De Soft Agar Kolonie Formatie Assay

Het algemene doel van deze procedure is om cellulaire ankeronafhankelijke groei te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een laag agar op de celcultuurplaat te plateren en deze te laten harden. De tweede stap is om een mengsel van cellen in agar bovenop de vorige agarlaag te plateren.

Vervolgens worden de cellen gedurende enkele weken de tijd gegeven om kolonies te vormen. De laatste stap is het kleuren van de kolonies voor visualisatie en kwantificering. Uiteindelijk wordt de zachte agar-kolonievormingstest gebruikt om ankeronafhankelijke groei te laten zien als een indicatie van cellulaire transformatie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals de Clon genetische test, is dat de zachte agar-kolonievormingstest vereist dat cellen zich op een ankeronafhankelijke manier in kolonies vormen. Begin de procedure door elk putje van een weefselkwekerij te labelen die behandeld is. Markeer elke put van een zes-puttenplaatje op de juiste manier voor elke cellijn of conditie die onderzocht wordt.

Bereid vervolgens twee Xcel-kweekmediums voor door één gram poedermedium en 0,2 gram natriumbicarbonaat op te lossen in gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 milliliter. Laat dit medium door een 0,2 micron filter gaan. Voeg extra componenten toe die nodig zijn voor normale kweek van de cellijn van belang.

Groei bijvoorbeeld de CMT 1 67-cellijn in RPMI 1640-medium dat is aangevuld met 10%FBS en 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Verwarm het medium voor gebruik tot 37 graden Celsius in een waterbad. Bereid nu één Xcel-kweekmedium voor.

Bereid vervolgens 1%edel agar voor door één gram edel agar toe te voegen aan 100 milliliter gedeïoniseerd water. Bereid daarna 0,6%edel agar door 0,6 gram edel agar toe te voegen aan 100 milliliter gedeïoniseerd water. Autoclaveer vervolgens de edel agar-mengsels.

Maak vervolgens een nitroblauw tetra oleumchloride-stockoplossing van één milligram per milliliter in één XPBS voor het kleuren van de kolonies. In deze procedure, verwarm de fles met 1%edel agar gedurende ongeveer één tot twee minuten in een magnetron. Houd de oplossing nauwlettend in de gaten om overkoken te voorkomen.

Vervolgens verwarmen en mengen we onderbrekingen tot de agar volledig is opgelost en de oplossing helder is. Plaats vervolgens de gesmolten agar-oplossing en het voorverwarmde twee-x-kweekmedium in een ijsemmer gevuld met 42 graden Celsius. Kraanwater.

Plaats bovendien een 50 milliliter conische buis in een buishouder in de ijsemmer met heet water. Breng vervolgens de emmer over naar de celkweekkap. Voeg vervolgens zes milliliter kweekmedium en zes milliliter van de 1%edel agar-oplossing toe aan de 50 milliliter conische buis.

Pipetteer meerdere keren op en neer om te mengen. Werken op een snel tempo zal voortijdig verharden van de zachte agar voorkomen. Trek vervolgens ongeveer 5,5 milliliter van het mengsel op met een vijf milliliter serologische pipette.

Laat de luchtbellen stijgen naar de bovenkant van de pipettenkolom. Deponeer vervolgens 1,5 milliliter van het mengsel in elk putje en vermijd het deponeren van luchtbellen. Bedek de plaat en laat het agarmengsel gedurende 30 minuten in de celkweekkap bij kamertemperatuur stollen.

Haal eerst de cellen binnen met trypsine en verdun ze een op vijf in kweekmedium in een 15 milliliter conische buis. Tel de cellen en bereken het aantal cellen dat per putje nodig is om op dit moment een eindcellentredding voor te bereiden. Smelt vervolgens 0,6%agar op in een magnetron.

Plaats deze in een ijsemmer met heet water samen met een 50 milliliter conische buis in een buishouder en de eindcellentredding. Breng vervolgens de ijsemmer met gesmolten 0,6%agar over naar de celkweekkap voor de volgende stappen. Om een totaal volume van 12 milliliter cellentredding voor een zes-puttenplaatje te bereiden, pipet eerst zes milliliter cellentredding in de 50 milliliter conische buis.

Voeg vervolgens zes milliliter 0,6%agar toe aan de buis. Houd het mengsel op 42 graden Celsius om voortijdige verharding te voorkomen en de celoverleving te maximaliseren. Pipetteer het mengsel vervolgens snel, twee tot drie keer om de cellen te verdelen.

Trek 5,5 milliliter van het mengsel op met een vijf milliliter serologische pipette en laat eventuele luchtbellen stijgen naar de bovenkant van de pipettenkolom. Deponeer vervolgens 1,5 milliliter van het mengsel in elk putje. Laat het cellen-agarmengsel 30 minuten stollen in de celkweekkap bij kamertemperatuur voordat het in een 37 graden Celsius bevochtigde celkweekincubator wordt geplaatst.

Voeg twee keer per week 100 microliters groeimedium toe aan de bovenste agarlaag om uitdroging te voorkomen en gedurende ongeveer 21 dagen wachten op voldoende kolonievorming. Om de cellen te kleuren, voeg 200 microliters nitroblauw tetra oleumchloride-oplossing toe aan elk putje en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius. Zodra de kolonies zijn gekleurd, maak foto's van de putjes met behulp van de beeldvormer en tel de kolonies met behulp van beeldanalysesoftware.

Hier wordt de zachte agar-kolonievormingstest getoond van vector die CMT 1 67 LNCX LPC X-cellen en CMT 1 67 LL went seven a frizzled nine overexpressiecellen uitdrukt. De vector die CMT 1 67 L en CXL PC X-cellen en CMT 1 67 LL went seven a f frizzled. Negen overexpressiecellen werden geplaatst in een zachte agar-kolonievormingstest. CMT 1 67 LL went seven frizzled negen cellen vertoonden een duidelijke afname in kolonievorming na zijn ontwikkeling.

Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van kankeronderzoek de weg geëffend om cellulaire transformatie in vitro te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u cellen kunt beoordelen op ankeronafhankelijke groei.