Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Het algemene doel van deze procedure is om geneesmiddelresistente mutaties te identificeren en valideren. Dit wordt bereikt door eerst een willekeurige mutatiebibliotheek van het beoogde oncogene te maken. De tweede stap is het uitvoeren van in vitro screening op het ontstaan van resistente klonen.

De derde stap van de procedure is het sequencen van de resistente klonen om resistente mutaties te identificeren. De laatste stap is het valideren van de resistente mutaties door de mutaties opnieuw te maken met behulp van gerichte mutagenese, gevolgd door in vitro en in vivo assays. Uiteindelijk kunnen klinisch relevante geneesmiddelresistente mutaties worden geïdentificeerd tegen een bepaald geneesmiddel-doelwitpaar.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ENU of PCR-gebaseerde methoden is dat deze onbevooroordeeld is en, in tegenstelling tot PCR-gebaseerde METAGENE ssis, niet beperkt is tot de grootte van het oncogene of het GC-gehalte van elk gen. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze techniek worstelen vanwege een gebrek aan kennis van moleculaire en celbiologie. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.

Omdat neogenese en screeningsstappen moeilijk te leren zijn. Het komt doordat veel mensen geen ervaring hebben met virale productie, celcultuur en semi-celmedia. Deze procedure begint met de transformatie van XL one red e coli cellen met een plasmide dat JAK two V 617 f, een oncogene isovorm van JAK two bevat. XL one red e coli cellen zijn defect in DNA-herstelmechanismen, waardoor ze willekeurige mutaties kunnen incorporeren tijdens de replicatie.

Meng 50 tot 100 nanogram plasmide-DNA met 100 microliter competente cellen in een voorgekoelde polypropyleen buis. Gebruik niet meer dan 100 nanogram DNA omdat dit de transformatie-efficiëntie verlaagt. Incubeer 30 minuten op ijs, zachtjes elke vijf minuten schudden voor een goede bibliotheekdekking.

Gebruik vier tot zes buizen met competente cellen. Dompel de polypropyleen buizen gedurende 45 seconden in een waterbad van 42 graden Celsius voor een hitteschok en incubeer vervolgens twee minuten op ijs. Voeg vervolgens een milliliter SOC-medium toe aan elke buis.

Incubeer de buizen gedurende 90 minuten op 37 graden Celsius met schudden bij 225 tot 250 RPM. Plaat cellen op vier 10 centimeter LB auger platen met 100 microgram per milliliter ampicilline. Incubeer de platen gedurende 16 tot 24 uur op 37 graden Celsius.

Zodra kolonies zichtbaar zijn, verzamel ze door de platen te schrabben met een steriele platenschraper. Combineer de cellen van elke plaat. Vervolgens wordt het plasmide-DNA geïsoleerd met behulp van een commercieel plasmide-extractiekit en wordt de heterogeniteit van mutaties in de bibliotheek beoordeeld door sequencing een dag vóór de transfectieplaat, vier keer 10 tot de zesde HEK 2 93 T cellen, op 100 millimeter schalen in DM EM met 10%FCS, penicilline, streptomycine en twee millimolair L-glutamine.

De volgende dag bereid de transfectiereagentia voor voor elke 100 millimeter schaal. Meng vijf microgram van de plasmidebibliotheek, vijf microgram van een retroviraal verpakkingsplasmide en 40 microliters FU-gen tot een totaal volume van 400 microliters met behulp van serumvrij DM E EM-medium. Incubeer het DNA en de lipidenmix gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.

Vervolgens vervangt u het medium van de HEK 2 93 T cellen door vers medium en voegt u het DNA-lipidencomplex druppelsgewijs bovenop de cellen toe. Incubeer gedurende zes uur op 37 graden Celsius. Na zes uur vervangt u het transfectiemedium door vers medium en incubeer de platen 48 uur op 37 graden Celsius per virusproductie.

Na 48 uur incubatie, verzamel de virale supernatanten die zijn gefilterd door een 0,45 micrometer acro disc-filter om de procedure voor het screenen en identificeren van geneesmiddelresistente JAK two V 607 F mutanten te starten. Transduceer BAF drie cellen met de retrovirale supernatanten. Meng 100 miljoen BAF drie cellen met 100 milliliter virussupernatant tot een totaal volume van 300 milliliter met behulp van RPMI-medium met 10% serum en polybrein. Verdeel dit mengsel van cellen en virussupernatant over meerdere zes-well platen en vul elk putje met vier tot vijf milliliter.

Centrifugeer de platen gedurende 90 minuten bij 1.250 GS op 37 graden Celsius. Na centrifugatie, incubeer de platen gedurende 24 uur op 37 graden Celsius. De volgende dag verzamelt u de getransduceerde cellen voor elke geneesmiddelconcentratie. Meng 10 milliliter cellen met ruxolitinib in een 50 milliliter buis.

De concentraties van ruxolitinib die in dit voorbeeld zijn getest, zijn 1 5 2 0,5 en 10 micromolair. Breng het volume aan tot 40 milliliter met behulp van RPMI met 20% serum. Voeg 10 milliliter 1,2% auger toe aan de cellen en meng voorzichtig. Plaat in zes-well platen.

Deel per putje vier milliliter uit. Incubeer de platen gedurende twee weken op 37 graden Celsius. Zodra resistente kolonies zichtbaar zijn, gebruikt u 0,2 milliliter pipettentips om de kolonies op te pikken en individueel te subcultiveren.

In 24-well platen gedurende drie tot vier dagen, oogst u de resistente BAF drie cellen door centrifugatie bij 450 GS gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Na isolatie van het genomische DNA met behulp van een commercieel genomisch DNA-extractiekit, versterkt u het volledige JAK two CDNA van het genomische DNA door PCR. De PCR-producten worden vervolgens gescheiden door middel van Agar Rose's gelelektroforese en de 3,4 KILOBASE DNA-band.

Die het JAK two coating frame vertegenwoordigt, wordt geïsoleerd met behulp van een commercieel gelextractiekit. Sequence vervolgens het volledige CDNA met behulp van acht interne primers die de coderende sequentie beslaan en analyseer de sequenties met behulp van commerciële software om geneesmiddelresistente mutaties te valideren. In vitro geselecteerde varianten worden gegenereerd door gerichte mutagenese van de JAK two V 617 F sequentie en opnieuw geïntroduceerd in BAF drie cellen