Experimentele en Imaging technieken voor de behandeling fibrinestolsel Structuren in normale en zieke Staten

Het algemene doel van deze procedure is om de morfologische verschillen in abnormale stolselstructuren te onderzoeken die voorkomen bij diabetes en sikkelcelanemie, ziektecondities voor gesimuleerde diabetische stolsels. Dit wordt bereikt door glycosyleren stolselstructuren te beeldvormen met behulp van confocale microscopie voor bloedmonsters van sikkelcelanemiepatiënten. Fibrine stolsels die rode bloedcellen bevatten, worden in real-time geconfocaliseerd beeldvormd.

Microscopie-analyse kan vervolgens worden uitgevoerd om de fibrinolysesnelheden op de normale en glycosyleerde stolselstructuren te evalueren. Uiteindelijk kan deze real-time analyse worden gebruikt om de morfologische verschillen te evalueren die optreden in abnormale stolselstructuren als reactie op de ziektetoestanden waarin ze ontstaan. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van trombose en hemostase te beantwoorden, zoals Hoe zijn fibrinestolselstructuren anders bij patiënten met diabetes of sikkelcelanemie.

Om gesimuleerde diabetische stolsels door confocale microscopie te evalueren, ontdooit u eerst menselijk fibrinogeen en 10% fluorescerend gelabeld humaan fibrinogeenconjugaat bij 37 graden Celsius wanneer de oplossingen van opgewarmd gemengd menselijk fibrinogeen en het fibrinogeenconjugaat in een glucosetrics natriumchlorideoplossing worden gemengd en de oplossing beschermd tegen licht gedurende 48 uur in een waterbad van 37 graden Celsius worden geïncubeerd. Tegen het einde van de incubatie, gebruikt u een niet-vloeistofgebaseerde lijm om een dunne lijm op twee zijden van een glazen microscoopglasplaat te bevestigen om een kamer te maken, mengt u vervolgens een fibrinogeenoplossing met kamertemperatuur factor 13 en trombine tot een eindvolume van 50 microliter en brengt u onmiddellijk 30 microliter van de fibrinoplossing over in de kamer van de microscoopglasplaat. Plaats nu een 22 bij 22 millimeter glazen dekglas met een punt van 15 millimeter dikte bovenop de lijm en verzegel de open zijden van de kamer met duidelijke lijm, waarbij u ervoor zorgt dat de lijm niet met het stolsel interactie heeft.

Laat de fibrine stolsels twee uur polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius. Vervolgens worden confocale microscoopbeelden van de stolsels verkregen met behulp van een 40 x objectief en een 488 nanometer argonlaser om stolsels van sikkelcelanemiepatiënten te evalueren. Verdun eerst het rode bloedcelmonster op 1 miljoen cellen per milliliter in serumvrij celkweekmedium en meng de cellen met vijf microliters van de juiste cellabelingoplossing door voorzichtig te pipetteren.

Na 20 minuten bij 37 graden Celsius, was de cellen drie keer in 37 graden Celsius medium terwijl de cellen in de centrifuge zijn, meng vers bereide fibrinogeenoplossing factor 13 en trombine zoals net gedemonstreerd. Breng vervolgens 10 microliter van de gelabelde rode bloedcellen over in de fibrine-oplossing en doseer onmiddellijk 30 microliter van de celoplossing in een kleefkamer. Laat op een glazen microscoopglasplaat de fibrine na twee uur polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius, verwerf confocale beelden van de stolsels met behulp van excitatielasers met golflengten van 488 nanometer en 633 nanometer om respectievelijk de fluorescerend gelabelde fibrine en rode bloedcellen te exciteren.

Om de fibrinolysesnelheden en de glycosyleerde stolselstructuren te evalueren, bereidt u eerst glycosyleerde stolsels zoals net gedemonstreerd. Echter, na het doseren van de fibrine-stolseloplossing in de kleefkamer, verzegelt u de uiteinden van de kamer niet. Laat in plaats daarvan de stolsels polymeriseren bij 21 tot 23 graden Celsius in een verzegelde behuizing met 250 milliliter water om uitdroging te voorkomen.

Na anderhalf uur, verkrijgt u beelden van de stolsels door confocale microscopie zoals net gedemonstreerd. Pipetteer vervolgens 25 microliter plasmine in het open uiteinde van de kamer en laat de plasmine zich door capillaire actie door het stolsel verspreiden. Open ten slotte de tijdreeksfuncties van de confocale microscoopsoftware, klik op acquisitiemodus en selecteer tijdreeks.

Selecteer vervolgens het aantal cycli en het opnametijdsinterval om real-time videobeelden te maken van de plasmine-geïnduceerde stolsellyse-analyse van normale en glycosyleerde stolsels, waaruit blijkt dat glycosyleerde stolsels dichter zijn met kleinere poriën dan normale stolsels, zowel met als zonder toevoeging van factor 13 tijdens stolselpolymerisatie. Inderdaad, in de niet-glycoseerde stolsels, is er een lagere fibrineconcentratie, die een minder dichte structuur creëert dan die welke wordt waargenomen in de glycosyleerde stolsels, die een hogere fibrineconcentratie bevatten. Fibrine stolsels van sikkelcelanemiepatiënten bevatten rode bloedcellen en vertonen dichter structuren dan die van gezonde fibrine stolsels als gevolg van een verhoogde fibrinogeenconcentratie bij deze personen.

Bovendien heeft de natuurlijke neiging van rode bloedcellen van sikkelcelanemiepatiënten om aggregaten en genders, klonten van rode bloedcellen die verweven raken in het fibrinenetwerk, te vormen als resultaat de vorming van abnormale stolselstructuren die opmerkelijk verschillend zijn in morfologie van die welke worden waargenomen bij normale patiënten. Ten slotte toont analyse van de fibrinolysesnelheden van normale versus glycosyleerde stolsels een significant verminderd vermogen van de gesimuleerde diabetische stolsels om fibrine te lysen bij afwezigheid van voldoende plasmine. Dit onderzoek zal helpen om de weg te banen voor onderzoekers op het gebied van trombose en hemostase, vooral voor patiënten die comorbide pathologieën ontwikkelen als gevolg van sikkelcelanemie en diabetes.