Name: In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer de in vitro methylatietest om PRMT-substraatmethylering te bestuderen met immunoprecipitatie en SDS-PAGE-analyse. Deze methode biedt betrouwbare inzichten in eiwitargininemodificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een Merit Award van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs, en een NIH verlenen R01CA138528 naar RW.

1 Voorbereiding van de Expression Constructs <ol><li> Voordat het protocol kloon PRMTs in zoogdierlijke expressievectoren met een N-eindstandige epitoop tag (Myc of HA) en het substraat in-frame met glutathion-S-transferase (GST) voor hoogactief eiwitexpressie en zuivering van bacteriële cel lysaten middels standaard moleculair biologische technieken. </li></ol> 2 Zuivering van PRMTs <ol><li> Gebruik 100 mm kweekschalen menselijke bronchiale epitheelcellen (Beas2B) handhaven. Passage van de cellen om de 3 dagen en laat ze groeien tot samenvloeiing. </li><li> De dag voor transfectie, zaaigoed 7,5 x 10 5 cellen in 10 ml kweekmedium in een 100 mm kweekschaal. Swirl gelijkmatig verspreiden de cellen en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li><li> De volgende dag, zuigen de media en voeg 5 ml kweekmedium zonder serum en antibiotica. Wervelen en zuig het medium. Herhaal deze stap eenmeer tijd en tenslotte voeg 5 ml serum / antibioticumvrij medium en verder naar transfectie. </li><li> Verdun 6 ug plasmide DNA in 750 ul serumvrij medium in een steriele 1,5 ml plastic centrifugebuis. </li><li> In een 1,5 ml plastic centrifugebuis Verdun 30 pi transfectie reagens in 750 ul serumvrij medium. </li><li> Breng het verdunde transfectie reagens oplossing (stap 2.5) aan de buis met verdunde DNA (stap 2.4). Meng voorzichtig door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Incubeer de transfectie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Na 15 min, pipet de transfectie mengsel voorzichtig op de cellen swirl gelijkmatig mengen en incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. </li><li> Na 3 uur, zuig het medium bevattende mengsels transfectie van de cellen. Voeg vers medium celkweek aangevuld met serum en antibiotica. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2incubator voor 48 uur. </li><li> Na 48 uur lyseren van de cellen in 1 ml lysis buffer (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat en 1 ug / ml phenlymethyl sulfonyl fluoride). Verzamel de lysaten in een plastic centrifugebuis met een cel lifter en incubeer de lysaten op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer de lysaten bij 15.000 xg gedurende 10 min op een bench-top centrifuge de lysaten van celafval te verwijderen. [* Het is sterk aanbevolen om de expressie van HA-PRMT1 via immunoblotting van een monster van de lysaten met anti-HA-antilichamen, te bevestigen alvorens over te gaan tot de zuivering van de enzymen voor methylatie test.] </li><li> Voor zuivering van PRMTs, incubeer 3 mg cellysaten met 30 gl 50:50 suspensie van anti-HA affiniteitsmatrix in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en draai nacht bij 4 ° C in een buis rotator. </li><li> De volgende dag draaien de buizen bij 14.000 xg op een bench-top centrifuge gedurende 2 minuten om te verzamelende kralen. Verwijder het supernatant en was de kralen 3x met 1 ml RIPA-buffer [20 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA en 1% Triton-X-100] in elk wassen gevolgd door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 2 min. Na de derde maal, was de parels eenmaal met 100 ui methylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sucrose). Na het centrifugeren, de bovenstaande vloeistof. De korrels die de geïmmobiliseerde PRMTs klaar voor gebruik in de methylatie analyse. [* Het wordt sterk aanbevolen om de geïmmobiliseerde PRMTs direct gebruiken in de methylatie test.] </li></ol> 3 Zuivering van de ondergrond <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van GST-G3BP1 BL21 getransformeerd in 5 ml Luria-Bertani (LB) medium dat 100 ug / ml ampicilline. Groeien de kweken overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. </li><li> De volgende dag, de overdracht van de &#39;s nachts cultuur tot 50 ml vers LB-medium en continue te groeien tot een OD600 van 0,5-0,7 (Het duurt ongeveer 2 uur). </li><li> Wanneer de OD600 0,5-0,7 bereikt, voeg isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en verder cultuur nog eens 4 uur bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm. </li><li> Oogst de cellen door centrifugatie bij 1500 xg gedurende 10 min, en de pellet verwerkt voor zuivering GST of bewaar bij -80 ° C. </li><li> Resuspendeer de bacteriële pellet in 5 ml lysis buffer (1x PBS met proteaseremmers, 100 ug / ml lysozym, en 0,1% Triton-X-100) en incubeer de lysaten bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Op dit moment de lysaten troebele en visceuze weergegeven door het vrijkomen van bacteriële genomische DNA. </li><li> Scheer het genomisch DNA door sonicatie (10 pulsen van 1 seconde elk een amplitude van 30%). </li><li> Maak de lysaten door centrifugatie bij 15.000 xg gedurende 10 min en breng de heldere supernatant aan 15 ml buis. Als de supernatant niet duidelijk herhalen centrifugaleting proces nog een keer. </li><li> Ondertussen was het GST-sepharose korrels tweemaal met ijskoud PBS en een 50:50 suspensie van GST-sepharose in PBS. Voeg 200 ul van de GST-sepharose suspensie de gewiste bacteriële cellysaat en roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na 1 uur centrifuge de buizen bij 500 xg gedurende 3 minuten om de kralen te verzamelen. Was de kralen 3x met ijskoude PBS. </li><li> Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 100 ul elutiebuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutathion) en roteren bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer de buisjes bij 15.000 xg gedurende 2 minuten en giet het supernatant dat de gezuiverde eiwit in een plastic centrifugebuis. Voer SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) analyse van 5 ui van het gezuiverde eiwit samen met bekende hoeveelheden bovine serum albumine (BSA) bij de concentratie van het gezuiverde eiwit te schatten. </li></ol> 4 Methylation Assay OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een aangewezen voor radio-isotopen werk en in overeenstemming met de protocollen van de instelling op het uitvoeren van experimenten met radioactieve isotopen aparte ruimte. <ol><li> Voeg 2 ug gezuiverd GST-substraat en een master mix met 1x methylering buffer (50 mM Tris pH 8,5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 mM sucrose), 1 uCi S-adenosyl- L [methyl-3H] methionine, en water tot een eindvolume van 10 pi aan de geïmmobiliseerde PRMTs (stap 2.13) en incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na 1 uur, stop de reactie door het toevoegen van 10 pi van 2x SDS sample buffer. Na denaturatie van de monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten, scheid de monsters op een SDS-PAGE gel. </li><li> Later, overdracht van de gescheiden eiwitten uit de SDS-gel op nitrocellulosemembraan met een semi-droge elektroforetische overdracht. </li><li> Na de overdracht, bedek het membraan met eenutofluor (een autoradiografische beeldversterker) en schud gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na 2 uur, giet de autofluor en bewaar deze voor later gebruik. [* Label de buis als radioactief materiaal] </li><li> Snel lucht drogen het membraan op een filtreerpapier, sluit deze in een plastic zak en het membraan een röntgenfilm blootgesteld bij -20 ° C. Voldoende belichtingstijd varieert tussen 5-30 dagen. </li></ol> 5 Bevestiging van PRMT Expression en gelijke Laden van de ondergrond <ol><li> Na het bereiken van voldoende blootstelling, breng het membraan een plastic doos met blokkerende buffer [Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST + 3% vetvrije melk)] en schud gedurende 1 uur. </li><li> Gooi de blokkerende buffer als radioactief afval. Incubeer het membraan met anti-HA antilichaam (1: 1000 verdunning) in TBST nacht bij 4 ° C, met zachte wiegen. </li><li> Was het membraan met TBST 3x en incubeer de membraan met HRP-gelabeld anti-muis secundair antilichaam(1: 5000 verdunning) in TBST bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zacht schommelen. </li><li> Na 1 uur was de membraan met TBST 3x en chemiluminiscence detectie van proteïnes met een HRP-substraat. </li><li> Na detectie van het HA-gelabeld PRMTs Incubeer het membraan met Ponseau-S kleurstofoplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Snel Was het membraan 3x met water tot de GST-gelabeld substraten detecteren. Scan de afbeelding. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hierin beschreven protocol wordt routinematig gebruikt om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen. Deze robuuste en consistente analyse zal ook de definitieve gegevens over de specificiteit van PRMTs voor hun substraten. De belangrijkste componenten voor het succes van deze test zijn: 1 Expressie van PRMTs in zoogdiercellen 2 Activiteit gezuiverd PRMTs, 3 Expressie en zuivering van substraat en 4 volledige western overdracht van de eiwitten aan het nitrocellulose membraan. <p class="jo...

Eiwit methylatie werd voor het eerst beschreven in 1968 1. Het was pas de eerste klonen van PRMT1 in 1996, dat de onderzoekers begonnen met het belang van deze post-translationele modificatie 2 waarderen. Interessant is ongeveer 2% van arginine residuen in de eiwitten van nucleaire extracten worden gemethyleerd 3, waarin de overvloed van deze wijziging. Arginine is een positief geladen aminozuur met een basische zijketen stikstof / s in de zijketens van arginine kan post-translationeel gemodificeerd door de toevoeging van een methylgroep, een proces dat arginine methylatie 4-6. Arginine methylatie wordt gekatalyseerd door een klasse van enzymen weten., Eiwit arginine methyl transferases (PRMTs). Arginine kan zowel monomethylated of digemethyleerd en deze kunnen ofwel symmetrisch of asymmetrisch zijn, afhankelijk van het type PRMTs katalyseren de werkwijze 4-6. Eiwitten die worden weergegeven argininee-glycine rijke motieven zijn potentiële doelwitten voor-PRMT gemedieerde katalyse. PRMT-gemedieerde methylering van substraten is aangetoond dat eiwit-eiwit interacties, eiwit-nucleïnezuur interacties acid, eiwitfunctie, genexpressie en / of cellulaire signalering, die cruciaal zijn voor normale cellulaire homeostase 7-9 moduleren. Om de biologische rol van proteïne arginine methylering begrijpen, zijn nauwkeurige, efficiënte en reproduceerbare assays vereist om de methylatiestatus van de geïdentificeerde PRMT substraten stellen. In vitro assay methylatie, die de mogelijkheden van gezuiverde PRMTs evalueert methylering van hun substraten katalyseren, is een goed geaccepteerde test voor bestuderen arginine methylering 10-12. Het succes van deze test hangt grotendeels af van de activiteit van het gezuiverde PRMTs. PRMTs kan worden uitgedrukt en gezuiverd uit bacteriën of zoogdiercellen 10,11. Dit in vitro assay methylatie, als dm gedetailleerde in het protocol is gebaseerd op een werkwijze die oorspronkelijk beschreven door Tini en collega 10. In dit protocol, laten we in detail de stappen die betrokken zijn bij de expressie en zuivering van PRMT1 in zoogdiercellen. Het vermogen van de gezuiverde PRMT1 methylering van Ras GTPase-activerend eiwit katalyseren bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat 8, werd later onderzocht in aanwezigheid van S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine als methyl donor. Met deze assay kunnen we betrouwbaar de mogelijkheden van de PRMTs definiëren methylaat nieuwe of bekende substraten, die een eerste stap in de studie van proteïne arginine methylatie.

<table><tbody><tr><td>S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top dispenser</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>6 ml Scintillation Vials</td><td>National Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathione Reduced</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA affiniteitsmatrix</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA antilichaam</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro methylatietest assay om protein arginine methylatie bestudeer

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylering is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties in de kern. Protein arginine methylering kan worden geïdentificeerd en / of bepaald via proteomische benaderingswijzen en / of immunoblotting met methyl-arginine specifieke antilichamen. Echter, deze technieken kunnen soms misleidend zijn en bieden vaak vals-positieve resultaten. Het belangrijkste is dat deze technieken geen direct bewijs voor de PRMT substraatspecificiteit. In vitro assays methylatie, anderzijds, bruikbaar biochemische assays die gevoelig zijn en consistent tonen als de geïdentificeerde eiwitten inderdaad PRMT substraten. Een typische in vitro assay omvat methylatie gezuiverde, actieve PRMTs, gezuiverd substraat en een radioisotoop gemerkt methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol katalytisch actieve PRMT1, een alomtegenwoordig uitgedrukt PRMT familielid isoleren. Het methyl transferase activiteiten van de gezuiverde PRMT1 werden later getest op Ras GTPase-activerend eiwit bindend eiwit 1 (G3BP1), een bekende PRMT substraat in de aanwezigheid van S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine als methyl donor. Dit protocol kan niet alleen gebruikt voor het vaststellen van de methylatiestatus van nieuwe fysiologische PRMT1 substraten, maar ook voor het begrip van de basismechanismen van proteïne arginine methylatie.

<html> De mogelijkheden van HA-PRMT1 te methyleren GST-G3BP1 werden bepaald door een in vitro methylering assay. HA-gelabeld PRMT1 gezuiverd van Beas2B cellysaten werd tewerkgesteld in een methyleringsreactie met GST-G3BP1, en ​​1 uCi van S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine, zoals een methylgroep donor. PRMT1 kon efficiënt katalyseren de methylatie van het GST-G3BP1 (Figuur 1, bovenste paneel). Methyleringsreacties middels pull-downs uitgevoerd op lysaten van lege vector getransfectee...

Protein arginine methylatie, gekatalyseerd door een klasse van enzymen nl. Proteïne arginine methyl transferase (PRMTs), het proces van enzymatische additie van methylgroep (en) arginines in eiwitten. De in-vitro-methylatie test is de meest betrouwbare instrument voor de beoordeling van de methylatie status van bekende of nieuwe PRMT substraten.

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Het algemene doel van deze procedure is om de methylatiestatus van eiwitarginine methyltransferase of PRMT-substraten vast te stellen. Dit wordt bereikt door eerst epitope-gelabelde PRT's tot expressie te brengen in zoogdiercellen. De P RMT's worden vervolgens geïmmunoprecipiteerd uit de cellysaat met behulp van anti-hemagglutinine of anti-HA gecoate SRO-snelheden, gevolgd door een uitgebreide wasstap om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.Vervolgens worden de gewassen kralen geïncubeerd met het substraateiwit gezuiverd uit bacteriën en tritium-gelabelde slakken L-methionine, of sam. Ten slotte wordt de reactie gestopt en wordt de methylatiestatus van het substraat bepaald via natrium-sylsulfaat, polyacrylamidegelelektroforese of SDS-page-analyse gevolgd door autorradiografie. Uiteindelijk wordt het vermogen van p RMT's om het substraat te methyleren bepaald door de methyleringsreacties te vergelijken met behulp van immunoprecipitatie uitgevoerd op de lysaten van lege vector en BRMT-getransfecteerde cellen.Proteomische benaderingen of immunoblotting met methyl-arginine-specifieke antilichamen kunnen soms misleidend zijn en vaak valse postale resultaten opleveren. Het belangrijkste is dat ze geen direct bewijs kunnen leveren ter ondersteuning van PRMT-substraatspecificiteit. Het belangrijkste voordeel van de in vitro-methyleringsassay die ik in deze video zal demonstreren, is dat deze gevoelig is en consequent onthult of de geïdentificeerde eiwitten PRMT-substraten zijn. Zaai de dag voor transfectie 750.000 humane bronchiale epitheelcellen in 10 milliliter kweekmedium.In een kweekschaal van 100 millimeter, draai de schaal om de cellen gelijkmatig te verspreiden en incubeer bij 37 graden Celsius in een CO2-incubator met 5% bevochtigde lucht. De volgende dag aspireer het medium en voeg vijf milliliter kweekmedium zonder serum en antibiotica toe, draai en aspireer het medium. Herhaal deze stap nog een keer en voeg uiteindelijk vijf milliliter serum- en antibioticavrij medium toe en ga door met transfectie.Om de transfectie uit te voeren, verdun eerst zes microgram PRMT-plasmide-DNA in 750 microliter serumvrij medium in een steriele plastic centrifugeerbuis van 1,5 milliliter. In een andere steriele plastic centrifugeerbuis van 1,5 milliliter verdun 30 microliter transfectiereagens in 750 microliter serumvrij medium. Breng vervolgens de verdunde transfectiereagensoplossing over naar de buis met verdund DNA, meng voorzichtig door meerdere keren op en neer te pipetten.Incubeer het transfectiemengsel op kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Pipet vervolgens het transfectiemengsel voorzichtig op de cellen en draai om om gelijkmatig te mengen. Na een incubatie van drie uur bij 37 graden Celsius aspireer het medium met de transfectiemengsels van de cellen.Voeg vervolgens vers celkweekmedium toe dat is aangevuld met serum en antibiotica. Na een incubatie van 48 uur bij 37 graden Celsius lyseer cellen in één milliliter lyseerbuffer. Verzamel de lysaten op een plastic centrifugeerbuis met een cellifter.Vervolgens incuberen we de lysaten gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens de lysaten gedurende 10 minuten bij 15.000 GS op een tafelcentrifuge.Om de lysaten van celdebris te zuiveren voor de zuivering van P mts. Incubeer drie milligram cellysaat met 30 microliter van een 50 op 50 suspensie van anti HA-affiniteitsmatrix in fosfaatgebufferde zoutoplossing. Of PBS draai een nacht langzaam bij vier graden Celsius in een buisrotator.De volgende dag centrifugeer de buizen gedurende twee minuten bij 14.000 GS op een tafelcentrifuge om de kralen te verzamelen. Gooi na het weggooien van de snat de kralen weg met een milliliter RIPA-buffer gevolgd door centrifugatie zoals eerder. Na het wassen van de kralen drie keer met RIPA-buffer, was de kralen eenmaal met 100 microliter methyleringsbuffer.Na de centrifugatie verwijdert u het supernatant. De kralen met de geïmmobiliseerde p RMT's zijn klaar om te worden gebruikt in de methyleringsassay. Voer de methyleringsassay uit in een apart gebied dat is aangewezen voor radio-isotoop.Werk in overeenstemming met de protocollen van de instelling voor het werken met radioactieve isotopen. Bereid gezuiverd glutathion, s transferase of GST-substraat voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer twee microgram met een mastermix bevattende een x methyleringsbuffer en micro curie van tridium-gelabelde slakken L-methionine.Voeg het mengsel toe aan de geïmmobiliseerde p RMT's en incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius. Na een uur stopt u de reactie door 10 microliter van twee XSDS toe te voegen. Steek de monsters eerst 10 minuten bij 95 graden Celsius uit.Scheiden de monsters later door SDS-page. Breng de gescheiden eiwitten van de SDS-gel over op een nitrocellulosemembraan door middel van een semi-droge elektroforesetransfer. Bedek na de transfer het membraan met een autoradiografisch beeld.Intensifier en schud voorzichtig gedurende twee uur op kamertemperatuur Na twee uur giet de intensifier af en bewaar deze voor later gebruik. Droog het membraan snel op een filterpapier, sluit het in een plastic zak en stel het membraan bloot aan een röntgenfilm bij min 20 graden Celsius. Voldoende belichtingstijden variëren tussen vijf en 30 dagen.Nadat voldoende belichtingen zijn bereikt, brengt u het membraan over naar een plastic doos met blokkeringsbuffer en schudt u gedurende een uur voorzichtig. Gooi de blokkeringsbuffer weg als radioactief afval. Incubeer vervolgens het membraan met anti-HA-antilichaam in T tris, gebufferd zoutwater met tween 20, afgekort TBST, gedurende een nacht bij vier graden Celsius met voorzichtig schudden de volgende dag.Was het membraan drie keer met TBST. Incubeer vervolgens het membraan met paardenradijs-peroxidase-gelabeld anti-muis secundair antilichaam in TBST bij kamertemperatuur gedurende een uur met voorzichtig schudden. Na het wassen van het membraan drie keer met TBST, voer chemiluminescentiedetectie van eiwitten uit met paardenradijs-peroxidase-substraat

in-vitro-methylation-assay-to-study-protein-arginine-methylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Het huidige protocol beschrijft de bereiding en kwantitatieve meting van vrije en eiwitgebonden arginine en methyl-arginineen door 1H-NMR spectroscopie.

Het verkennen van de Arginine Methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Het testen van visuele gevoeligheid bij hagedissen met behulp van een operante conditionering paradigma dat het afspelen van video van de random-dot kinematograms en computer-gegenereerde ongewervelde dieren in dienst heeft.

Het testen van visuele gevoeligheid voor de snelheid en richting van de beweging in Lizards

Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen...

Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

In dit artikel wordt een eenvoudige, kwantitatieve, vloeibare fase affiniteit capture assay gepresenteerd. Het is een betrouwbare techniek op de interactie tussen het magnetische kralen en gemerkte eiwitten (bijv. nanobodies) enerzijds en de affiniteit tussen het gemerkte eiwit en een tweede, gemerkt eiwit (bijv. poliovirus) anderzijds.

Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

Leer de in vitro methylatietest om PRMT-substraatmethylering te bestuderen met immunoprecipitatie en SDS-PAGE-analyse. Deze methode biedt betrouwbare inzichten in eiwitargininemodificatie.

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Meer video's verkennen