Name: De Soft Agar Kolonie Formatie Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer de soft agar kolonie formatie assay om ankeronafhankelijke groei van getransformeerde cellen te kwantificeren. Deze methode toont tumorigeen potentieel en het effect van tumorsuppressor-eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een Merit Award van het Amerikaanse Department of Veterans Affairs en een NIH-subsidie R01CA1385282522717 aan RW.

1. Voorbereiding van de materialen en reagentia <ol><li> Label elk putje van een weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes adequaat voor elke cellijn of aandoening onderzocht. </li><li> Bereid 2x celkweekmedium door het oplossen van 1 g poeder medium en 0,2 g natriumbicarbonaat in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml. </li><li> Geef dit medium door een 0,2 um filter te steriliseren. </li><li> Voeg extra componenten nodig voor normale kweek van de cellijn van belang. Zo groeien CMT 167 cellijn in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine oplossing. Warm medium tot 37 ° C in heet water bad vóór gebruik. </li><li> Bereid 1x celcultuurmedium afzonderlijk als u zou doen voor een normale cel cultuur van de cellijn van belang. </li><li> Bereid 1% noble-agar door 1 g nobel agar 100 ml gedeïoniseerd water. OPMERKING: Noble agar zal niet volledig oplossen met agitatie alleen. </li><li> Bereiden0,6% noble-agar door toevoeging van 0,6 g nobel agar 100 ml gedeïoniseerd water. Beide agar oplossingen kunnen worden gemaakt in 100 ml glazen flessen met afsluitbare deksels voor langdurige opslag. </li><li> Autoclaaf de nobele agar mengsels te steriliseren. Deze mengsels kunnen vooraf worden gemaakt en bewaard bij 4 ° C maar moet zij opnieuw worden verwarmd op het moment van het experiment tot de agar volledig is opgelost. </li><li> Bereid nitroblauwtetrazolium chloride oplossing door een 1 mg / ml voorraadoplossing in 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in H2O eindvolume van 1000 ml ). Dit wordt gebruikt aan het einde van het experiment om de kolonies vlekken. </li></ol> 2. Plating van onderlaag van Agar <ol><li> Draai de dop op de fles van 1% nobel agar en magnetron voor ongeveer 1-2 min. Bij verwarming in een magnetron, toezicht houden op de oplossing dicht om te voorkomen dat overkoken. Verhit, terwijl intermitterend mengen,tot agar volledig is opgelost en de oplossing helder is. OPMERKING: Gebruik hittebestendige handschoenen om fles te behandelen na verhitting. Als u dit niet doet, kan brandwonden of ernstig letsel veroorzaken. </li><li> Plaats gesmolten agar-oplossing en voorverwarmde 2x kweekmedium in een ijs emmer gevuld met warm water uit de kraan (42 ° C). Plaats ook een 50 ml conische buis in een buis houder in het ijs emmer met heet water. Transfer emmer om celcultuur kap voor vervolgstappen. </li><li> Voor de onderste laag van agar, zult u 1,5 ml van een mix van agar en medium per well van een 6-well plaat nodig. </li><li> Om een ​​voldoende hoeveelheid van het mengsel te garanderen, stelt een totaal van 12 ml per 6-wells plaat. </li><li> Begin met het toevoegen 6 ml kweekmedium aan de 50 ml conische buis en vervolgens 6 ml van de 1% noble-agar oplossing. </li><li> Inverteer de conische buis herhaaldelijk te mengen. Werken in een vlot tempo zal voortijdige verharding van de zachte agar te voorkomen. </li><li> Opstellen van ongeveer 5,5 ml van het mengsel in een 5 ml serologische pipette. </li><li> Laat de luchtbellen te stijgen naar de top van de pipet kolom voor het deponeren van 1,5 ml van dit mengsel in elk putje. Wees voorzichtig om afzetting van eventuele luchtbellen te vermijden in de putjes. </li><li> Bedek de platen en laat agar mengsel stollen bij kamertemperatuur in celkweek kap, gedurende 30 min. </li></ol> 3. Plating de bovenste laag van Agar met cellen <ol><li> Zodra de onderste laag van agar gestold, beginnen bereiding van de bovenlaag. </li><li> Eerst, oogst cellen door behandeling met trypsine en verdund ze 1: 5 in kweekmedium (bijvoorbeeld voor 1 ml trypsine wordt 4 ml medium) in een 15 ml conische buis. </li><li> Aantal cellen en bereken het aantal cellen nodig is per putje om een ​​uiteindelijke celsuspensie te bereiden op dit moment. Dit aantal zal variëren afhankelijk van celtype. Gebruik 5000 cellen / putje als uitgangspunt en indien nodig aanpassen. Voor dit aantal cellen, zou je een celsuspensie van 6667 cellen / ml te bereiden (dwz elke WELl wordt 0,75 ml van deze suspensie en 0,75 ml agar voor een totaal volume van 1,5 ml te ontvangen; de concentratie van cellen worden verdund 1: 2 bij een uiteindelijke totale celtelling 5000). </li><li> Het volume celsuspensie nodig per putje van een 6-wells plaat weer 1,5 ml. Bereid extra celsuspensie in totaal 12 ml per 6-well plaat. </li><li> Smelt 0,6% agar-oplossing in een magnetron als hierboven en het in een ijsemmer met warm water, samen met een 50 ml conische buis in een buis houder en de uiteindelijke celsuspensie van Stap 3.3. </li><li> Breng de ijsemmer met gesmolten 0,6% agar aan celkweek kap voor vervolgstappen. </li><li> Meng 0,6% agar en celsuspensie in een 1: 1 verhouding, het bereiden van een totaal volume van 12 ml per 6-wells plaat. 1.5 ml wordt per putje vereist maar extra moeten zijn zoals hierboven gesteld. </li><li> Pipetteer 6 ml celsuspensie in de 50 ml conische buis. </li><li> Vervolgens voegt 6 ml 0,6% agar aan de buis. OPMERKING: De temperatuur van dit mengsel moet zijngehouden rond 42 ° C om voortijdige uitharding te voorkomen en celoverleving maximaliseren. </li><li> Snel werkende, pipet dit mengsel 2-3x om cellen te verdelen, dan is het opstellen van 5,5 ml van het mengsel in een 5 ml serologische pipet. </li><li> Laat eventuele luchtbellen te laten stijgen naar de top van de pipet kolom voor het deponeren van 1,5 ml van dit mengsel in elk putje. Wees voorzichtig om afzetting van eventuele luchtbellen te vermijden in de putjes. </li><li> Laat cellen / agar mengsel stollen bij kamertemperatuur in celkweek kap, 30 min alvorens in een 37 ° C bevochtigde celkweek incubator. </li><li> De tijd vereist voor adequate kolonievorming verschilt voor elke cellijn, typisch rond 21 dagen. </li><li> Een laag groeimedium te handhaven over de bovenste laag agar aan uitdroging te voorkomen. 100 pl medium tweemaal per week toegevoegd volstaat hiervoor. </li></ol> 4. het kleuren van de platen en Counting Koloniën <ol><li> Stain cellen door toevoeging van 200 _6, l nitroblauwtetrazolium chloride-oplossing per putje en incuberen platen overnacht bij 37 ° C. </li><li> Zodra kolonies zijn gekleurd, neem foto&#39;s van putten met behulp van een imager en tel kolonies met behulp van software voor beeldanalyse. </li></ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
<li>Wend, P., Holland, J. D., Ziebold, U., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+stem+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in stem and cancer stem cells.</a> Semin Cell Dev Biol. 21, 855-863 (2010).</li>
<li>Reya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Wnt+signalling+in+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 423, 409-414 (2003).</li>
<li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li>
<li>Takahashi-Yanaga, F., Kahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Wnt+signaling%3A+can+we+safely+eradicate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting Wnt signaling: can we safely eradicate cancer stem cells.</a> Clin Cancer Res. 16, 3153-3162 (2010).</li>
<li>De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FCa2%2B+signaling+pathway%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Wnt/Ca2+ signaling pathway: a brief overview.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 43, 745-756 (2011).</li>
<li>Tennis, M. A., Vanscoyk, M. M., Wilson, L. A., Kelley, N., Winn, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+Wnt7a+is+modulated+by+DNMT1+and+cigarette+smoke+condensate+in+non-small+cell+lung+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methylation of Wnt7a is modulated by DNMT1 and cigarette smoke condensate in non-small cell lung cancer).</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Wnt-7a+expression+reverses+non-small+cell+lung+cancer+cellular+transformation+through+frizzled-9-mediated+growth+inhibition+and+promotion+of+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Restoration of Wnt-7a expression reverses non-small cell lung cancer cellular transformation through frizzled-9-mediated growth inhibition and promotion of cell differentiation.</a> J Biol Chem. 280, 19625-19634 (2005).</li>
<li>Winn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumorigenic+effect+of+Wnt+7a+and+Fzd+9+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+is+mediated+through+ERK-5-dependent+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Antitumorigenic effect of Wnt 7a and Fzd 9 in non-small cell lung cancer cells is mediated through ERK-5-dependent activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> J Biol Chem. 281, 26943-26950 (2006).</li>
<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In vitro bevestiging van de tumor onderdrukkende functie van signaaleiwitten is moeilijk. Een van de meest rigoureuze testen waarover deze eigenschap onderzoeken is de zachte agar kolonievorming assay. Hier hebben we de zachte agar kolonieformatie test met behulp van een muizen longcarcinoomcellijn stabiel overexpressie Wnt7a en Fzd9 ten opzichte van zijn ouderlijke CMT167 cellijn geïllustreerd. Er zijn een aantal belangrijke punten om te overwegen met betrekking tot de zachte agar ...

De zachte agar kolonievorming assay is een techniek veel gebruikt om cellulaire transformatie in vitro evalueren. Historisch andere test de clonogene assay beschreven door Puck et al. In 1956 werd gebruikt om het vermogen van cellen om kolonies te vormen 1 evalueren. In deze techniek werden cellen gedispergeerd op een kweekplaat en gekweekt in aanwezigheid van feeder-cellen of geconditioneerd medium noodzakelijke groeifactoren verschaffen. De beperking van deze techniek is dat het alleen informatie verstrekt over de vorming van kolonies. Normale cellen verhinderd verankering-onafhankelijke groei, door een bepaald type van apoptotische dood, genaamd anoikis 2. Echter, getransformeerde cellen hebben het vermogen om te groeien en delen zonder binding aan een substraat. Om te profiteren van dit concept, onderzoekers ontwikkelden de zachte agar kolonievorming assay. De zachte agar kolonieformatie assay is sindsdien gewijzigd, in meer recente jaren, te sp pakkenecifieke behoeften. Eén variatie omvat incorporatie van fluorometrische kleurstof om voor high-throughput kolonie tellen. Een andere variatie omvat het gebruik van gespecialiseerde agar oplossing om voor het ophalen van levensvatbare cellen na kolonievorming bij eiwit of DNA monsters nodig. In de traditionele zachte agar kolonievorming assay worden cellen gekweekt in een laag zachte agar gemengd met celkweekmedium die rust op een laag zacht agar, ook gemengd met celkweekmedium, maar dat een hogere concentratie van agar. Dit voorkomt dat cellen van het naleven van de cultuur plaat, maar toch maakt getransformeerde cellen tot zichtbare kolonies vormen. De grondgedachte achter deze techniek is dat normale cellen afhankelijk cel extracellulaire matrix contact kunnen groeien en delen. Omgekeerd getransformeerde cellen kunnen groeien en verdeel ongeacht hun omgeving. Daarom cellen in staat zijn om kolonies te vormen in een verankering-onafhankelijke wijze werden considered te transformeren en carcinogeen. Het algemene doel van deze methode is deze mogelijkheid in cellen te meten in een semi-kwantitatief en strikte manier. De Wnt signaleringsroute is van cruciaal belang in de embryogenese en vaak gedereguleerde in het ontstaan ​​van tumoren 3-6. Er zijn meerdere routes in verband met Wnt-signalering. De canonieke weg omvat Wnt signalisatie en regulatie van de downstream-gen transcriptie door haar effecten op de transcriptionele coactivator beta-catenine. Wnts signaal ook door verscheidene nietcanonieke trajecten, bijvoorbeeld de planaire celpolariteit signaalweg die elementen voor het cytoskeletstructuur 7 regelt, en de Wnt-route calcium, wat afgifte van calcium reguleert van het endoplasmatisch reticulum 8. Wnt liganden oefenen hun activiteit uit door binding Frizzled receptoren. Hoewel verschillende Wnts is aangetoond opgereguleerd in longkanker, is Wnt7a aangetoond worden down-gereguleerd in niet-small cellige longkanker door promotor methylering 9. Wnt7a bindt Fzd9 en fungeert als een tumor suppressor via een niet-canonieke route. Herstel van Wnt-7a en VaZuDo-9 remt de groei van niet-kleincellige longkankercellen 10. De effecten van Wnt7a / Fzd9 worden gemedieerd door de activering van ERK-5, die op zijn beurt, activeert peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) 11,12. Hier tonen we aan dat overexpressie van Wnt7a en Fzd9 resulteert in de onderdrukking van verankering-onafhankelijke groei van een muizen longcarcinoom cellijn. Murine CMT167 cellen werden afgeleid van een longcarcinoom in C57BL / lcrf muizen 13 en werden stabiel getransfecteerd met Wnt7A en Fzd9. Overexpressie van Wnt7A en Fzd9 werden bevestigd door kwantitatieve PCR (Q-PCR) en de functionaliteit van Wnt7A en Fzd9 overexpressie werd bevestigd door stroomafwaartse activering van PPARy.

<table><tbody><tr><td>Kankercellijn van belang</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 Cellen</td></tr><tr><td>Gepoederd RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>Wordt gebruikt om 2x celcultuurmedium voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Vloeibaar RPMI 1650 Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Wordt aangeduid als 1x celcultuurmedium.</td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>Wordt gebruikt om celcultuurmedium aan te vullen.</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Wordt gebruikt in celcultuurmedium.</td></tr><tr><td>Difco Edele Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>Wordt gebruikt om 1,0% en 0,6% agar voor te bereiden.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>Wordt gebruikt in 2x celcultuurmedium.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Steriele Flessenstopfilters</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>Wordt gebruikt om 2x medium sterieel te filteren.</td></tr><tr><td>Lipofectamine Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>Wordt gebruikt in PPAR-RE luciferase assay.</td></tr><tr><td>6-well Platen, Tissue-cultuurbehandeld</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176;C/5% CO2 Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Wordt gebruikt om foto's van kolonies te maken.</td></tr><tr><td>Quantity One Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Wordt gebruikt om celkolonies te tellen.</td></tr><tr><td>15 ml Conische buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conische buizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenusher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer met dekglas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettipjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde Lichtmicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hittebestendige Handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de soft agar kolonie formatie assay

The Soft Agar Colony Formation Assay

Onafhankelijke groei zonder verankering is het vermogen van getransformeerde cellen om onafhankelijk van een vaste oppervlakte te groeien, en wordt beschouwd als een kenmerk van carcinogenese. De zachte agar-kolonievormingstest is een goed gevestigde methode voor het karakteriseren van deze mogelijkheid in vitro en wordt beschouwd als een van de strengste tests voor maligne transformatie in cellen. Deze test maakt ook een semi-kwantitatieve evaluatie van deze mogelijkheid mogelijk in reactie op verschillende behandelingsomstandigheden. Hier zullen we de zachte agar-kolonievormingstest demonstreren met behulp van een muislongcarcinoomcellijn, CMT167, om de tumoronderdrukkende effecten van twee leden van de Wnt-signaleringsroute, Wnt7A en Frizzled-9 (Fzd-9), te demonstreren. Gelijktijdige overexpressie van Wnt7a en Fzd-9 veroorzaakte een remming van kolonievorming in CMT167-cellen. Dit toont aan dat expressie van het Wnt7a-ligand en zijn Frizzled-9-receptor voldoende is om tumorgroei te onderdrukken in een muislongcarcinoommodel.

De expressie van Wnt7A en Fzd9 in CMT167 cellen effectief in tumorsuppressie, zoals blijkt uit onze zachte agar kolonievorming assay. Voorlopig gebruikten we Q-PCR aangetoond dat Wnt7A en Fzd9 mRNA expressie in lage niveaus in CMT167 cellen. CMT167 cellen vertoonden lage niveaus van endogeen Wnt7A en Fzd9 vergelijking met MLE-12 cellen, een met SV40 getransformeerde murine long epitheliale cellijn (Figuur 1). We vervolgens getransfecteerd CMT167 cellen met twee retrovirale overexpressie vectoren die de ...

De zachte agar-kolonievormingstest is een methode die wordt gebruikt om cellulaire ankeronafhankelijke groei in vitro te bevestigen. Het doel van dit protocol is om een strenge methode te illustreren voor de detectie van het tumorigene potentieel van getransformeerde cellen en de tumoronderdrukkende effecten van eiwitten op getransformeerde cellen.

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire ankeronafhankelijke groei te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een laag agar op de celcultuurplaat te plateren en deze te laten harden. De tweede stap is om een mengsel van cellen in agar bovenop de vorige agarlaag te plateren.Vervolgens worden de cellen gedurende enkele weken de tijd gegeven om kolonies te vormen. De laatste stap is het kleuren van de kolonies voor visualisatie en kwantificering. Uiteindelijk wordt de zachte agar-kolonievormingstest gebruikt om ankeronafhankelijke groei te laten zien als een indicatie van cellulaire transformatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals de Clon genetische test, is dat de zachte agar-kolonievormingstest vereist dat cellen zich op een ankeronafhankelijke manier in kolonies vormen. Begin de procedure door elk putje van een weefselkwekerij te labelen die behandeld is. Markeer elke put van een zes-puttenplaatje op de juiste manier voor elke cellijn of conditie die onderzocht wordt.Bereid vervolgens twee Xcel-kweekmediums voor door één gram poedermedium en 0,2 gram natriumbicarbonaat op te lossen in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 milliliter. Laat dit medium door een 0,2 micron filter gaan. Voeg extra componenten toe die nodig zijn voor normale kweek van de cellijn van belang.Groei bijvoorbeeld de CMT 1 67-cellijn in RPMI 1640-medium dat is aangevuld met 10%FBS en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Verwarm het medium voor gebruik tot 37 graden Celsius in een waterbad. Bereid nu één Xcel-kweekmedium voor.Bereid vervolgens 1%edel agar voor door één gram edel agar toe te voegen aan 100 milliliter gedeïoniseerd water. Bereid daarna 0,6%edel agar door 0,6 gram edel agar toe te voegen aan 100 milliliter gedeïoniseerd water. Autoclaveer vervolgens de edel agar-mengsels.Maak vervolgens een nitroblauw tetra oleumchloride-stockoplossing van één milligram per milliliter in één XPBS voor het kleuren van de kolonies. In deze procedure, verwarm de fles met 1%edel agar gedurende ongeveer één tot twee minuten in een magnetron. Houd de oplossing nauwlettend in de gaten om overkoken te voorkomen.Vervolgens verwarmen en mengen we onderbrekingen tot de agar volledig is opgelost en de oplossing helder is. Plaats vervolgens de gesmolten agar-oplossing en het voorverwarmde twee-x-kweekmedium in een ijsemmer gevuld met 42 graden Celsius. Kraanwater.Plaats bovendien een 50 milliliter conische buis in een buishouder in de ijsemmer met heet water. Breng vervolgens de emmer over naar de celkweekkap. Voeg vervolgens zes milliliter kweekmedium en zes milliliter van de 1%edel agar-oplossing toe aan de 50 milliliter conische buis.Pipetteer meerdere keren op en neer om te mengen. Werken op een snel tempo zal voortijdig verharden van de zachte agar voorkomen. Trek vervolgens ongeveer 5,5 milliliter van het mengsel op met een vijf milliliter serologische pipette.Laat de luchtbellen stijgen naar de bovenkant van de pipettenkolom. Deponeer vervolgens 1,5 milliliter van het mengsel in elk putje en vermijd het deponeren van luchtbellen. Bedek de plaat en laat het agarmengsel gedurende 30 minuten in de celkweekkap bij kamertemperatuur stollen.Haal eerst de cellen binnen met trypsine en verdun ze een op vijf in kweekmedium in een 15 milliliter conische buis. Tel de cellen en bereken het aantal cellen dat per putje nodig is om op dit moment een eindcellentredding voor te bereiden. Smelt vervolgens 0,6%agar op in een magnetron.Plaats deze in een ijsemmer met heet water samen met een 50 milliliter conische buis in een buishouder en de eindcellentredding. Breng vervolgens de ijsemmer met gesmolten 0,6%agar over naar de celkweekkap voor de volgende stappen. Om een totaal volume van 12 milliliter cellentredding voor een zes-puttenplaatje te bereiden, pipet eerst zes milliliter cellentredding in de 50 milliliter conische buis.Voeg vervolgens zes milliliter 0,6%agar toe aan de buis. Houd het mengsel op 42 graden Celsius om voortijdige verharding te voorkomen en de celoverleving te maximaliseren. Pipetteer het mengsel vervolgens snel, twee tot drie keer om de cellen te verdelen.Trek 5,5 milliliter van het mengsel op met een vijf milliliter serologische pipette en laat eventuele luchtbellen stijgen naar de bovenkant van de pipettenkolom. Deponeer vervolgens 1,5 milliliter van het mengsel in elk putje. Laat het cellen-agarmengsel 30 minuten stollen in de celkweekkap bij kamertemperatuur voordat het in een 37 graden Celsius bevochtigde celkweekincubator wordt geplaatst.Voeg twee keer per week 100 microliters groeimedium toe aan de bovenste agarlaag om uitdroging te voorkomen en gedurende ongeveer 21 dagen wachten op voldoende kolonievorming. Om de cellen te kleuren, voeg 200 microliters nitroblauw tetra oleumchloride-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Zodra de kolonies zijn gekleurd, maak foto's van de putjes met behulp van de beeldvormer en tel de kolonies met behulp van beeldanalysesoftware.Hier wordt de zachte agar-kolonievormingstest getoond van vector die CMT 1 67 LNCX LPC X-cellen en CMT 1 67 LL went seven a frizzled nine overexpressiecellen uitdrukt. De vector die CMT 1 67 L en CXL PC X-cellen en CMT 1 67 LL went seven a f frizzled. Negen overexpressiecellen werden geplaatst in een zachte agar-kolonievormingstest. CMT 1 67 LL went seven frizzled negen cellen vertoonden een duidelijke afname in kolonievorming na zijn ontwikkeling.Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van kankeronderzoek de weg geëffend om cellulaire transformatie in vitro te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen kunt beoordelen op ankeronafhankelijke groei.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.

Monogene Assay: hechtende cellen

Bij het werken met media en reagentia die worden gebruikt om cultuur micro-organismen, moet een aseptische techniek worden toegepast om ervoor te zorgen besmetting tot een minimum beperkt. Verschillende platen methoden worden routinematig gebruikt voor het isoleren, propageren of sommen bacteriën en faag, die opgenomen procedures die de steriliteit van experimentele materialen handhaven.

Aseptische Laboratoriumtechniek: Plating Methoden

Deze video beschrijft een zachte agar kolonievormingstest om de effecten van een PADI-enzymremmer en BB-Cl-amidine op borstkankertumorigeniciteit in vitrote testen. Deze test maakt ook de kwantitatieve beoordeling van het celtransformatiepotentieel in de context van genetische verstoringen mogelijk.

Soft Agar Colony Formation Assay: een methode om effecten van nieuwe verbindingen op de proliferatie van kankercellen te testen

This video describes the colony formation assay, which helps determine lung cancer cells' ability to proliferate indefinitely and form individual colonies. We can analyze the effect of an anticancer agent on the colony-forming cells by analyzing the changes in the number and/or size of the resulting colonies.

Colony Formation Assay: Assessing the Efficacy of Anticancer Agents on Colony-Forming Lung Cancer Cells

Source: Cayron, J., and Lesterlin, C. Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for assessing E. coli filamentation and DNA replication under cell division-inhibiting antibiotic treatment using plating to measure viability and flow cytometry to analyze cell size and DNA content.

Assessing Antibiotic-Induced Filamentation in E. coli Using Plating Assay and Flow Cytometry

Source: Temkin, M. I. et al. High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates an in vitro assay to study microbial interactions between Corynebacterium propinquum and Staphylococcus in a co-culture.

An In Vitro Assay to Study Microbial Interactions in Co-Culture

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Hier documenteren we het gebruik van de zachte agar-kolonievormingstest om de effecten van een peptidylarginine deiminase (PADI) enzymremmer, BB-Cl-amidine, op de tumorigeniteit van borstkanker in vitro te testen.

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Deze methode kwantificeert microbiële abundantie met behulp van een 96-well plaatformaat om kolonievormende eenheden (CFU's) te vergulden en wordt toegepast op het Drosophila-microbioom in hele vlieghomogenaatmonsters. CFU's worden geteld met een geautomatiseerde beeldanalysesoftware die hier wordt geleverd.

Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van een eenvoudig modelecosysteem dat de methaan-zuurstof-tegengradiënt nabootst die wordt aangetroffen in de natuurlijke habitat van aërobe methaanoxiderende bacteriën, waardoor hun fysiologie in een ruimtelijk opgeloste context kan worden bestudeerd. Modificaties van gangbare biochemische assays voor gebruik met het op agarose gebaseerde modelecosysteem worden ook beschreven.

Op agarose gebaseerd modelecosysteem voor het kweken van methanotrofen in een methaan-zuurstof-tegengradiënt

Leer de soft agar kolonie formatie assay om ankeronafhankelijke groei van getransformeerde cellen te kwantificeren. Deze methode toont tumorigeen potentieel en het effect van tumorsuppressor-eiwitten.

De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Meer video's verkennen