Name: Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer confocale microscopie voor het analyseren van fibrinestolselstructuren bij diabetes en sikkelcelanemie. Deze methode toont morfologische verschillen en fibrinolyserates in ziektegerelateerde stolsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de Lam Lab bij Georgia Tech bedanken voor vele nuttige discussies bij het ontwikkelen van de experimentele assays. Het onderzoek dat in deze publicatie is gerapporteerd, werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder Award Nummer K01HL115486 en door New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 van het Office of the Director, National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

OPMERKING: Het volgende protocol houdt zich aan de door de Institutional Review Board (IRB) in te stellen aan de Georgia Tech richtlijnen. 1. bloedafname en rode bloedcellen isolatieprocedure <ol><li> Verzamel 40-120 ml bloed donoren in 10 ml gehepariniseerde Vacutainer buizen. Start PBMC (perifere bloed mononucleaire cellen) isolatie binnen 4 uur van de collectie. Gedurende deze tijd, blijven bloed bij KT. OPMERKING: O / N opslag van bloed in RT of in 4 ° C wordt niet aanbevolen, omdat dit zal leiden tot lagere PBMC opbrengst. </li><li> Verdun volbloed 1: 1 in ijskoude (4 ° C) steriel PBS. </li><li> Pipetteer 10 ml van ijskoude hydrofiele polysaccharide in een lege, steriele 50 ml conische buis. Zacht overdracht verdund volbloed bovenop de hydrofiele polysaccharide. </li><li> Gebruik een pipet 25 ml in slow-instelling en de pipet bloed langs de kant van de buis heel langzaam. Zorg ervoor dat het bloed niet wordt gemengd met de saccharide vóór Centrifugation omdat de hydrofiele polysaccharide is giftig voor cellen en anders de PBMC rendement lager. </li><li> Centrifuge bloedmonsters gedurende 30 min bij 400 xg bij 4 ° C. Indien beschikbaar, verminderen de rem snelheid van de centrifuge helft van maximum betere scheiding na centrifugeren. </li><li> Zuig uit het plasma / bloedplaatjes fractie van de gecentrifugeerd bloedmonster. Aspireren voorzichtig de hydrofiele polysaccharide laag direct boven de verpakte RBC laag. </li><li> Verzamel 8-10 ml van verpakte RBC en verdunnen 1: 1 met niet-steriele 0,9% NaCl zoutoplossing. </li></ol> 2. confocale microscopie Evaluatie van Geglyceerde Clot Structures (Simulated Diabetische Klonters) <ol><li> Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C. </li><li> Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje. <ol><li> Voor de gezonde, normale fibrinogeen stolsels, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeenconjugaat in 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml. </li><li> Voor kunstmatig geglyceerd fibrinogeen (simuleren diabetische stolsels), incubeer menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gelabelde conjugaat fibrinogeen in een 5 mM oplossing van glucose opgelost in 50 mM Tris / 100 mM NaCl gedurende een resulterende concentratie van 6,8 mg / ml. </li></ol></li><li> Bedek de micro-centrifugebuizen met een opaak materiaal om blootstelling aan licht te vermijden. Incubeer de buizen in een 37 ° C waterbad gedurende 48 uur. </li><li> Maak een kamer op een glazen microscoopglaasje door het aanbrengen van een dunne lijm aan 2 kanten van de dia. </li><li> Na de 48 uur incubatietijd, bereiden reagentia voor fibrinevorming door ontdooien FXIIIa en menselijke alfa trombine bij RT. </li><li> Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer. </li><li> Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer. <ol><li> Voor normale stolsels, ervoor zorgen dat de uiteindelijke concentraties van fibrinogeen, FXIIIa, en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl. </li><li> Voor de geglyceerde stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 3.4 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl. </li></ol></li><li> Onmiddellijk Pipetteer 30 ul van de oplossing fibrine in de kamer gevormd door de kleefstof. </li><li> Plaats een 22 mm x 22 mm glazen dekglas met een dikte van 0,15 mm bovenop de 2 lijmlagen. Verzegel de open zijden met duidelijke lijm te voorkomen dat de fibrine stolsel uitdroogt. Zorg ervoor dat de lijm niet interageren met de fibrinestolsel. </li><li> Laat de fibrineklonters polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming. </li><li> Neem confocale microscopie beelden van de stolsels met behulp van een confocale microscoop met een 40X / 1.30 Olie M27 lens met een 488 nm Argon laser. </li></ol> 3. confocale microscopie Evaluatie van fibrineklonters bevattende RBC uit sikkelcelpatiënten <ol><li> Ontdooi menselijk fibrinogeen en fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat bij 37 ° C. </li><li> Pipet het volgende in een 0,5 ml afgestudeerd microcentrifugebuisje. <ol><li> Voor de gezonde, normale fibrine, mengen menselijk fibrinogeen met 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl buffer bij een concentratie van 5 mg / ml. </li><li> Voor de stolsels die SCD RBCs, meng menselijk fibrinogeen en 10% fluorescent gemerkte menselijke fibrinogeen conjugaat in een 50 mM Tris / 100 mM NaCl zodanig dat de verkregen concentratie van het fibrinogeen 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Label de geïsoleerde RBC (zowel normaal als die van sikkelcelpatiënten verkregen uit de RBC isolatie protocol) met behulp van een cel-labeling oplossing. <ol><li> Suspendeer cellen bij een dichtheid van 1 x 10 6 per ml in elke gewenste serumvrij kweekmedium. </li><li> Voeg 5 ul / ml van de celsuspensie aan de cel-labeling oplossing. Meng goed door zachte pipetteren voorzichtig. </li><li&gt; Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Centrifugeer de suspensie gemerkte buizen bij 1.500 rpm gedurende 5 min bij 37 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de cellen in 37 ° C medium. </li><li> Herhaal het wassen procedure (3.3.4 en 3.3.5) nog twee keer. </li></ol></li><li> Verdun FXIIIa 80 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer. </li><li> Verdun trombine 4 U / ml in 5 mM CaCl2 buffer. <ol><li> Voor normale stolsels, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 2,5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl. </li><li> Voor de stolsels die SCD erytrocyten, opdat de uiteindelijke concentratie van fibrinogeen, FXIIIa en trombine zijn 5 mg / ml, 20 U / ml, en 1 U / ml, respectievelijk een volume van 50 pl. </li></ol></li><li> Pipetteer 10 ul van de gemerkte RBC in de fibrine oplossing. Pipetteer 30 ul van de fibrine met RBC op de microscoop glas (zie voorbereiding op gl schuivenycated stolsels). </li><li> Laat de fibrine polymeriseren bij 21-23 ° C gedurende 2 uur voor confocale beeldvorming. </li><li> Neem confocale beelden van de stolsels met de confocale microscoop en gebruiken excitatie lasers met golflengten van 488 nm en 633 nm om de fluorescent gelabelde fibrine en RBC wekken. </li></ol> 4. confocale microscopie Evaluatie van Fibrinolyse Tarieven in Geglyceerde Clot Structuren <ol><li> Herhaal de confocale microscopie protocol van geglyceerde stolsels (Protocol Stap 2) voor de fibrinolyse tarief evaluatie in geglyceerde stolsels. </li><li> Raak de uiteinden van de kamer met duidelijke lijm niet dichten. Laat de fibrineklonters polymeriseren gedurende 1,5 uur bij 21-23 ° C in een afgesloten omhulling met 250 ml water om uitdroging te voorkomen. </li><li> Na polymerisatie verkregen beelden van de stolsels met de confocale microscoop. </li><li> Pipetteer plasmine in het open einde van de kamer en verspreiden de plasmine door de prop via capillaire werking. <ol><li> Voorde normale en geglyceerd fibrinolyse experimenten met normale concentraties pipet 25 pi 200 pg / ml van plasmine in de opening van de kamer. </li><li> Voor de geglyceerde stolsels met verminderde concentraties pipet 25 ul bij 50 ug / ml in de opening van de kamer. </li></ol></li><li> Gebruik de tijdreeks-functie (zie figuur 1) in de confocale microscoop software om real-time videobeelden van de plasmine lyseren het stolsel te vangen. <ol><li> Klik acquisitie-modus en selecteer vervolgens &quot;Time-serie.&quot; Selecteer het aantal cycli en de opname tijdsinterval. </li></ol></li></ol> 5. Berekening Fibrinolysis tarieven <ol><li> Bepaal de lysis tarief door het instellen van een gebied (2500 um 2) en het berekenen van de verstreken tijd die nodig is om een vast gedeelte van het stolsel op te lossen. Bereken het percentage lysis met de volgende vergelijking (Figuur 2): <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="2in" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52019 / 52019eq1.jpg&quot; /&gt; </li></ol> 6. Statistische analyse van Fibrinolysis Tarieven <ol><li> Analyseer de lysis van gegevens met behulp van statistische analyse software. Voer een one-way ANOVA en een post hoc Tukey-Kramer-test 44,45. </li></ol>

<ol><li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li>
<li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+individual%2C+electrospun+fibrinogen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li>
<li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li>
<li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots+II%3A+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li>
<li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus%2C+creep%2C+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li>
<li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+I.%3A+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li>
<li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li>
<li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li>
<li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li>
<li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Herz%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li>
<li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+a+hypercoagulable+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li>
<li>Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li>
<li>Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li>
<li>American Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/">http://www.diabetes.org/</a> (2014).</li>
<li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li>
<li>Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , 
 Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sicklecelldisease.org/">http://www.sicklecelldisease.org/</a> (2014).</li>
<li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle-cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li>
<li>Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li>
<li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li>
<li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+geographical+medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li>
<li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li>
<li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease%3A+a+curious+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications%3A+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li>
<li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus%3A+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li>
<li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesiveness%2C+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li>
<li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li>
<li>Jörneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li>
<li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner%3A+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li>
<li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li>
<li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li>
<li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation%2C+structure%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li>
<li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties%3A+an+experimental+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li>
<li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anemia%22%5BJournal%5D)">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781(2012).</li>
<li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+sickle-cell+haemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212(1957).</li>
<li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuehl%2C+RO+%22Design+of+experiments+%3A+statistical+principles+of+research+design+and+analysis%22">Design of experiments : statistical principles of research design and analysis</a>. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).</li>
<li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindman%2C+HR+%22Analysis+of+variance+in+experimental+designs%22">Analysis of variance in experimental designs</a>. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).</li>
<li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li>
<li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li>
<li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrinolysis+and+Proteolysis%22%5BJournal%5D)">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om zinvolle gegevens over de structuur van stollingsmechanismen bij ziektetoestanden verkrijgen, is het belangrijk om de bij stolling om de effecten van de eiwitten en cellen onder deze omstandigheden vast factoren te isoleren. Dit protocol werd ontwikkeld ten behoeve van onderzoek naar de structuur van de fibrine klonter in diabetische cardiomyopathie toestanden in vitro. Het is noodzakelijk om de bij de vorming van fibrine en fibrinolyse bij ziektetoestanden aangezien veranderde o...

Letsel aan endotheliale bekleding van een bloedvat wordt hersteld door de hemostatische reactie of de vorming van een bloedstolsel. Wanneer bloed doordringt in de extracellulaire matrix, weefselfactoren activeert bloedplaatjes stroom die initiatie van de coagulatie cascade vergemakkelijken. De belangrijkste mechanische componenten van dit genezingsproces is de fibrine matrix, samengesteld uit fibrine vezels die zeer elastisch, en kan grote krachten 1-4 ondersteunen. Veel onderzoekers hebben de vorming van structuur en functie van fibrine uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia 5-13. Patiënten met ziekten zoals diabetes mellitus en sikkelcel hebben een verhoogd risico op trombotische complicaties zoals myocardinfarct, ischemische hartziekte, en lijnen 14-19. Meer dan 2 miljoen mensen zijn met nieuw gediagnosticeerde diabetes mellitus elk jaar in de Verenigde Staten. Er zijn twee types van diabetes: Type I, waarbij delichaam niet in slaagt om voldoende hoeveelheden insuline, en type II, waar het lichaam resistent wordt voor insuline te produceren. Bij patiënten met diabetes, cardiovasculaire ziekte (CVD) is de oorzaak van 80% van de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met de ziekte 20,21. Sikkelcelziekte (SCZ) is een erfelijke bloedziekte die meer dan 100.000 mensen in de Verenigde Staten 22 beïnvloedt. SCD is een puntmutatie ziekte die rode bloedcellen veroorzaakt halvemaanvormige worden, waardoor het moeilijk voor de cellen door het bloed vasculatuur 23 te passen. Beide ziekten vergroten de kans op het ontwikkelen atherotrombotische omstandigheden in het lichaam. Eén van de redenen hiervoor is een gevolg van veranderde fibrine structuur en functie in zieke toestanden 14,24-26. Zowel diabetes en sikkelcelziekte, is hypercoagulatie en hypofibrinolysis activiteit die atherotrombose en cardiovasculaire ziekte induceert (CVD) in vergelijking met gezonde patiënten 17,27,28. Het is bekend dat hypofibrinolysis bevordert progressie van atherosclerose en wekt terugkerende ischemische gebeurtenissen voor patiënten met premature kransslagaderziekte 29. In de huidige manuscript, onderzochten we de rol van fibrine fysische eigenschappen in deze specifieke setting. Fibrinestolsel structuren niet zieke patiënten bestaan ​​uit dunne vezels, grotere poriën, en meestal minder dichte 14,24. De toegenomen porositeit en minder dichte fibrinestolsels bij gezonde patiënten zijn gevonden fibrinolyse 16 vergemakkelijken. In hyperthrombotic aandoeningen zoals diabetes en sikkelcelziekte, is er een toename van fibrinogeen productie, waardoor het fibrinogeen concentratie toenemen van normale niveaus van 2,5 mg / ml bij gezonde patiënten 30-33. Fibrine stolsels gevormd in diabetespatiënten gevonden minder poreus, stijver te zijn, meer vertakkingspunten en dichtere vergelijking met gezonde, niet-diabetic patiënten 14,24,33-35. De gewijzigde fibrine structuur is een gevolg van glycosylering mechanismen die optreden in de bij stolselvorming eiwitten. Niet-enzymatische (onomkeerbare) glycation treedt op wanneer glucose moleculen binden aan lysine residuen op de fibrinogeen molecuul, dat menselijke factor XIII bis (FXIIIa) niet goed verknoping glutamine en lysineresiduen 33,36,37 remt. De structuuranalyse van fibrine netwerk is uitgebreid recent bestudeerd. In het bijzonder hebben onderzoekers elektronenmicroscopie en 3D reconstructie van fibrine netwerken 38, onderzocht hoe zowel intravasculaire (endotheel) cellen en extravasculaire (fibroblasten en gladde spier) cellen beïnvloeden fibrine structuur 39, gebruikt viscoelastische en spectraalanalyse in fibrine structuren 40 analyseren, en benut ontwikkelde correlaties tussen fibrine structuur en mechanische eigenschappen met behulp van experimentele en computationele benaderingen 41 </sup&gt;. De focus van de huidige studie was om te stollen structuren te formuleren onder gesimuleerde diabetische en sikkelcelziekte trombose voorwaarden en confocale microscopie te gebruiken voor onderzoek naar de structuur en functie van de stolsels in zieke toestanden. Fibrinestolsels gevormd uit humaan fibrinogeen, humaan trombine en FXIIIa. De stolsels werden gelyseerd met plasmine. Om diabetesvoorwaarden simuleren, verhoogde concentratie van fibrinogeen werd geïncubeerd in glucoseoplossing in vitro fibrinogeen glycatie induceren. Aan sikkelcelanemie stolling omstandigheden te simuleren, werden verhoogd fibrinogeen concentraties gemengd met sikkelcelziekte hematocriet verzameld van patiënten zoals eerder gedaan door onze groep 42. Deze methoden werden gebruikt om de structuur en functies betrokken in fibrine stolselvorming en fibrinolyse onder ziektetoestanden, alsmede de mechanismen die CVD induceren onderzocht. Op basis van de huidige informatie over deze ziekten, de geglyceerde fibrinestolsel structuren waren dichter met minder eennd kleinere poriën. De fibrine stolsels met rode bloedcellen van sikkelcel patiënten (RBC) werden ook dichter en weergegeven aggregatie van de rode bloedcellen en fibrine geagglomereerde clusters. Dit is een gevestigde verschijnsel dat eerder 43 bepaald. Ook werd verondersteld dat de fibrinolyse percentage significant lager in geglyceerd fibrinestolsels met en zonder verminderde plasmine vergelijking met gezonde, normale fibrine is. De resultaten toonden dat voor geglycosileerd fibrinestolsels significant verschillend lysis coëfficiënt resulteert alleen in omstandigheden van verminderde concentratie plasmine waargenomen. Deze experimentele techniek van het gebruik van confocale microscopie biedt aanzienlijke voordelen boven andere beeldvormende technieken omdat de cellen en eiwitten blijven in hun natieve toestand, waarbij het vangen van real-time video van de stollingsactiviteit mogelijk maakt. Deze methode van synthetisch inducerende stolling is ook goedkoper en meer tijd efficiënter dan het verkrijgen van monsters van patiënten en te filteren op individueleeiwitten en enzymen. Bovendien, door gescheiden eiwitten en enzymen om stolsels synthetiseren, de stolsels werden gestandaardiseerd zodat er geen variabiliteit tussen monsters als gevolg van andere eiwitten in het plasma.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (hydrofiel polysacharide)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 ml heparinized vacutainer tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml graduated microcentrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glucose powder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Confocal Microscope</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD cell-labeling solution</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plasmin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Statistical Modeling Software</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele en imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel structuren in normale en zieke staten

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

Fibrine is een extracellulair matrixeiwit dat verantwoordelijk is voor het behoud van de structurele integriteit van bloedstolsels. Er is de afgelopen jaren veel onderzoek gedaan naar fibrine, waaronder onderzoek naar de synthese, structuur-functie en lysis van stolsels. Er is echter nog steeds veel onbekend over de morfologische en structurele kenmerken van stolsels die voortvloeien uit patiënten met een ziekte. In deze onderzoeksstudie worden experimentele technieken gepresenteerd die de mogelijkheid bieden om morfologische verschillen van abnormale stolselstructuren te onderzoeken als gevolg van ziekten zoals diabetes en sikkelcelanemie. Ons onderzoek richt zich op de bereiding en evaluatie van fibrine stolsels om morfologische verschillen te beoordelen met behulp van verschillende experimentele tests en confocale microscopie. Bovendien wordt ook een methode beschreven die een continue, real-time berekening van lysissnelheden in fibrine stolsels mogelijk maakt. De hier beschreven technieken zijn belangrijk voor onderzoekers en clinici die comorbide trombotische pathologieën willen verduidelijken, zoals hartinfarcten, ischemische hartziekten en beroertes bij patiënten met diabetes of sikkelcelanemie.

Confocale microscopie Analyse van Geglyceerde fibrinestolsel Structuren De confocale microscopie foto van normale en geglycosileerd stolsels zijn weergegeven in Figuur 3. Confocale microscopie analyse van de normale en geglyceerd bloedstolsels blijkt dat geglyceerd stolsels dichter zijn met kleinere poriën dan de normale stolsels met en zonder toevoeging van FXIIIa tijdens stolsel polymerisatie. In figuur 3A en 3B, is een lagere fibrine conc...

In dit manuscript worden experimentele technieken gepresenteerd, inclusief bloedvoorbereiding, confocale microscopie en lyse-snelheidsanalyse, om de morfologische verschillen tussen normale en abnormale stolselstructuren als gevolg van ziektoestanden te onderzoeken.

Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

Het algemene doel van deze procedure is om de morfologische verschillen in abnormale stolselstructuren te onderzoeken die voorkomen bij diabetes en sikkelcelanemie, ziektecondities voor gesimuleerde diabetische stolsels. Dit wordt bereikt door glycosyleren stolselstructuren te beeldvormen met behulp van confocale microscopie voor bloedmonsters van sikkelcelanemiepatiënten. Fibrine stolsels die rode bloedcellen bevatten, worden in real-time geconfocaliseerd beeldvormd.Microscopie-analyse kan vervolgens worden uitgevoerd om de fibrinolysesnelheden op de normale en glycosyleerde stolselstructuren te evalueren. Uiteindelijk kan deze real-time analyse worden gebruikt om de morfologische verschillen te evalueren die optreden in abnormale stolselstructuren als reactie op de ziektetoestanden waarin ze ontstaan. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van trombose en hemostase te beantwoorden, zoals Hoe zijn fibrinestolselstructuren anders bij patiënten met diabetes of sikkelcelanemie.Om gesimuleerde diabetische stolsels door confocale microscopie te evalueren, ontdooit u eerst menselijk fibrinogeen en 10% fluorescerend gelabeld humaan fibrinogeenconjugaat bij 37 graden Celsius wanneer de oplossingen van opgewarmd gemengd menselijk fibrinogeen en het fibrinogeenconjugaat in een glucosetrics natriumchlorideoplossing worden gemengd en de oplossing beschermd tegen licht gedurende 48 uur in een waterbad van 37 graden Celsius worden geïncubeerd. Tegen het einde van de incubatie, gebruikt u een niet-vloeistofgebaseerde lijm om een dunne lijm op twee zijden van een glazen microscoopglasplaat te bevestigen om een kamer te maken, mengt u vervolgens een fibrinogeenoplossing met kamertemperatuur factor 13 en trombine tot een eindvolume van 50 microliter en brengt u onmiddellijk 30 microliter van de fibrinoplossing over in de kamer van de microscoopglasplaat. Plaats nu een 22 bij 22 millimeter glazen dekglas met een punt van 15 millimeter dikte bovenop de lijm en verzegel de open zijden van de kamer met duidelijke lijm, waarbij u ervoor zorgt dat de lijm niet met het stolsel interactie heeft.Laat de fibrine stolsels twee uur polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius. Vervolgens worden confocale microscoopbeelden van de stolsels verkregen met behulp van een 40 x objectief en een 488 nanometer argonlaser om stolsels van sikkelcelanemiepatiënten te evalueren. Verdun eerst het rode bloedcelmonster op 1 miljoen cellen per milliliter in serumvrij celkweekmedium en meng de cellen met vijf microliters van de juiste cellabelingoplossing door voorzichtig te pipetteren.Na 20 minuten bij 37 graden Celsius, was de cellen drie keer in 37 graden Celsius medium terwijl de cellen in de centrifuge zijn, meng vers bereide fibrinogeenoplossing factor 13 en trombine zoals net gedemonstreerd. Breng vervolgens 10 microliter van de gelabelde rode bloedcellen over in de fibrine-oplossing en doseer onmiddellijk 30 microliter van de celoplossing in een kleefkamer. Laat op een glazen microscoopglasplaat de fibrine na twee uur polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius, verwerf confocale beelden van de stolsels met behulp van excitatielasers met golflengten van 488 nanometer en 633 nanometer om respectievelijk de fluorescerend gelabelde fibrine en rode bloedcellen te exciteren.Om de fibrinolysesnelheden en de glycosyleerde stolselstructuren te evalueren, bereidt u eerst glycosyleerde stolsels zoals net gedemonstreerd. Echter, na het doseren van de fibrine-stolseloplossing in de kleefkamer, verzegelt u de uiteinden van de kamer niet. Laat in plaats daarvan de stolsels polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius in een verzegelde behuizing met 250 milliliter water om uitdroging te voorkomen.Na anderhalf uur, verkrijgt u beelden van de stolsels door confocale microscopie zoals net gedemonstreerd. Pipetteer vervolgens 25 microliter plasmine in het open uiteinde van de kamer en laat de plasmine zich door capillaire actie door het stolsel verspreiden. Open ten slotte de tijdreeksfuncties van de confocale microscoopsoftware, klik op acquisitiemodus en selecteer tijdreeks.Selecteer vervolgens het aantal cycli en het opnametijdsinterval om real-time videobeelden te maken van de plasmine-geïnduceerde stolsellyse-analyse van normale en glycosyleerde stolsels, waaruit blijkt dat glycosyleerde stolsels dichter zijn met kleinere poriën dan normale stolsels, zowel met als zonder toevoeging van factor 13 tijdens stolselpolymerisatie. Inderdaad, in de niet-glycoseerde stolsels, is er een lagere fibrineconcentratie, die een minder dichte structuur creëert dan die welke wordt waargenomen in de glycosyleerde stolsels, die een hogere fibrineconcentratie bevatten. Fibrine stolsels van sikkelcelanemiepatiënten bevatten rode bloedcellen en vertonen dichter structuren dan die van gezonde fibrine stolsels als gevolg van een verhoogde fibrinogeenconcentratie bij deze personen.Bovendien heeft de natuurlijke neiging van rode bloedcellen van sikkelcelanemiepatiënten om aggregaten en genders, klonten van rode bloedcellen die verweven raken in het fibrinenetwerk, te vormen als resultaat de vorming van abnormale stolselstructuren die opmerkelijk verschillend zijn in morfologie van die welke worden waargenomen bij normale patiënten. Ten slotte toont analyse van de fibrinolysesnelheden van normale versus glycosyleerde stolsels een significant verminderd vermogen van de gesimuleerde diabetische stolsels om fibrine te lysen bij afwezigheid van voldoende plasmine. Dit onderzoek zal helpen om de weg te banen voor onderzoekers op het gebied van trombose en hemostase, vooral voor patiënten die comorbide pathologieën ontwikkelen als gevolg van sikkelcelanemie en diabetes.

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the use of a UV-visible spectrophotometer for monitoring insoluble fibrin clot formation as a function of the change in the solution turbidity. The UV-visible spectrophotometer measures the solution’s absorbance over time, which represents the turbidity change due to the insoluble fibrin clot formation.

UV-Visible Spectroscopy for Monitoring Fibrin Clot Formation

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Dit protocol beschrijft de toepassing van gecombineerde nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) beeldvorming en micro-computertomografie (microCT) voor het visualiseren van cerebrale thromboemboli. Deze techniek maakt de kwantificering van trombus last en evolutie. De NIRF beeldvormende techniek visualiseert fluorescent gelabelde trombus in weggesneden hersenen, terwijl de microCT techniek visualiseert trombus in levende dieren met behulp van goud-nanodeeltjes.

Gecombineerde nabij-infrarood Fluorescent Imaging en Micro-computertomografie voor het direct visualiseren Cerebral Thromboemboli

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

Hier zijn twee methoden die afzonderlijk of in combinatie kunnen worden gebruikt voor het analyseren van het effect van bèta-amyloid op fibrine clot structuur. Inbegrepen is een protocol voor het maken van een in vitro fibrine clot, gevolgd door clot turbiditeit en scanning elektronen microscopie methodes.

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Fibrin is verantwoordelijk voor stolselvorming tijdens hemostase en trombose. Troebelheidstesten en tromboelastograhy (TEG) kunnen worden gebruikt als synergetische instrumenten die complementaire beoordeling van een stolsel bieden. Deze twee technieken samen kunnen meer inzicht geven in hoe stollingscondities de vorming van fibrinstolsel beïnvloeden.

Gebruikmaken van troebelheid en trombo-lastografie voor complementaire clot karakterisering

Het huidige protocol beschrijft hoe een FeCl 3-gemedieerd letsel kan worden gebruikt om arteriële trombose te induceren en hoe arteriële letselmonsters in verschillende stadia van trombose kunnen worden verzameld en voorbereid voor elektronenmicroscopieanalyse.

IJzerchloride-geïnduceerde arteriële trombose en monsterverzameling voor 3D-elektronenmicroscopieanalyse

Deze studie beschrijft een snelle en effectieve methode voor de analyse van celcomponenten van cerebrale bloedstolsels door middel van stolseloplossing, celkleuring en routinematig bloedonderzoek.

Een alomvattende benadering om de celcomponenten van cerebrale bloedstolsels te analyseren

In-vitro trombolyse-assays hebben vaak moeite om in-vivo-omstandigheden na te bootsen, of het nu gaat om de modeltrombus die wordt verteerd of in de omgeving waarin trombolyse plaatsvindt. Hierin onderzoeken we hoe de koppeling van de Chandler-lus en Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) wordt gebruikt voor high-fidelity, ex-vivo, stolsellysisbewaking.

Fibrinolyse volgen van Chandler Loop-gevormde volbloedstolsels onder afschuifstroom in een in-vitro trombolysemodel

Dit werk beschrijft een microfluissue-assay die schuifspanning gebruikt om de vorming van tromben in het bloed te triggeren en karakteriseert de trombus aan de hand van meerdere dimensies van uitlezen. De test kan de protrombische neiging van bloedmonsters meten en is daardoor nuttig voor ziektediagnose, geneesmiddelenontdekking, evenals basismechanistische studies gerelateerd aan trombose.

Thrombus Profiling Assay: Een op microfludiica gebaseerd platform voor het volledig karakteriseren van biomechanische trombogenese

Leer confocale microscopie voor het analyseren van fibrinestolselstructuren bij diabetes en sikkelcelanemie. Deze methode toont morfologische verschillen en fibrinolyserates in ziektegerelateerde stolsels.

Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

Meer video's verkennen