verstoren de cel pellet niet op de bodem van de buis. Ga verder met het opnieuw oplossen van de cellen met 10 milliliter celcultuur medium door voorzichtig te pipetteren.Vervolgens ziet u twee milliliters van de gesuspendeerde cellen op 35 millimeter voorgecoat glazen bodem celcultuur schalen. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende een dag.Het aanpassen van het aantal cellen kan noodzakelijk zijn zodat de cellen 80% confluëntie kunnen bereiken op het moment van beeldvorming. Mitochondriale en nucleaire fragmentatie zijn de morfologische kenmerken van apoptose. Om mitochondriën en kernen te visualiseren, voert u kleuring uit kort voordat u live cel beeldvorming uitvoert.Begin de kleuringsprotocol door eerst twee microliters mitochondriale kleurstof toe te voegen. MIT tracker rood 50 micromolar stockoplossing, en twee microliters DNA kleurstof hooked 3 3 3 4 2 10 milligram per milliliter stockoplossing in een steriele micro centrifugeerbuis, voeg een milliliter van het geconditioneerde cultuurmedium van de celcultuur schaal toe aan de micro centrifugeerbuis en meng goed met de kleurstoffen door te pipetteren. Voeg vervolgens het mengsel terug toe aan de cultuurschaal.Na het incuberen van de schaal bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 20 minuten, zuigt u het medium op en wast u de gekleurde cellen drie keer met één milliliter warm celcultuur medium of fosfaat gebufferde zoutoplossing. Vervolgens incubeer de cellen met celcultuur medium bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende nog eens vijf minuten. Vermijd langdurige kleuringstijd, aangezien niet-specifiek achtergrondsignaal van de gekleurde cellen kan toenemen door overkleuring.Na de incubatie, zuigt u het medium op, wast u de cellen opnieuw en gaat u verder met het incuberen van de cellen met twee milliliters celcultuur medium bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. De microscoopcomponenten moeten thermo-evenwicht bereiken om de drift van focus en verschuiving van het XY-vlak te voorkomen als gevolg van thermische uitzetting en contractie van de componenten. Om ervoor te zorgen dat thermo-evenwicht is bereikt, zet u de omgevingscontrolekamer en stage incubator aan om de microscoop voor te verwarmen tot 37 graden Celsius ten minste twee uur voordat de beeldvorming begint.Zet vervolgens de koolstofdioxide regelaar aan om 5% koolst

strategies-for-tracking-anastasis-cell-survival-phenomenon-that

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een eenvoudig protocol om gebieden van geprogrammeerde celdood (PCD) in muizenembryo's en onderscheidende embryonale stamcellen (ES) celkweken met een sterk oplosbare kleurstof genoemd LysoTracker visualiseren.

Het gebruik van LysoTracker tot geprogrammeerde celdood detecteren in embryo&#39;s en differentiëren van embryonale stamcellen

Bijdrage van de ACF chromatine remodeling factor E4orf4-geïnduceerde celdood werd gemeten. Het protocol omvat selectie celklonen waarin doxycycline induceert voorwaardelijke knockdown van de ACF subeenheden Acf1 en SNF2h en het gebruik van de DAPI assay E4orf4 geïnduceerde celdood meten in de induceerbare cellijnen.

Voorbereiding van Cell-lijnen voor Conditional Knockdown van genexpressie en meting van de Knockdown Effecten op E4orf4-geïnduceerde celdood

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van intracellulaire signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd in levensvatbare cellen door fysische interactie met aangrenzende dode of stervende cellen. Het protocol richt zich op signaaltransductie-gebeurtenissen die worden geïnduceerd door receptor-gemedieerde herkenning van de dode cellen, in tegenstelling tot hun fagocytische opname of afgifte van oplosbare mediatoren.

Identificatie van intracellulaire signalering Events Induced in levensvatbare cellen door de interactie met naburige cellen ondergaan apoptotische celdood

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van apoptotic borstkankercellen door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en de overgang van niet-stam borstkankercellen aan stamcel-achtige borstkankercellen na apoptosis omkering verder kan worden opgespoord door stroom cytometry.

Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering

De gepresenteerde methode combineert de kwantitatieve analyse van DNA Double-strand Breaks (DSBs), celcyclus verdeling en apoptosis om de celcycluspecifieke evaluatie van de inductie en reparatie van DSB mogelijk te maken, evenals de gevolgen van herstel fouten.

Celcyclus-specifieke meting van γH2AX en apoptosis na genotoxische stress door flow Cytometrie

Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Leer anastasis detecteren in zoogdiercellen met live-cell microscopie en biosensoren. Deze methode volgt omkering van apoptose na cytochroom c-release en caspase-activatie voor inzicht in celoverleving.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Meer video's verkennen