Name: Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Leer hoe fibrinegel-implantatie op de long van een muis wordt gebruikt om longspecifieke angiogenese en alveolaire regeneratie te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in weefselregeneratieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door fondsen van de American Heart Association (AM), het Amerikaanse ministerie van Defensie (BC074986), en Boston Children&#39;s Hospital faculteit Career Development Fellowship (TM, AM). De auteurs danken Amanda Jiang en Elisabeth Jiang voor technische ondersteuning.

NB: De in vivo dierlijke studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Het protocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van Boston Children&#39;s Hospital (Protocol Nummers: 13-10-2526R, 14-02-2568R) goedgekeurd. Alle geneesmiddelen die gebruikt worden in dit protocol zijn van farmaceutische kwaliteit en deze geneesmiddelen worden bereid onder steriele omstandigheden. 1. fibrinegel Voorbereiding <ol><li> Bereid fibrine gel die VEGF en bFGF bevat. <ol><li> Ontdooi voorraadoplossingen van fibrinogeen en trombine die zijn opgeslagen bij -80 ° C tot kamertemperatuur (25 ° C). </li><li> Voeg trombine (eindconcentratie: 2,5 U / ml), CaCl2 (eindconcentratie 45 mM), VEGF (eindconcentratie: 0-100 ng / ml) en bFGF (eindconcentratie: 0-100 ng / ml) aan de fibrinogeen oplossing (eindconcentratie: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium-oplossing 43-45) in een 1,5 ml buis. </li><li> Meng voorzichtig door pipetteren. </li><li> Zachtjes pipet 200 ul van het mengsel op een steriele plastic schaaltje in een drop-wise mode behulp p200 pipet. </li><li> Incubeer de druppels bij 37 ° C gedurende 30-60 min tot ze stollen. OPMERKING: De gestolde gel kan in de afgesloten plastic schaaltje bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende verscheidene uren bewaard voor de implantatie (figuur 1a). </li></ol></li><li> Trim de fibrine gel in ongeveer 3 x 3 x 3 mm blokjes met behulp van kleine chirurgische schaar voor implantatie. </li></ol> 2. Muis Voorbereiding <ol><li> Verdoven volwassen muizen (8-12 weken) door intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en bevestigen dat de muis voldoende is verdoofd door knijpen teen van de muis. <ol><li> Gebruik vet zalf op de ogen van de muis tot droog tijdens het experiment te voorkomen. </li></ol></li><li> Shave fur over de linkerkant van de ribbenkast van de muis. </li><li> Voeren endotracheale intubatie van de muis. </li><li> Plaats de muis op de intubatie stand een hoek van 70 ° en houd muis plaats door het inhaken van de bovenste snijtanden over een kleine rubberen band aan de bovenkant van de voet. </li><li> Zachtjes trekken de tong aan de ene kant het gebruik van botte tang. </li><li> Visualiseren strottenhoofd met behulp van een vezeloptische illuminator zwanenhals microscoop. </li><li> Plaats endotracheale elastische katheter (21 G) in de luchtpijp. </li><li> Bevestigen dat de muis spontaan ademt in een vlotte manier (reguliere 100-150 ademhalingen / min, geen paradoxale of oppervlakkige ademhaling). </li><li> Plaats de muis in buikligging onder de dissectie microscoop. </li><li> Mechanisch de muis met behulp van een knaagdier ventilator ventileren (150 ademhalingen / min en 7 ml / kg ademvolume). </li><li> Count ribben naar intercostale ruimte vinden tussen de 4 e en 5 e rib. </li><li> Maak een steriel veld over het gebied by grondig afvegen met alcohol en povidonjood. Bedek het chirurgische veld voldoende met een steriele chirurgische doek. </li></ol> 3. Mouse Chirurgie <ol><li> Na lokale injectie van 0,25% bupivacaïne (200 pl) in de huid, maken een dwarse incisie (ongeveer 1 cm lang) via intercostale ruimte met Prepareerschaar. </li><li> Na injectie van 0,25% bupivacaïne (200 pl) in de intercostale spieren, maak een spier incisie tussen de 4 e en 5 e rib met fijne, kleine schaar. </li><li> Plaats een ontleden oprolmechanisme tussen de ribben aan de linker long volledig te visualiseren. <ol><li> Schraap een klein gebied (1 x 1 mm vierkant) van viscerale pleura van het midden van de linker long met fijne pincet. </li><li> Pas lichte druk op het gebied met behulp van een steriel wattenstaafje tot bloeden en luchtlekken volledig worden gecontroleerd. </li><li> Doe kleine hoeveelheid verse mengsel van fibrinogeen / trombine (fibrine lijm) (stap 1.1.2. 20 &amp; #181; l) in het gebied met behulp van p200 pipet. </li></ol></li><li> Plaats voorzichtig een fibrinegel (stap 1.2) met behulp van kleine tang over het gebied (figuur 1b). <ol><li> Bevestigen dat de gel goed tijdens ademhalingsbewegingen van de long is gefixeerd op het gebied. </li></ol></li><li> Zorg ervoor dat er geen massale lucht lekken of bloeden uit de longen. </li><li> Close insnijdingen (spier- en huidlagen) met absorbeerbare hechtdraad, die niet hoeft te worden verwijderd. </li><li> Zuig de borstholte met behulp van 27 G naald en 1 ml spuit om pneumothorax te voorkomen. </li><li> Beëindigen mechanische ventilatie. </li></ol> 4. Muis Recovery <ol><li> Zorg ervoor dat de muis is spontaan ademen op een vlotte manier (reguliere 100-150 ademhalingen / min, geen paradoxale of oppervlakkige ademhaling). </li><li> IP Injecteer 1 ml voorverwarmde 0,9% NaCl om uitdroging te voorkomen. </li><li> Laat de muis om te herstellen van de circulerende warm water pad. </li><li> Verwijder de endotracheal buis na het bevestigen dat de muis heeft stabiele ademhaling. </li><li> Injecteer Meloxicam (5 mg / kg, subcutaan (SC), gedurende 3 dagen postoperatieve analgetische. </li><li> Controleer de bewegingen van de muis voorzichtig op minimaal 15 min intervallen totdat het borstbeen (kunnen rollen op de buik en rechtop blijven) en bewuste. </li><li> Na herstel, terug de muis om een ​​nieuwe kooi geïsoleerd van muizen zonder operatie. </li><li> Toezien op de chirurgische site voor tekenen van infectie (roodheid, zwelling, afscheiding), elementaire biologische functies dier (voedsel en water drinken, plassen, ontlasting, gewichtstoename), evenals de klinische tekenen van nood (pilo-erectie, verminderde motoriek) per dag na de chirurgische ingreep. </li></ol> 5. Het oogsten van de Lung <ol><li> 7 tot 30 dagen na implantatie, euthanaseren de muis met CO 2 via bron van samengeperst gas. </li><li> Maak een incisie tussen het uiteinde van xyphoid proces en het borstbeennotch (mediane sternotomie) en oogsten hele long met de geïmplanteerde gel voor histologische en biochemische analyse hierdoor de luchtpijp en ontleden van alle verbindingen met het hart, longen en luchtpijp. </li><li> Fix geïmplanteerde gel met long met 4% paraformaldehyde oplossing overnacht bij 4 ° C, in te bedden in oktober verbinding, en neem seriële stap secties van 30 micrometer dik. </li><li> Voeren histologische (hematoxyline en eosinekleuring) en immunohistochemische analyses (endotheel marker: CD31, epitheliale marker: aquaporin (AQP) 5 en surfactant eiwit (SP) -B) met behulp van confocale microscoop 22,37,40. </li><li> Stel stapels optische secties (30 um dik) om driedimensionale beelden long endotheel- en epitheelcellen met 3D-beeld analyse software 37 vormen. </li><li> Kwantificeren geprojecteerd gebieden van nieuw gevormde bloedvaten met behulp van software voor beeldanalyse 46. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit artikel introduceert een nieuwe methode om biomaterialen implanteren op de long oppervlak van levende volwassen muis. Met dit systeem wordt gastheer long-afgeleide angiogenese succesvol geïncorporeerd in het materiaal. Dit systeem stelt onderzoekers overspraak staand tussen endotheelcellen, andere cellen (bijvoorbeeld epitheliale cellen, mesenchymale cellen, immuuncellen) en verschillende ECM componenten die nodig zijn voor lokale angiogenese 50-53 en alveolaire regeneratie 24,54. Hoew...

De algemene doelstelling van dit protocol is een methode te introduceren aan fibrine gel implantaat op de long oppervlak van volwassen muizen, die het mogelijk maakt de onderzoekers om de moleculaire mechanismen van long vasculaire en alveolaire ontwikkeling karakteriseren, en om deze kennis benutten om biomimetic materialen die te ontwikkelen van recapituleren fysiologische long vasculaire en alveolaire vorming van diverse longziekten behandelen. Meer dan 35 miljoen Amerikanen lijden aan chronische longziekten waaronder chronische obstructieve longziekte en pulmonaire fibrose. Deze patiënten hebben een langdurige chronische respiratoire symptomen zoals kortademigheid, pijn op de borst, zeurende hoest, en vermoeidheid, die hun dagelijks leven 1-3 aanzienlijk beperken. Ondanks een grote hoeveelheid inspanning om effectieve therapieën voor deze longziekten te ontwikkelen, momenteel is er geen genezing; Daarom, de kwaliteit van leven voor deze patiënten is slecht en de economische en menselijke kosten zijn high 4-7. Momenteel longtransplantatie is de enige manier om patiënten met eindstadium van chronische longziekten op te slaan. Vanwege het gebrek aan transplantatie donoren, hoge kosten, ernstige complicaties en lage overlevingspercentage 8-11, transplantatie geen optimale benadering. Recente snelle vooruitgang in de tissue engineering technieken heeft onderzoekers nodig om implanteerbare long bio-ingenieur door herbevolken gedecellulariseerde hele long met diverse soorten stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 12,13. Echter, deze bioengineered longen functioneel in gastheerdieren slechts enkele uren na implantatie 12,14,15. Gebruik makend biomaterialen de complexe structuren en functies van de longen regenereren is ook tamelijk succesvol. Dit kan zijn omdat de belangrijkste biologische processen die volwassen longen regeneratie regeren zijn niet goed onderzocht. In de long, vorming van het vasculaire systeem is een van de vroegste en belangrijkste gebeurtenissen during ontwikkeling en regeneratie 16-21. Nieuw gevormde vasculatures in de long leveren niet alleen zuurstof, voedingsstoffen en diverse mobiele componenten die nodig zijn voor orgel vorming, maar ook leerzaam regulerende signalen naar omliggende cellen 22-25. Zo angiogenese speelt een belangrijke rol in de regeneratieve alveolarization bij volwassen longen 24,26,27. Bovendien gedereguleerde angiogenese bijdraagt ​​aan chronische longziekten zoals chronische obstructieve longziekte (COPD) 28, bronchopulmonaire dysplasie (BPD) 21-23 en longfibrose 29. Dus om efficiënter uit manipuleren longen of behandelen van chronische longziekten ontwikkelen is het noodzakelijk om het werkingsmechanisme van long-specifieke angiogenese begrijpen. Elk orgaan geeft unieke mechanische en chemische eigenschappen, die kan verschillen tussen fysiologische en pathologische omstandigheden 30-33. Deze orgaanspecifieke microenvironmenten reguleren endotheelcellen gedrag en orkestreren vasculaire netwerkvorming in een orgaan-specifieke manier 24,34-36. Dus om efficiënter uit long regeneratie ontwikkelen, het mechanisme dat long-specifieke angiogenese te worden begrepen. Terwijl conventionele in vivo angiogenese assays zoals subcutane implantatie hydrogel zijn uitgebreid gebruikt voor angiogenese onderzoek 37-39, hebben deze methoden niet herhalen orgaanspecifieke angiogenese. Onlangs is een nieuwe werkwijze te Matrigel implanteren in een elastische schimmel op de muizenlong ontwikkeld en getoond bloedvaten en long epitheelcellen in de gels 22 succesvol werven. Deze unieke benadering kunnen de onderzoekers het mechanisme van long-specifieke angiogenese alsmede interactie tussen bloedvaten en niet-vasculaire longcellen verkennen in fysiologische en pathologische omstandigheden. Sinds 1) Matrigel is niet geschikt voor klinische toepassing; 2) elastic mal gebruikt om de gel kunnen beïnvloeden interacties tussen hydrogels en gastheer longweefsel en 3) de elastische schimmel op de longen veroorzaakt potentieel verminderde longfunctie en pijn tijdens de ademhaling gegoten als een klinisch relevante benadering een 3D fibrine matrix die angiogene factoren (vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) / basische fibroblast groeifactor (bFGF)) is geïmplanteerd op de muizenlong zonder gieten de elastische matrijs, en met succes geïncorporeerd gastheer-long afgeleide angiogenese. Fibrinegel, polymeer fibrillen gegenereerd uit trombinegekliefde fibrinogeen, bekend te vangen diverse angiogene factoren zoals bFGF en VEGF angiogenese versnellen vivo 40,41. Door zijn regeneratieve vermogen en biologisch afbreekbaar 42 wordt fibrine gel veel gebruikt op het gebied van weefselmanipulatie. Dit artikel introduceert een nieuwe en unieke benadering van fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende adult muis en toont aan dat gastheer-long afgeleide angiogenese wordt geïncorporeerd in de gel in vivo. Deze methode, die onderzoekers in staat stelt long-specifieke angiogenese, zal waarschijnlijk leiden tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor verschillende typen longziekten en pogingen tot volwassen long succes regenereren aanzienlijke vooruitgang.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogeen van menselijke placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>Voor het maken van fibrinegel</td></tr><tr><td>Trombine van bovien plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>Voor het maken van fibrinegel</td></tr><tr><td>Recombinant muis VEGF 164</td><td>R&amp;D</td><td>493-MV</td><td>Voor suppletie naar fibrinegel</td></tr><tr><td>Recombinant muis bFGF</td><td>R&amp;D</td><td>3139-FB</td><td>Voor suppletie naar fibrinegel</td></tr><tr><td>Intubatiestandaard voor knaagdieren</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>Voor intubatie</td></tr><tr><td>Vezeloptische lichtbron</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>Voor intubatie</td></tr><tr><td>21 G Elastische katheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>Voor intubatie</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>Voor ventilatie</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscoop</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>Voor chirurgie</td></tr><tr><td>Absorbeerbare hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Chirurgische hechting</td></tr><tr><td>Antilichaam tegen CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemie</td></tr><tr><td>Antilichaam tegen AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemie</td></tr><tr><td>Antilichaam tegen SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemie</td></tr></tbody></table>

implantatie van fibrinegel op muis lung naar lung-specifieke angiogenese

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recente significante vooruitgang in het onderzoek naar stamcellen en bio-ingenieur technieken hebben grote vooruitgang geboekt in het gebruik van biomaterialen om zich te vernieuwen en te herstellen schade in eenvoudige weefsels in de orthopedische en parodontale velden. Pogingen om de structuren en functies van meer complexe driedimensionale (3D) organen zoals de longen regenereren weinig succesvol geweest omdat de biologische processen van orgaanregeneratie zijn niet goed onderzocht. Het wordt steeds duidelijker dat de angiogenese, de vorming van nieuwe bloedvaten, speelt een belangrijke rol bij orgel regeneratie. Nieuw gevormde vasculatures leveren niet alleen zuurstof, nutriënten en verschillende celcomponenten die vereist zijn voor orgaanregeneratie maar ook leerzaam signalen aan de regenererende lokale weefsels. Daarom, om de longen bij een volwassene succes regenereren, moet de long-specifieke micro-omgevingen waarin angiogenese aandrijvingen herstel van lokaal longweefsel recapituleren. Hoewel conventional in vivo angiogenese assays, zoals subcutane implantatie van extracellulaire matrix (ECM) -rijk hydrogels (bijvoorbeeld, fibrine en collageen gels of Matrigel - ECM-eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom cellen), worden op grote schaal gebruikt om het verkennen algemene mechanismen van angiogenese, long-specifieke angiogenese niet goed gekarakteriseerd omdat werkwijzen voor orthotope implantatie van biomaterialen in de longen niet goed vastgesteld. Het doel van dit protocol is om een ​​unieke methode te introduceren in fibrine gel implantaat op de long oppervlak van levende volwassen muis, waardoor de succesvolle recapitulatie van gastheer-long afgeleid angiogenese in de gel. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om de mechanismen die de long-specifieke micro-omgeving controleert angiogenese en alveolaire regeneratie in zowel normale en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Sinds geïmplanteerde biomaterialen vrijkomen en leveren fysieke en chemische signalen naar aangrenzende lung weefsels, kan implantatie van deze biomaterialen op zieke long potentieel normaliseren aangrenzende zieke weefsels, waardoor onderzoekers nieuwe therapeutische benaderingen van verschillende soorten longziekten ontwikkelen.

Om te onderzoeken of gastheer-long afgeleide vasculaire vorming geïncorporeerd in de biomaterialen geïmplanteerd op de longen, fibrine gels aangevuld met belangrijke angiogene factoren VEGF en bFGF (0, 10 en 100 ng / ml elk) werden geïmplanteerd op het oppervlak van levende muis longen gerapporteerd met behulp van Matrigel 22. Fibrinegelen 47 dat deze angiogene groeifactoren bevatten werden vervaardigd zoals getoond in figuur 1a. Na thoracotomie werd een klein gebied van de linker ...

Een overzicht van de orgaanspecifieke micro-omgeving, die lokale angiogenesis stimuleert, is onmisbaar voor succesvolle regeneratie van beschadigde weefsels. Dit rapport demonstreert een nieuwe methode om fibrinegels op het longoppervlak van een levende muis te implanteren om te onderzoeken hoe de longspecifieke micro-omgeving angiogenese en alveolaire regeneratie bij volwassen muizen moduleert.

Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om fibrinegel-implantatie te gebruiken om vasculaire en alveolaire regeneratie in de muizenlong te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst druppels fibrinegel te bereiden, aangevuld met angiogenesefactoren. In de tweede stap wordt het proefdier mechanisch beventild en wordt de borstkas geopend.Vervolgens wordt een fibrinegel voorzichtig aan de muizenlong bevestigd met fibrinekleefstof. En dan in de laatste stap worden de long en het geïmplanteerde gel zeven tot 30 dagen later geoogst voor histologische analyse. Uiteindelijk kan de bloedvat- en alveolaire vorming binnen het gel-implantaat worden beoordeeld door immunohistochemische analyse.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van vasculaire biologie, zoals hoe de micro-omgeving van het orgaan risico's, angiogenese bestuurt en orgaanmorfogenese, waarbij wordt aangetoond dat de procedure een model zal zijn voor een collega uit ons laboratorium. Om fibrinegels te bereiden die zowel VEGF als BFGF bevatten, begint u door minus 80 graden Celsius, voorraden van fibrinogeen en trombine, te verwarmen tot kamertemperatuur. Wanneer de voorraden volledig zijn ontdooid, voegt u trombinecalciumchloride VEGF en BFGF toe aan de fibrinogeenoplossing in een buisje van 1,5 milliliter. En meng vervolgens de oplossing door te pipetten.Pipet vervolgens voorzichtig 200 microliter van het mengsel, druppel voor druppel, op een steriele plastic schaal. Bewaar de druppels gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius totdat ze zijn gestold. Gebruik vervolgens kleine chirurgische scharen om de gels bij te snijden tot ongeveer drie bij drie bij drie millimeter kubussen.Nadat u de volledige sedatie bij een muis van acht tot 12 weken oud hebt bevestigd door op de teen te knijpen, bedekt u de ogen van het dier met vetzalf om uitdroging te voorkomen en scheer vervolgens het haar boven de linkerkant van de ribbenkast. Voor endotracheale intubatie plaatst u de muis op een intubatiestandaard die onder een hoek van 70 graden staat en haakt u de bovenste snijtanden over een klein rubberen bandje dat zich bovenaan de standaard bevindt om het dier op zijn plaats te houden. Gebruik stompe pincetten om voorzichtig de tong naar één kant te trekken en visualiseer vervolgens de larynx met behulp van een fiberoptische gooseneck microscoopverlichter.Breng vervolgens een elastische endtracheale katheter van 21 gauge in de luchtpijp in. Bevestig dat de muis spontaan soepel ademt en plaats vervolgens het dier in de buikligging onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een knaagdierventilator om het dier mechanisch te beventilen met 150 ademhalingen per minuut en een tijdelijk volume van zeven milliliter per kilogram.Tel vervolgens de ribben om de intercostale ruimte tussen de vierde en vijfde rib te lokaliseren. Veeg vervolgens het gebied grondig af met alcohol en povidonjodium om een steriele omgeving te creëren en bedek het chirurgische gebied met een steriele tra om het gel op de long te plaatsen. Maak vervolgens een snede van een centimeter in de huid over de intercostale ruimte.Maak vervolgens een spierincisie tussen de vierde en vijfde rib. Breng een dissectief retractor tussen de ribben om de linkerlong volledig te visualiseren en gebruik vervolgens fijne pincetten om een ​​vierkant van één op één millimeter visceraal pleura vanuit het midden van de linkerlong te schrapen met behulp van een steriele wattenstaafje. Oefen vervolgens zachte druk uit op het gebied totdat het bloeden en de luchtleks volledig zijn onder controle en verdeel vervolgens een kleine hoeveelheid ongestolde fibrinogeen-trombine-lijm over het gebied.Plaats vervolgens voorzichtig een fibrinegel op de lijm en observeer de ademhalingsbewegingen van de long om te bepalen of de gel goed is bevestigd. Sluit vervolgens de incisies met een absorberbare hechting. Aspireer de borstholte met een spuit van één milliliter die is uitgerust met een naald van 27 gauge om pneumothorax te voorkomen en beëindig vervolgens de mechanische beademing.Nadat u hebt bevestigd dat de muis soepel ademt, injecteert u één milliliter voorafgaand 0,9% natriumchloride intraperitoneaal om uitdroging te voorkomen en laat u de muis herstellen op een circulerend warmwaterkussen. Zodra het dier stabiel ademt, verwijdert u de endotracheale buis en injecteert u een postoperatief analgeticum. Wanneer het dier volledig is hersteld, plaatst u het in een nieuwe kooi geïsoleerd van muizen zonder operatie en bewaakt u het dier dagelijks op tekenen van infectie of complicaties.Zeven tot 30 dagen na de implantatie, euthanasieert u de muis volgens het protocol en maakt u een incisie tussen de punt van de xiphoïdprocess en de sternaalnaad. Snijd vervolgens de luchtpijp en alle verbindingen van de long tot het hart en de luchtpijp, verzamel het hele longweefsel en het geïmplanteerde gel en fixeer vervolgens het gel en longweefsel gedurende een nacht bij vier graden Celsius in een 4% paraformaldehyde-oplossing. De volgende dag bedden u het longweefsel in OCT-compound en verzamel vervolgens seriële stapsgewijze secties van de long en het gel met een dikte van 30 micrometer. Verf de secties met hematine en eoin en antilichamen tegen de juiste markers van belang. Vervolgens, na het maken van Zack-beelden van de secties, verzamel u stapels van de optische secties om driedimensionale beelden van de longendotheel- en epitheelcellen te vormen. Gebruik 3D-beeldanalysesoftware. Ten slotte kwantificeert u de geprojecteerde gebieden van de nieuw gevormde bloedvaten met behulp van de juiste beeldanalysesoftware.Zeven dagen na implantatie is het fibrinegel in het gastheerlongweefsel opgenomen. 3D reconstructie van confocale fluorescentiebeelden heeft aangetoond dat gastheerafgeleide CD 31 positieve endotheelcellen zeven dagen na implantatie in een A-V-E-G-F-B-F-G-F dosisafhankelijke manier vasculaire netwerken vormen binnen de gels. Type een aquaporine vijf positieve en type twee surfactanteiwit B positieve longepitheelcellen worden ook gerekruteerd langs de nieuw gevormde bloedvaten in de gels die zijn aangevuld met hogere concentraties VGF en B

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De long is doorbloed door zowel de systemische bronchiale arterie en longslagaders. In de meeste long ziekten is de kleinere systemische vasculatuur die robuust neovascularisatie toont. Beëindiging van pulmonale bloedstroom bevordert stevige bronchiale angiogenese. Wij bieden chirurgische details van het induceren van linker longslagader ischemie dat bronchiale neovascularisatie bevordert.

Angiogenese in het ischemische Rat Lung

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij...

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Beschrijven we een niet-invasieve multimodale aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordelingvan de muismodel van lung fibrosis geïnduceerd door dubbele intratracheale instillatietest van bleomycine imaging.

Een multimodale Imaging aanpak op basis van Micro-CT en fluorescentie moleculaire tomografie voor longitudinale beoordeling van bleomycine-geïnduceerde Lung Fibrosis in muizen

Beschrijven we een methode om engraftment van de orthotopic van longkanker kankercellen in de longen lymfkliertest aanzienlijk te verbeteren door preconditionering van de luchtwegen met blessure. Deze benadering kan ook worden toegepast om te studeren stromale interacties binnen de longen communicatie, gemetastaseerde verspreiding, long kanker co morbiditeit en efficiënter genereren patiënt afgeleid xenografts.

Preconditionering de luchtwegen van muizen met bleomycine verhoogt de efficiëntie van Orthotopic long kanker cel Engraftment

Hier presenteren we een effectieve methode voor het onderzoeken van de antifibrotische activiteit van intraveneus geïnfundeerde humane mesenchymale stromale cellen verkregen uit de gehele navelstreng na de inductie van long letsel door een Endotracheale injectie van bleomycine in C57BL /6 muizen. Dit protocol kan eenvoudig worden uitgebreid tot de preklinische testen van andere therapieën.

Inductie van muis long letsel door Endotracheale injectie van bleomycine

Hier presenteren we een protocol voor de chirurgische implantatie van een permanent inwonend optisch venster voor de muriene thorax, dat een hoge resolutie, intravitale beeldvorming van de long mogelijk maakt. De duurzaamheid van het venster maakt het zeer geschikt voor de studie van dynamische cellulaire processen in de longen, vooral die welke langzaam evolueren, zoals gemetastaseerde progressie van verspreide tumorcellen.

Een permanent venster voor het onderzoeken van kankermetastase naar de longen

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Dit artikel beschrijft hoe bio-engineered muizenlongen kunnen worden gemaakt met behulp van decellularisatie- en recellularisatiemethoden. Het beschrijft ook de daaropvolgende orthotope longtransplantatie.

Transplantatie van bio-engineered long met behulp van gedecellulariseerde muizenlongen en primaire menselijke endotheelcellen

Celtherapie biedt een veelbelovende interventie voor longfibrose door voorlopercellen te gebruiken om beschadigd weefsel te herstellen en de longfunctie te verbeteren. Aangezien beeldvorming een cruciale rol speelt bij het volgen van celintegratie, beschrijven we hierin magnetische beeldvorming-geleide in vivo tracking van celtherapie voor longfibrose in een muismodel.

Beeldgeleide in vivo tracking van getransplanteerde distale longepitheliale voorlopercellen voor longfibrose met behulp van magnetische beeldvorming

Leer hoe fibrinegel-implantatie op de long van een muis wordt gebruikt om longspecifieke angiogenese en alveolaire regeneratie te bestuderen. Deze methode biedt inzicht in weefselregeneratieprocessen.

Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese

Meer video's verkennen