Name: Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer sensorische neuronen isoleren en kweken uit kippenembryo's voor neurobiologisch onderzoek. Deze methode biedt een betrouwbaar platform om neuronale groei en ontwikkeling te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Alison Philbrook, Belinda Barbagallo en Michael Francis bedanken voor inzichtelijke reacties op dit papier. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een R15 AREA award 1R15NS070172-01A1 toegekend aan MLL.

1 Coverslip Voorbereiding: Acid Wash en Bake <ol><li> Minstens 2 dagen voor dissectie (stap 2), begint de volgende stappen uit om dekglaasjes bereiden. Voer de zure wasstap om oliën en grondig schoon dekglaasjes verwijderen. </li><li> Load dekglaasjes in porseleinen houder die verticaal positioneert dekglaasjes en voorkomt dat ze elkaar raken. Dompel houder en dekglaasjes in glas histologie container gevuld met 2 M zoutzuur (HCl). Als alternatief, als porselein houder niet beschikbaar, verspreid ~ 20 dekglaasjes horizontaal onderaan 100 mm glazen petrischaal dekken en dompel dekglaasjes in 2 M HCl. </li><li> Plaats glazen vat (met dekglaasjes ondergedompeld in zuur) op rocker tafel in zuurkast en laat zacht schommelen gedurende minstens 5 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief, zure was coverslips nacht onder dezelfde voorwaarden. </li><li> Was dekglaasjes met gedestilleerd H2 O (dH 2 O) door overdracht porseleinen houder loadedmet dekglaasjes van 2 M HCl om een schone glazen histologie bak met dH 2 O. Als alternatief, decanteren 2 M HCl van glas petrischaal met dekglaasjes en opnieuw vullen met dH 2 O. </li><li> Was door decanteren dH 2 O opnieuw en opnieuw vullen glazen vat met verse dH 2 O. Herhaal dit voor een totaal van 3 snelle wasbeurten. </li><li> Begin langer wassen regime door terug te keren glazen vat (met dekglaasjes en dH 2 O) op de wip. Zorg voor zacht schudden gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens giet dH 2 O en voeg verse dH 2 O. Herhaal voor een totaal van ten minste tien wassingen. Als alternatief blijven wassen &#39;s nachts. </li><li> Plaats gewassen dekglaasjes in oven voorverwarmd tot 350 ° C. Bij gebruik van porseleinen houder, verwijder de houder van dH 2 O-gevulde glazen container en plaats dan de houder met dekglaasjes direct in de oven. Bij gebruik van een glazen petrischaal, decanteren dH 2 O en plaats de glazen schaal met dekglaasjes in de furnace. </li><li> Bak dekglaasjes gedurende ten minste vijf uur of overnacht bij 350 ° C. </li><li> Na het bakken is voltooid, verwijdert dekglaasjes van porseleinen houder met fijn pincet en plaats in steriele 100 mm glazen petrischaal. Laat dekglaasjes die oorspronkelijk werden geplaatst in porseleinen houder in de glazen petrischaal. </li></ol> 2 Chick Dissection en Isolatie van DRG&#39;s <ol><li> Verwijder vruchtbare, geënsceneerd Witte Leghorn kuiken ei incubator (gehouden op 37-38,5 ° C met zachte wiegen). OPMERKING: Eerdere studies hebben embryonale dag 7-10 gebruikt voor de isolatie van DRG&#39;s 2,8,11-13,16. </li><li> Plaats geselecteerde ei in laminaire stroming kap. Over tot alle hierna onder aseptische omstandigheden in de laminaire stroming kap met steriele oplossingen en instrumenten opgenomen procedures. Voorverwarmen alle oplossingen in een 37 ° C waterbad. </li><li> Crack ei en plaats inhoud in een plastic 100 mm petrischaal. Gebruik standaard tang om embryo naar een andere 100 mm petrischaal. </li><li&gt; Met behulp van een Pasteur pipet opgewarmd 1x PBS om petrischaal om weefsel nat te houden. Onthoofden embryo door knijpen hals met fijne tang. Transfer naar het andere lichaam schoon 100 mm petrischaal. </li><li> Voeg warm F12HS10 (Ham&#39;s F12, 10 mM HEPES, 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 10% foetaal runderserum) om schotel met Pasteur pipet om weefsel nat te houden. Gebruik een tang om embryo positioneren op de dorsale zijde (figuur 1A). </li><li> Plaats 100 mm plastic petrischaal met embryonaal weefsel op een verrekijker StereoVision dissectiemicroscoop in laminaire stroming kap. Gebruik fijne tang om een ​​verticale middellijn incisie staart hals maken door afklemmen van de ontwikkeling dermis naar het hart, longen en andere organen bloot. Daarnaast kunt u een reeks van kleine scheurtjes aan de interne organen bloot. </li><li> Gebruik voorzichtig 2 sets van steriele fijne tang om: a) grijpen de hals en b) grijpen de aorta of ander weefsel onmiddellijk boven het hart en trek naar de staart,uithalen van het dier. </li><li> Solliciteer warm F12HS10 met Pasteur pipet om weefsel. Gebruik een tang om alle resterende cardiovasculaire, respiratoire of spijsverteringsorganen verwijderen om de ontwikkeling van ribben, wervelkolom en DRG&#39;s (figuren 1B-1D) bloot te leggen. </li><li> Onder de microscoop ontleden Gebruik fijne tang organen verder te verwijderen en laat DRG langs beide zijden van de lumbale wervelkolom, inferieur aan de ribben. Verzamel DRG&#39;s door het plukken intact DRG&#39;s van het embryo. Knijp en scheiden de wortels die reiken van de DRG naar het ruggenmerg en grijpen het ontwikkelen zenuw die zich uitstrekt van de DRG naar de periferie of vice versa. </li><li> Plaats intact DRG&#39;s in een 35 mm cultuur schotel gevuld met warm F12HS10. Verwijder overtollig weefsel, zoals de dorsale en ventrale wortels kan hebben gehouden DRG, uit de intacte DRG in 35 mm schaal door knijpen met fijne pincet. </li><li> Om DRG&#39;s superieur aan de lumbale regio te verkrijgen, verwijder de ventrale helft van de thoracale en cervical wervelkolom. Dit gebeurt door een snede in de ontwikkeling wervelkolom loodrecht op het ruggenmerg as in het bovenste cervicale regio en een verlaging van de bovenste lumbale gebied. Maak dan evenwijdig met het ruggenmerg as langs de rechter en linkerzijde van de wervelkolom. Til de ventrale helft van de wervelkolom van het embryo, dat de bloot bloot het ruggenmerg (figuren 1E-1F). </li><li> Om gemakkelijk toegang tot DRG&#39;s toe te staan, verwijder de thoracale en cervicale ruggenmerg door grijpen het ruggenmerg met een fijne tang. Gebruik de tang om het ruggenmerg te bevrijden van de wervelkolom. Bij benadering van de thoracale ruggenmerg op het niveau van ribben en het cervicale gebied is superieur aan de ribben. </li><li> Verzamel intact thoracale en cervicale DRG&#39;s met fijn pincet en plaats ze in warm F12HS10 met andere DRG&#39;s. Verwijder overtollig weefsel dat kan voldoen aan DRG&#39;s. </li><li> Spoel interieur van een nieuwe glazen Pasteur pipet met F12HS10 te helpenvoorkomen DRG&#39;s kleven aan de wanden van de pipet. Gebruik gespoeld pipet om alle DRG&#39;s en F12HS10 overbrengen van kleine petrischaal met een steriele 15 ml conische buis en meteen doorgaan naar stap 3. LET OP: Extra embryo&#39;s kunnen worden ontleed om het aantal DRG&#39;s te verhogen. DRG moeten F12HS10 worden bewaard bij 37 ° C tot klaar voor stap 3. </li></ol> 3 Dissociatie, Verrijking, en het kweken van DRG neuronen - Deel 1 <ol><li> Plaats conische buis met intacte DRG in centrifugebuis en voorzichtig centrifugeren (200 x g) gedurende 2-3 minuten. Bevestigen dat DRG gezonken naar onderkant van de buis. Zo niet, nogmaals spelen. </li><li> Met behulp van een pipet, verwijder voorzichtig F12HS10, waardoor DRG pellet ongestoord. Voeg 2 ml 1x calcium en magnesium-gratis (CMF) PBS, loskomen van de pellet van DRG&#39;s. Spin opnieuw en verwijder CMF PBS terwijl de DRG pellet intact. Herhaal deze wasstap voor een totaal van drie wasbehandelingen met foetaal runderserum in F12HS10, die afbreuk doen aan trypsine digestie in de volgende stap verwijderen. </li><li> Voeg 2 ml trypsine verwarmd tot 15 ml buis met 2 ml CMF PBS en DRG. Plaats tube 37 ° C waterbad gedurende 10-15 min DRG verteren in gedissocieerde cellen. </li><li> Tijdens incubatie maken F12H + supplement bevattende media (Ham&#39;s F12, 10 mM HEPES 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamine en N2) en warm bij 37 ° C waterbad. Typisch, 10 ml totaal medium volstaat 4-5 35 mm schalen van primaire sensorische neuronen. Ook beginnen ontdooien laminine-1 voor coating dekglaasjes (stap 4). </li><li> Zachtjes wrijf DRG&#39;s in trypsine-oplossing met p1000 pipet en visueel te inspecteren op de afwezigheid van intacte DRG&#39;s. Verder aanwrijven totdat intact DRG niet meer worden gezien op het oog en / of zorgen voor langere incubatie in trypsine 37 ° C waterbad intact DRG&#39;s worden gescheiden. Om DRG neuronen beschermen tegen schade tijdens tritureren luchtbellen te voorkomen en te beperken trypsine digestie tot &lt;30 min. </li><li> Centrifuge buis met gedissocieerd DRG en trypsine bij 200 xg gedurende 3-5 minuten tot pellet te vormen. Spin langer indien nodig tot pellet gevormd. </li><li> Aspireren trypsine zorgvuldig zonder verstoring van pellet. Voeg 2 ml van F12HS10 om neer te slaan. Zachtjes vermaal DRG met een P1000 pipet tip. </li><li> Breng alle inhoud van 15 ml conische buis in 100 mm cultuur schotel. Spoel de buis met 8 ml F12HS10 en overbrengen naar de kweekschaal, 2 ml per keer voor een totaal van 10 ml. Deze spoelen stap helpt verzamelen cellen die kunnen zijn gebleven gehandeld op de wanden van de buis. </li><li> Breng 100 mm kweekschaal (met 10 ml F12HS10 en gedissocieerde cellen DRG) in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende 3 uur. OPMERKING: CO 2 is niet vereist omdat incubator HEPES buffer pH media bij afwezigheid van CO 2. Tijdens incubatie gliacellen binden aan het oppervlak van weefselkweek plastic en neuronen vaak losjes houden aan gliale bed. </li></ol> 4 Coating Acid Washeden Gebakken Coverslips met Laminin-1 <ol><li> Dooi steriele monsters van bevroren laminin-1 op het ijs. </li><li> Onder steriele omstandigheden, voeg 1 ml steriele PBS tot 1 x 50 pl aliquot van laminine-1. </li><li> Gebruik een spectrofotometer om een ​​absorptiewaarde van laminine-1 verkregen bij 280 nm. Gebruik deze waarde in de volgende vergelijking om de concentratie van laminine-1 te bepalen. </li></ol> ABS 280 = (concentratie mg / ml) * (extinctiecoëfficiënt eiwit) De extinctiecoëfficiënt voor laminin-1 is 0,86. <ol start="4"><li> Onder steriele omstandigheden verdunnen laminine-1 met 1X PBS aan de concentratie 1 mg / ml en 20 mg / ml te verkrijgen. Gebruik beide toegepaste concentraties van laminine-1 een tienvoudige verschil van laminine-1 na incubatie 7,8,10 gebonden aan het dekglaasje (30 ng / cm 2 en 300 ng / cm 2, respectievelijk) verkrijgt. </li><li> In een laminaire stroming kap, gebruik fijne tang om een ​​zuur gewassen en gebakken c plaatsenoverslip in de bodem van een 35 mm kweekschaal. Herhaal deze stappen het aantal benodigde schotels verkrijgen. </li><li> Onderwerpen de dekglaasjes aan UV-licht voor 20-30 min om verder te zorgen voor sterilisatie. Houd schotel deksel eraf tijdens deze stap. </li><li> Voeg 400 ul van voorbereide laminin-1 aan elk glas dekglaasje. Gebruik pipet tip om laminin-1 uitbreiden tot een volledige dekking van het dekglaasje te garanderen. Oppervlaktespanning zal laminine-1 op dekglaasje blijven en niet uitgespreid op bodem van kweekschaal die nodig. </li><li> Plaats deksel op schaal en laat laminine-1 geïncubeerd voor 2-3 uur bij kamertemperatuur (3 uur is optimaal). </li><li> Na laminin-1 incubatie, spoel dekglaasjes op aseptische wijze met steriel PBS in laminaire stroming kap. Verwijder oplossing dekglaasje en voeg 400 ul van PBS. Wacht 5-10 min. Herhaal dit voor een totaal van 3 spoelingen. </li><li> Laat PBS op dekglaasje na de laatste spoeling. Niet breken de oppervlaktespanning tijdens het spoelen en niet toestaan ​​coverslips uitdrogen. Leave deksel op tot het moment van plaat los neuronen op de coverlip. </li></ol> 5 Dissociatie, Verrijking, en het kweken van DRG neuronen - Deel 2 <ol><li> Na incubatie in een 10 ml steriele pipet zachtjes spoelen onderaan 100 mm schotel met gescheiden DRG cellen. Houd gerecht bij ~ 45 ° hoek, trek ~ 7 ml F12HS10 met pipet hulp, dan voorzichtig te verdrijven 7 ml op ongeveer 1/3 van de schotel. Herhaal 5x, zachtjes loskomen neuronen. </li><li> Draai schotel en herhaal spoelen procedure, voor nog eens zes spoelingen, op een ander 1/3 van de schotel. Herhaal de procedure opnieuw voor de resterende 1/3 van de schotel. Zo voorzichtig spoel de gehele onderkant van de schaal met F12HS10 neuronen verwijderen. </li><li> Met behulp van dezelfde pipet F12HS10 bevattende neuronen van 100 mm schaal tot 15 conische buis. Centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 200 g om cellen te pelleteren. </li><li> Verwijder F12HS10, waardoor pellet ongestoord. Resuspendeer pellet met 2 ml opgewarmd F12H + supplementen. </li><li&gt; Gebruik een hemocytometer om celdichtheid bepalen. </li><li> Verdun cellen nodig voorzien F12H + supplementen gewenste plating concentratie (120.000 cellen / ml voor dekglaasjes bekleed met 1 ug / ml laminine-1 en 40.000 cellen / ml voor dekglaasjes bekleed met 20 ug / ml laminine-1, 8,16) te verkrijgen. </li><li> Verwijder de PBS uit laminine beklede dekglaasjes normaal en plaats 400 pl van cellen op dekglaasjes. Overdragen schotel voorzichtig een bevochtigde 37 ° C celkweek incubator. Laat incuberen gedurende ten minste 1 uur en tot 3 uur om neuronen te houden aan laminine-1. </li><li> Onder steriele omstandigheden, zachtjes overspoelen 35 mm gerechten bevattende neuronen met 1,6 ml van F12H + supplementen. Opmerking Momenteel oppervlaktespanning op dekglaasje kan worden ingeslagen. Neuronen hebben adequaat gehandeld op laminin-1 op dekglaasje. </li><li> Terugkeren cellen incubator en incubeer overnacht. Experimenten uitvoeren zoals immuuncytochemie de volgende dag. </li></ol> 6 Immunocytochemistry <ol><li> Vóór immunocytochemie, warm fixatief (4% paraformaldehyde, 30% sucrose 2X PBS) bij 37 ° C waterbad. OPMERKING: Voor de vaststelling van de cellen, te behandelen met verschillende reagentia, zoals netrine-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorines en ephrin 16,29-31. </li><li> Verwijder langzaam 1 ml van de 2 ml F12H + supplementen van kweekschaal. Voeg voorzichtig 1 ml opgewarmd fixeeroplossing. Laat incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig fixatief oplossing en voeg 2 ml PBS. Solliciteer oplossing richting de rand van de schaal, het vermijden van mogelijke loskomen van vaste cellen als gevolg van toepassing van PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Herhaal PBS wassen voor een totaal van 5 wasbeurten. Sta niet toe dat cellen drogen tijdens elke stap van immunocytochemie. </li><li> Verwijder PBS. Breng 1 ml blokkeeroplossing (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normaal geit serum). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. U kunt ook aan de oppervlakte moleculen vlekken, Weet Triton-X niet in het blokkeren oplossing 8. </li><li> Verdunnen primaire antilichamen in het blokkeren oplossing per aanbeveling fabrikant. Gebruik 1: 500 voor antilichamen tegen NCAM en geactiveerd β1 integrines 16. Verwijder de blokkerende oplossing, 1 ml primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder primaire antilichaam oplossing en 2 ml 1X PBS. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit voor een totaal van 4 PBS wasbeurten. Wasbeurten kan worden verlengd, indien nodig. </li><li> Verdun secundair antilichaam 1: 1000 in blokkeeroplossing. Verwijder PBS, 1 ml secundair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. OPMERKING: secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Een oplossing en cellen in het donker zoveel mogelijk vanaf dit moment. </li><li> Verwijder secundair antilichaam en spoel 5x met 1x PBS zoals eerder gedaan. </li><li> Solliciteer ~ 60-80 pi FluoromountG op een microscoopglaasje. Met behulp van fijne tang, til dekglaasje uit schotel en lagere dekglaasje in Fluoromount G op objectglaasje. Vermijd luchtbellen. </li><li> Bewaren schuift horizontaal bij 4 ° C in het donker. Na 12-24 uur, zal Fluormount G polymeriseren en dekglaasje zal stevig worden bevestigd aan de microscoop dia. Image cellen na deze polymerisatiestap is voltooid. </li></ol>

<ol><li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+a+century+of+neuron+culture%3A+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+journal+of+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).</li>
<li>Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+subtypes+have+unique+substratum+preference+and+receptor+expression+before+target+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).</li>
<li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+way+to+go%3F+Cytoskeletal+organization+and+polarized+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons.</a> Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).</li>
<li>Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in dendritic spines.</a> Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).</li>
<li>Snow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+studies+on+the+mechanisms+of+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration.</a> Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).</li>
<li>Condic, M. L., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+changes+in+integrin+expression+regulate+neuronal+adhesion+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth.</a> Nature. 389, 852-856 (1997).</li>
<li>Lemons, M. L., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+integrin+activation+and+intracellular+cAMP+cause+Rho+GTPase+dependent+growth+cone+collapse+on+laminin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1.</a> Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).</li>
<li>Beller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sensory+neuron+growth+cone+and+filopodial+responses+to+structurally+diverse+aggrecan+variants%2C+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro.</a> Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).</li>
<li>Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+neurons+adapt+to+the+inhibitory+proteoglycan+aggrecan+by+increasing+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).</li>
<li>Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+sensory+neurons+to+hyalectin+and+decorin+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).</li>
<li>Guan, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Netrin-1%2C+Neogenin+and+cUNC-5H3+expression+during+chick+dorsal+root+ganglia+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development.</a> Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).</li>
<li>Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+influences+cell+number+and+the+distribution+of+neuronal+subtypes+in+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia.</a> Developmental biology. 314, 317-328 (2008).</li>
<li>Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+has+a+dual+effect+on+the+growth+of+retinal+ganglion+axons+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).</li>
<li>Kolpak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+guidance+factor-induced+macropinocytosis+in+the+growth+cone+plays+a+critical+role+in+repulsive+axon+turning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).</li>
<li>Lemons, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cAMP+mediate+netrin-induced+growth+cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse.</a> Brain research. 1537, 46-58 (2013).</li>
<li>Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+elevates+cytoplasmic+calcium+in+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons.</a> Developmental biology. 166, 87-100 (1994).</li>
<li>Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+in+the+presence+of+soluble+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CSPG%29%2C+compared+to+behavior+on+CSPG+bound+to+laminin+or+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin.</a> Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).</li>
<li>Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+proteoglycans+in+astroglial+barriers+inhibit+neurite+outgrowth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro.</a> Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).</li>
<li>Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+step+gradient+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CS-PG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG).</a> Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).</li>
<li>Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth%3A+A+light%2C+epifluorescence%2C+and+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921(2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li>
<li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li>
<li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li>
<li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li>
<li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li>
<li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li>
<li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li>
<li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li>
<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
<li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li>
<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren en kweken los sensorische neuronen van een kippenembryo. Deze procedure genereert een verrijkte populatie van stevig groeiende neuronen in vitro 7,8,10,16. Vele cellulaire en moleculaire technieken kunnen worden toegepast op deze gekweekte neuronen, waaronder immunocytochemie, die hier wordt beschreven. Dit protocol werd onlangs gebruikt om de intensiteit van immunologisch actieve integrinen sensorische groei kegels 8,16 kwa...

Neuronen zijn complexe cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, visie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Unieke van andere celtypen, neuronen verlengen arm-achtige processen axonen, essentiële neurale snelwegen communicatie vormen. Tijdens de ontwikkeling van gespecialiseerde compartimenten zich aan de uiteinden van de groeiende axonen, de zogenaamde groei kegels, navigeren door een concert van extracellulaire signalen naar de axon naar de juiste bestemming te leiden. De ingewikkelde moleculaire mechanismen die groeikegel navigatie grondslag liggen zijn niet volledig begrepen. Om beter te begrijpen van deze mechanismen, hebben de onderzoekers gebruikt celcultuur modellen voor neuronen in een gedefinieerde en vereenvoudigde in vitro-omgeving te bestuderen. Studeren neuronen in cultuur 1 heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de neuronale celbiologie waaronder: neuronale differentiatie 2, cytoskelet dynamiek, endocytose en mensenhandel, dendrietregulatie 3,4, axonale regeneratie 5, en klinische aandoeningen zoals neuropathieën 6. Bovendien gekweekte neuronen zeer vatbaar voor diverse onderzoekstechnieken zoals immunocytochemie, celoppervlak co-immunoprecipitatie, Western blot, transfectie, RNAi en levende imaging zoals timelapse analyse van groeikegel motiliteit. Aldus kweken van primaire neuronen is een krachtige aanpak talrijke aspecten van de celbiologie van neuronen helderen. De celcultuur model biedt onderzoekers met gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Bijvoorbeeld kan het substraat waarop neuronen uitgeplaat (en groeien op) gemakkelijk worden gemanipuleerd. Hier geven we gedetailleerde instructies voor het genereren van twee verschillende substraten, een met een lage concentratie laminine-1 en de andere met verzadigende concentraties van laminine-1. Verrassenderwijs kunnen verschillende concentraties van hetzelfde molecuul dramatische effectende interne toestand van neuronen en hun celoppervlak samenstelling. Bijvoorbeeld, intracellulaire niveaus van cAMP en maaivelden integrines significant verschillend in neuronen uitgeplaat op beide substraten 7,8. Aanvullende studies hebben aangetoond dat andere moleculen, waaronder fibronectine en chondroïtinesulfaat proteoglycanen, effect de expressie van celoppervlak moleculen en neuronale motiliteit 7-11. Bovendien oplosbare moleculen zoals neurotrofinen en neurotropins ook gevolgen celmembraan preparaat en neuronale beweeglijkheid 12-16 en kan gemakkelijk en nauwkeurig gemanipuleerd in een cel cultuurmodel. Hier beschrijven we methoden om te isoleren en cultuur los sensorische neuronen van kippenembryo&#39;s. Deze procedure is gebruikt om belangrijke doorbraken in neurobiologie, inclusief axon uitgroei 5,7,8,10,11,16-21 maken en is een modificatie van een procedure die tot ganglioncellen 22 isoleren. Er zijnverscheidene voordelen aan deze aanpak. Ten eerste zijn veel kenmerken van chick dorsale wortel ganglion (DRG) ontwikkeling goed gekarakteriseerd, waaronder de termijn voor de geboorte, axon extensie, en eiwit expressie profielen 2,23-28, waardoor het een leerzame basis waarop te bouwen informatieve in vitro experimenten. Ten tweede, gedissocieerd neuronale kweken kan de onderzoeker directer bestuderen neuronen vergelijking met alternatieve benaderingen waarbij intacte DRG-explantaten (welke neuronen en niet-neuronale cellen bevatten) en / of gemengde kweken die zowel gedissocieerde neuronen en niet-neuronale cellen. Ten derde, de hier beschreven procedure is eenvoudig, goedkoop en vatbaar voor studenten. Daarom kan deze techniek worden gebruikt voor onderzoek en voor onderwijsdoeleinden. Bovendien moet kleine wijzigingen van dit protocol snelle, hoge opbrengst zuivering van neuronen uit andere dan DRGs bronnen toestaan. Bijvoorbeeld kan deze procedure worden aangepast om neuronaal verschaffen Enriched kweken van andere weefsels zoals embryonale voorhersenen of ruggenmerg. Immunocytochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor deze gedissocieerde neuronale kweken en worden in detail beschreven hier. De procedure voor twee immunocytochemie tegen neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) en β1 integrines voorzien. Het genereren van deze immunocytochemische werkwijzen zijn gebruikt om de ruimtelijke patronen en intensiteit van verscheidene moleculen in gekweekte neuronen 8,16 onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Sterile kleine kweekschalen (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Steriel grote kweekschalen (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Steriel grote Petri schotels (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Petri schotel (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0,13-0,17 mm dikte is optimaal voor microscopie</td></tr><tr><td>Porseleinen dekglashouder</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>gebruik 50 ml aliquoten per 500 ml van Ham's F12 media</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>gebruik bij 2 M, kan twee keer worden gebruikt voordat het wordt weggegooid</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>gebruik 5 M NaCl-oplossing voor laminine-1 stamoplossing</td></tr><tr><td>Laminine-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Voeg 72 &micro;l steriele 5 M NaCl toe en verdeel in 50 &micro;l</td></tr><tr><td>15 ml Conische buis</td><td>cell treat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>gebruikt bij 1x, verdun met steriele Millipore gefilterd water</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>gebruikt bij 1x, verdun met steriele Millipore gefilterd water</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum albumine (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>gebruik in F12HS20 bij 10%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>maak steriele 1 M oplossing in gedistilleerd water, verdun in F12 media om de eindconcentratie van 10 mM te verkrijgen</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>gebruik 5 ml in 500 ml van F12 media</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>Voeg 1 ml steriele Millipore water toe, verdeel onder steriele omstandigheden, bewaar bij -20 &deg;C, gebruik bij eindconcentratie van 10 ng/ml in F12H media, bewaar in -20 &deg;C niet ontdooiende vriezer</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD systemen</td><td>256-GF</td><td>Voeg 1 ml steriele 1x PBS toe met 0,1% BSA, verdeel onder steriele omstandigheden, bewaar bij -20 &deg;C, gebruikt bij eindconcentratie van 10 ng/ml in F12H media</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>verdeel onder steriele omstandigheden, bewaar bij -20 &deg;C, gebruik bij eindconcentratie van 200 mM in F12H media</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>verdeel onder steriele omstandigheden, bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Bovien Serum Albumine (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Overige benodigdheden: algemene dissectie-instrumenten, inclusief glazen Pasteur pipets, vruchtbare witte leghorn kippen eieren, controleer eieren incubatie (bevochtigd, 37 &deg;C), cel incubatie kamer (bevochtigd, 37 &deg;C), laminaire stroom kap, binoculaire stereovisie dissectie scope</td></tr><tr><td colspan="4">Immunoctytochemie Reagentia Tabel</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>gebruikt in fixeeroplossing (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>gebruikt in fixeeroplossing (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geiten serum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop slides</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primaire Antilichaam Tabel</td></tr><tr><td>Antilichaam tegen NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>Antilichaam tegen geactiveerde &beta;1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoklonaal</td></tr><tr><td colspan="4">Secundaire Antilichaam Tabel</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van gedissocieerde sensorische neuronen van chick embryo

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neuronen zijn veelzijdige cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Studeren neuronen in vivo kan lastig zijn vanwege hun complexiteit, hun gevarieerde en dynamische omgevingen, en technische beperkingen. Daarom bestuderen neuronen in vitro gunstig kan blijken om de complexe geheimen van neuronen ontrafelen. De goed gedefinieerde aard van celcultuur modellen biedt gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Hier beschrijven we hoe te isoleren, distantiëren, en cultuur primaire neuronen van kippenembryo&#39;s. Deze techniek is snel, goedkoop en genereert stevig groeiende sensorische neuronen. De procedure produceert vaste culturen die sterk verrijkt voor neuronen en heeft zeer weinig niet-neuronale cellen (minder dan 5%). Primaire neuronen niet goed aan onbehandelde glas of weefselkweek plastic derhalve gedetailleerde procedures twee Distin creërenct, goed gedefinieerde-laminin bevatten substrata voor neuronale plating worden beschreven. Gekweekte neuronen zijn zeer vatbaar voor meerdere cellulaire en moleculaire technieken, met inbegrip van co-immunoprecipitatie, live cell verbeelden, RNAi, en immunocytochemie. Procedures voor dubbel immunocytochemie volgende gekweekte neuronen werden geoptimaliseerd en beschreven.

De hier beschreven protocol stelt onderzoekers cultuur een verrijkte populatie van gedissocieerde embryonale sensorische neuronen met zeer weinig (bijvoorbeeld &lt;5%) van niet-neuronale cellen 7,8,10,16. Tal van DRG&#39;s kan worden verkregen bij de lumbosacrale, thoracale en cervicale regio. Afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker, kunnen DRG&#39;s van deze verschillende anatomische gebieden gemakkelijk worden geïsoleerd. Bijvoorbeeld, Figuur 1 toont beelden van het kippene...

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo&#39;s. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Het algemene doel van deze procedure is om een verrijkte populatie van gedissocieerde primaire sensorische neuronen uit kippenembryo's te kweken. Dit wordt bereikt door intacte dorsale wortelganglia te verzamelen van de embryonale dag, zeven tot 10 kippenembryo's in een conische buis, en ze vervolgens op te breken in een gedissocieerde celsuspensie. Als tweede stap worden gedissocieerde DRG-cellen geplaatst op een kweekschaal voor incubatie.Daarna wordt de kweekschaal voorzichtig gespoeld om de neuronen selectief los te maken. De laatste stap omvat het plaatsen van de gedissocieerde sensorische neuronen op de goed gedefinieerde substraten, zoals zuurgewassen en gebakken dekglasjes voorzien van hoge of lage concentraties laminine. Eén immunocytochemie wordt gebruikt om de aanwezigheid van NCA en geactiveerde bèta-een integrinen in de cellichamen, neuriten en groeikegels van de gedissocieerde gekweekte embryonale kippesensorische neuronen te tonen.Deze methode is een krachtig hulpmiddel om talrijke aspecten van neurobiologie te verduidelijken, inclusief mechanismen van axonleiding, groeikegels, cytoskeletaal dynamisch gedrag, evenals celoppervlaktesamenstelling en -regulatie. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om snel culturen te verkrijgen die sterk verrijkt zijn met gedissocieerde sensorische neuronen, die zeer weinig gliacellen bevatten. Dit is anders dan de intacte dorsale wortelgangliaculturen die zowel neuronen als niet-neuronale cellen bevatten.Bovendien zouden kleine variaties van dit protocol een hoge opbrengst van neuronale culturen moeten toestaan van bronnen anders dan dorsale wortelganglia, inclusief embryonaal voorhersenen. In een laminaire stromingshaak kraakt u een gestage vruchtbare witte leghorn kippenei en plaatst u de inhoud in een 100 millimeter petrischaal. Breng vervolgens het embryo over naar een andere 100 millimeter petrischaal.Voeg verwarmde een XPBS toe aan de petrischaal om het weefsel nat te houden. Het embryo wordt onthoofd en het lichaam wordt overgebracht naar een andere schone petrischaal. Verwarmde F 12 HS 10 wordt aan het weefsel toegevoegd.Plaats de petrischaal met embryonaal weefsel onder de dissectiemicroscoop in een laminaire stromingshaak. Maak daarna een verticale middenlijnsnede van de staart tot de nek door de zich ontwikkelende dermis te knijpen om het hart, de long en andere organen bloot te leggen. Met de fijne pincetten grijpt u voorzichtig de nek en de aorta of ander weefsel direct superieur aan het hart en trekt u naar de staart om het dier te ontdoen van ingewanden.Breng vervolgens warme F 12 HS 10 aan op het weefsel om de voorbereiding verder te reinigen en het weefsel vochtig te houden en herhaal de toepassingen van F 12 HS 10 tijdens de dissectie zoals nodig is. Vervolgens verwijdert u alle overblijvende cardiovasculaire, respiratoire of spijsverteringsorganen om de zich ontwikkelende ribben wervelkolom en DRG's bloot te leggen en verzamelt u de DRG's langs beide kanten van de lumbale wervelkolom, inferieur aan de ribben, plukt u de DRG's van het embryo. Dit wordt gedaan door de wortels die van de Dr.G naar het ruggenmerg reiken, te knijpen en af te snijden en de zich ontwikkelende zenuw vanaf de DRG naar de periferie of vice versa vast te grijpen.Plaats vervolgens de intacte DRG's in een 35 millimeter kweekschaal gevuld met warme F 12 HS 10. Verwijder eventueel overtollig weefsel zoals de dorsale of ventrale wortels die aan de DRG's kunnen hechten. Om DRG's superieur aan de lumbale regio te verkrijgen, verwijdert u de ventrale helft van de thoracale en cervicale wervelkolom.Dit gebeurt door een snede te maken in de zich ontwikkelende wervelkolom loodrecht op de ruggenmergas in de bovenste lumbale regio en een andere snede in de bovenste cervicale regio. Maak vervolgens sneden langs de rechter- en linkerkant van de wervelkolom. Gezamenlijk zullen deze sneden de ventrale helft van de wervelkolom losmaken van het embryo en wordt de kolom vervolgens uit het embryo verwijderd om gemakkelijk toegang te krijgen tot de DRG's.Verwijder de thoracale en cervicale ruggenmerg door het ruggenmerg met fijne pincetten vast te grijpen. Verzamel vervolgens de intacte thoracale en cervicale DRG's zoals eerder gedaan, en plaats ze in warme F 12 HS 10 met andere DRG's. Verwijder overtollig weefsel dat aan de DRG's kan hechten.Spoel vervolgens de binnenkant van een nieuw glazen pasterpijpje met F 12 HS 10. Om te helpen voorkomen dat DRG's aan de wand van de pijp blijven plakken. Gebruik de gespoelde pijp om alle DRG's en F 12 HS 10 van de kleine petrischaal over te brengen naar een steriele conische buis van 15 milliliter, aanvullende embryo's kunnen worden gedissected om het aantal DRG's in deze procedure te verhogen. Plaats de conische buis met intacte DRG's in de centrifuge en draai voorzichtig 200 keer G gedurende twee tot drie minuten.Bevestig dat de DRG's naar de bodem van de buis zijn gezonken. Verwijder vervolgens voorzichtig F 12 HS 10, waarbij de DRG-pellet ongestoord blijft. Voeg vervolgens twee milliliter van een X-C-M-F-P-B-S toe om de DRG-pellet los te maken.Spin opnieuw en verwijder de C-M-F-P-B-S terwijl DRG's worden behouden. Herhaal deze wasstap gedurende een totaal van drie wasbeurten. Nadat de wasbeurten voltooid zijn en C-M-F-P-B-S verwijderd is, voegt u twee milliliter verwarmde trypsine toe aan de 15 milliliter buis en disloceert u voorzichtig de DRG's.Plaats vervolgens de buis in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten om de DRG's in gedissocieerde cellen te verteren. Beweeg voorzichtig de DRG's in trypsinoplossing en inspecteer visueel op de afwezigheid van intacte DRG's. Ga door met bewegen totdat intacte DR

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video laat zien hoe axonale paden van genetisch bepaalde groepen neuronen te visualiseren in de embryonale kuiken ruggenmerg gebruik te maken...

Ontcijfering Axonale Pathways van genetisch bepaalde groepen van neuronen in de Chick Neural Tube Door gebruik te maken In ovo Elektroporatie

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

The video demonstrates the isolation of oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons from a transgenic mouse embryo. The embryo expresses motor neurons labeled with a green fluorescent protein (GFP) for easy visualization and identification. The motor neurons are surgically isolated under a fluorescence microscope and maintained in a culture medium.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo

This video demonstrates a method to isolate neurons from the forebrain of an early-stage chick embryo and culture them on a microelectrode array to form a neuronal network.

Isolating and Culturing Chick Embryonic Neurons on a Multi-Electrode Array

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.

Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons

Leer sensorische neuronen isoleren en kweken uit kippenembryo's voor neurobiologisch onderzoek. Deze methode biedt een betrouwbaar platform om neuronale groei en ontwikkeling te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Meer video's verkennen