Name: Real Time Analyse van Metabool profiel in Ex Vivo Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer real-time metabool profielanalyse van primaire muis crypt organoïden met de XF 24 extracellular flux analyzer. Deze methode meet zuurstofverbruik en extracellulaire acidificatie voor inzicht in stamcelbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 en P3013330 van de National Institutes of Health. Wij willen Michele Houston, Elena Dhima en Dr. Anna Velcich bedanken voor hun waardevolle opmerkingen bij het ontwikkelen van de crypte isolatie protocol. We danken ook de Diabetes Training and Research Center van het Albert Einstein College of Medicine ondersteund door NIH P60DK20541, en Dr Michael Brownlee en Dr. Xue-Liang Du, die sturing en bediening van de Seahorse faciliteit, respectievelijk.

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd goedgekeurd door de Commissie voor de ethiek van dierproeven van het Albert Einstein College of Medicine. 1. Crypt Isolatie en Cultuur <ol><li> Isolatie van crypten uit de dunne darm: <ol><li> Isoleer intestinale crypten van elke muizenmodel met rente. Euthanaseren de muizen met CO2, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Het openstellen van de buik in de lengte en vul de dunne darm (SI) met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing, PBS (-Ca 2+; Mg 2+) met 2x antibiotica-antimycotische (anti-anti). Snel isoleren dunne darm. </li><li> Grondig ontleden vrij van mesenteriale vet met behulp van een scalpel. Wees voorzichtig niet om het weefsel te perforeren - te allen tijde te houden het weefsel vochtig met ijskoude PBS. Openstellen inteStine lengterichting en grondig wassen met ijskoud PBS. </li><li> Snijd dunne darm in twee secties en plat uit met behulp van een nat wattenstaafje voorzichtig afschrapen van de villi met behulp van een vooraf gekoeld slide. Was krachtig in ijskoude PBS meerdere malen. </li><li> Incubeer 3 min in 20 ml 1 x PBS per 3 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) /0.5 mM dithiothreitol (DTT) voor niet-enzymatische dissociatie van het weefsel. </li><li> Snij weefsel in kleine stukjes (2-4 mm) met een scheermesje op een voorgekoelde slide. Breng de stukken in een 50 ml buis met 20 ml ijskoud PBS. </li><li> Pipet op en neer zachtjes 10x met behulp van een 10 ml steriele wegwerp pipet. Laat weefselfragmenten sediment door de zwaartekracht. Verwijder het supernatant met een pipet. Herhaal dit drie extra tijden; zorg ervoor dat bovenstaande is duidelijk. </li><li> Voeg 20 ml PBS per 2 mM EDTA. Swirl en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min met zachte wiegen. </li><li> Laat weefsel sediment en gooi supernatant. Voeg 15 ml ijskoude PBS en pipetop en neer 5x met een pipet 10 ml. Laat de weefselfragmenten sediment en het verzamelen van de supernatant als Fractie 1 (F1). Herhaal verzamelen F2-F5, elke fractie apart gehouden. </li><li> Voeg 15 ml ijskoude PBS en deze keer Schud krachtig met de hand gedurende 15 sec. Verzamel F6 en herhaal voor F7, F8. Als weefsel stukken beginnen te zweven, tikt u op om hen te helpen vestigen. </li><li> Inspecteren een aliquot van elke fractie onder de microscoop. Pool die fracties die crypten. </li><li> Passeer de samengevoegde fracties door middel van een 70 micrometer nylon cel zeef, het verzamelen van crypten in een 50 ml buis. </li><li> Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, gooi supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml ijskoude PBS met 2x anti-anti crypten en overbrengen naar een 15 ml buis. Herhaal het wassen nog een keer. </li><li> Was de crypten een keer met 10 ml ijskoude ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium / Ham&#39; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Was de crypten een keer met 10 ml ADF - 1x anti-anti. </li><li> Tel de crypten met behulp van een hemocytometer. Stel de crypte oplossingsvolume en naar een 1,5 ml buis zodanig dat de uiteindelijke concentratie bij crypte geresuspendeerd zal 100-500 crypten per 50 ui gelatineuze eiwitmengsel (Matrigel). Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer crypten in de gelatineuze eiwitmengsel. </li><li> Plaat 50 ui crypt - gelatineuze eiwitmengsel suspensie per putje in een 24-well plaat (groeigebied: 2 cm 2) voorzichtig plaatsen van de suspensie daling in het midden van elk putje. Handhaving van de plaat in een CO 2, 37 ° C incubator voor ~ 30 min tot de schorsing stolt. </li><li> Voeg 500 ul ijskoud compleet kweekmedium (DMEM Uitgebreid / F12 met 1x anti - anti, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 supplement, 1x N2 supplement, 1 mM N-Acetyl-L-cysteïne (NAC), 50 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 100 ng / mlHersenpan, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Reconstitueren groeifactoren in 0,1% runderserumalbumine (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypte organoïde Cultuur en Passage: <ol><li> Passage crypt organoids 14-21 dagen na zaaien (of naar behoefte) als volgt: <ol><li> Change media elke vrijdag en maandag. Op woensdag, vervang de helft van de media met verse media. </li></ol></li><li> Verwijder het kweekmedium. Tweemaal spoelen van het monster met 500 pi PBS bij 5 min intervallen. </li><li> Verwijder PBS en voorzichtig breken de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een steriele P1000 micro pipet tip. </li><li> Voeg 1 ml compleet voedingsbodems tot één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media. </li><li> Zachtjes verstoren de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x (kijk onder de microscoop voor juiste organoïde dissociatie met een goede opbrengst crypte totdat een consistente techniek ontwikkeld). </li><li> Breng de crypten naar een 1,5 ml microcentrifugebuis;Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min. </li><li> Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium. </li><li> Splitsing in een verhouding van 1: 3 of 1: 6 als nodig resuspenderen crypten in 50 gl per putje Matrigel. Ga te werk zoals hierboven beschreven (paragraaf 1.1.16-18) beschreven. </li></ol></li><li> Crypte organoïde Invriezen: <ol><li> Verwijder het kweekmedium. Was het monster in 500 pi PBS. </li><li> De verspreiding van de geleiachtige eiwit mengsel met behulp van een P1000 pipet tip. </li><li> Voeg 1 ml media om één goed en resuspendeer de organoids in 1 ml media. </li><li> Breek voorzichtig de organoids met een P1000 door en neer te pipetteren 20-30x. </li><li> Breng de organoids naar een 1,5 ml tube. Centrifugeer bij 100 xg bij 4 ° C, 5 min. </li><li> Was de pellet twee keer met 1 ml compleet kweekmedium. </li><li> Hersuspendeer crypten in 500 pi bevriezing media. </li><li> Transfer crypten een cryotube Plaats de buis in een bevriezing container en op een -80 ° C vriezer overnight. </li><li> Transfer crypten om vloeibare N 2 tank. <ol><li> Recover bevroren crypte organoids door snel ontdooien in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 ul compleet kweekmedium eenmaal centrifuge bij 100 xg, 5 min en resuspendeer in gelatineuze eiwitmengsel en cultuur zoals hierboven beschreven. Voor beter herstel, voeg ROCK inhibitor (Y-27632) aan de bevriezing media. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt organoïde Metabolisme Assay <ol><li> 24-well plaat Bereiding: <ol><li> Isoleren en tel crypten volgens het protocol (zie paragraaf 1.1 voor crypte isolatie en paragraaf 1.2 voor crypte passage). </li><li> Hersuspendeer crypten in geleiachtige eiwitmengsel (100-200 crypten per 20 pi). </li><li> Plaat crypt-geleiachtige eiwitmengsel suspensie in een 24-well assay plaat (zorg ervoor dat er ten minste drie exemplaren voor elk monster) en laat de schorsing te stollen bij 37 ° C in een CO 2incubator; voeg dan 500 ul compleet voedingsbodems. </li><li> Cultuur crypten (zoals beschreven in paragraaf 1.1) en de in acht te nemen onder de microscoop tot crypten uitgroeien tot volledig ontwikkelde organoids. </li></ol></li><li> Extracellulaire Flux Assay: <ol><li> Hydraat cartridge overnacht in een niet-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C incubator. </li><li> Verwijder het kweekmedium en was organoids tweemaal met 500 ul DMEM (zonder glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat, en met: fenolrood). Wacht 5 min. </li><li> Voeg 675 ul per putje assaymedium (DMEM met 2 mM L-glutamine en 5 mM D-glucose) aan elk putje. </li><li> Controleer crypte organoids microscopische morfologie om ervoor te zorgen dat organoids en de geleiachtige eiwit mengsel intact zijn na de wasbeurten. Incubeer 1 uur in een niet-CO 2, 37 ° C incubator. </li><li> Bereid 10 uM injecteerbare verbindingen (oligomycin, carbonyl cyanide-p-trifluor-methoxy-fenyl-hydrazon (FCCP), rotenone) in testmedium. </li><li> Set-up van de cartridge door het laden van 75 pi van 10 uM injecteerbare verbindingen in de havens van de cartridge sequentieel: Port A - oligomycin; Port B - FCCP; en Port C - rotenon (De uiteindelijke concentraties tijdens de test zal 1 uM zijn). </li><li> Incubeer cartridge 30 minuten - 1 uur bij 37 ° C in een niet-CO 2 incubator. </li><li> Tegelijkertijd zet de XF Analyzer en maak de assayprotocol template. </li><li> Plaats cartridge en het nut plaat in XF Analyzer en run &quot;kalibreren&quot; cartridge. </li><li> Controleer crypte organoids microscopisch onderzoeken om ervoor te zorgen dat ze gehecht zijn aan de geleiachtige eiwitmengsel. </li><li> Load celkweekplaat naar instrument en run-test protocol. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li>
<li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li>
<li>Medina, M. A., Castro I, N. unezde <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7(2013).</li>
<li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+changes+in+histone+modifications%2C+mRNA+levels%2C+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832%2F13+%CE%B2-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 β-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li>
<li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

Er zijn geen mededelingen.

We testten het zuurstofverbruik rate (OCR) en de extracellulaire aanzuursnelheid (ECAR) van crypten geïsoleerd van 8 maanden oude muizen en uitgegroeid tot organoids ex vivo. Na meting van de basale snelheid, werd crypte metabolisme geëvalueerd door het toevoegen oligomycin, carbonyl cyanide -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en rotenon, sequentieel. Basaal OCR en basale ECAR werden geregistreerd 0-29 min (figuur 2A en 2B). Op de 29ste</...

Colorectale kanker (CRC) is de derde belangrijke oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Sporadische darmkanker - dat wil zeggen, dat later die zich voordoen in het leven (&gt; 50 jaar) en zonder duidelijke predisponerende genetische factoren - is goed voor ~ 80% van alle gevallen, met de incidentie sterk beïnvloed door langdurige voedingspatronen 1,2. Deze tumoren vertonen een metabolische verschuiving naar afhankelijkheid oxidatieve glycolyse, zogenaamde Warburgeffect, die gedeeltelijk kunnen maken hogere concentraties van cellulaire bouwstenen en energie beschikbaar (via glutaminolysis) mogelijk te maken en wellicht hoge percentages tumorcelproliferatie 3-5 drijven . Studies darmkanker en andere gastro-intestinale kanker waaronder dunne darm kanker verschaffen belangrijke inzicht in de oorzaak van tumorvorming. Het onderzoeken van de metabole verschillen tussen normale, pro-tumorigene en tumorigeen staten van gastro-intestinale organen kan det helpenermination relatieve risico op tumorontwikkeling en vroegtijdige detectie van neoplasie. Bovendien is het begrip van bio-energetische stofwisseling waarbij mitochondriale ademhaling en glycolyse zal fundamenteel inzicht in hoe de cel fysiologie, veroudering en de ziekte staat verstoort intestinale homeostase bieden. Benutting van de bio-energetica assay technologie voor extracellulaire flux analyse kunnen de tarieven van de mitochondriale ademhaling en glycolyse gelijktijdig beoordelen in cellen groeien in cultuur in real time 6,7. Tot voor kort, werden in vitro onderzoek van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren 8,9 en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. In 2009, Sato et al. 10 introduceerde een ex vivo cultuur systeem om driedimensionale (3D) muis intestinale epitheliale organoids groeien, of epithEliel &quot;mini-lef&quot;, geschikt voor experimentele, diagnostische en therapeutische onderzoeken 10,11. Bovendien crypten geïsoleerd van calorisch beperkte muizen behouden hun veranderde groei-eigenschappen als organoids in dergelijke culturen 12. Vergeleken met getransformeerde cellijnen kunnen crypte organoïde culturen worden fysiologisch relevante gegevens die een beter model voor de in vivo toestand begrijpen genereren. We aangepast bioenergetica analyse technologie om energie-metabolisme van intestinale crypte organoids assay. Muis intestinale crypte organoids werden gekweekt ex vivo naar de crypte organoïde energiemetabolisme studies gepresenteerd ontwikkelen. De zuurstof verbruik (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) van crypte organoids werden gemeten in de afwezigheid en aanwezigheid van twee verschillende metabolische remmers (oligomycin, rotenon) en een ion drager (carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). De crypte organoid metabole reactie op deze chemische verbindingen werden met succes tot uiting door middel van het wijzigen van ECAR en OCR-waarden. Cellulaire bio-energetische studies zullen de wederzijdse interacties tussen metabole toestand en ziekterisico en fenotype verhelderen bij kanker, obesitas, diabetes, metabole stoornissen en mitochondriale ziekten en helpen vooraf screeningsmethoden met rechtstreekse gevolgen voor translationele geneeskunde. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te dunne darm crypten te isoleren en cultuur crypte organoids. Bovendien introduceren we een nieuwe methode om crypte organoïde culturen gebruiken voor metabole assays.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-vrij, LDEV-vrij</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing), geen magnesium, geen calcium, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;s Modified Eagle&prime;s Medium zonder glucose, L-glutamine, fenol rood, natriumpyruvaat en natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Fenol rood natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Eindconcentratie 15 mg/l in DMEM (D5030) - stap 2.2.2</td></tr><tr><td>Antibioticum-antimycoticum, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Eindconcentratie 1x of 2x</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine, vloeibaar</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Eindconcentratie 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&trade; supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Eindconcentratie 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethansulfonzuur), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Eindconcentratie 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteïne, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Eindconcentratie 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 supplement, vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Eindconcentratie 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; supplement minus Vitamine A, vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Eindconcentratie 1x</td></tr><tr><td>Recombinant Muis R-Spondin 1, CF, 50 &mu;g</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Eindconcentratie 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Muur EGF, 100 &mu;g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Eindconcentratie 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinant Muur Noggin, 20 &mu;g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Eindconcentratie 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-glutamine, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Eindconcentratie 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; glucosepoeder</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Eindconcentratie 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0,5 M EDTA (ethyleen-diaminetetraazijnzuur), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Eindconcentratie 3 mM voor stap 1.1.5; 2 mM voor stap 1.1.8</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Eindconcentratie 3 mM</td></tr><tr><td>Albumine uit bovien serum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0,1% in PBS</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Celcultuur Bevriezingsmedium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-remmer (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Eindconcentratie 10 &mu;M</td></tr><tr><td>Oligomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Eindconcentratie 1 &mu;M</td></tr><tr><td>Carbonylcyanide-p-trifluoro-methoxy-fenyl-hydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Eindconcentratie 1 &mu;M</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Eindconcentratie 1 &mu;M</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Eindconcentratie 0,1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellulaire Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analyse van metabool profiel in ex vivo muis intestinale crypt organoïde cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

De kleine darmslijmvlies vertoont een repeterende architectuur georganiseerd in twee fundamentele structuren: villi, die uitsteekt in het darmlumen en samengesteld uit volwassen enterocyten, bekercellen en entero-endocriene cellen; en crypten, wonende proximaal van de submucosa en de muscularis, herbergen volwassen stamcellen en progenitor cellen en rijpe Paneth cellen en stromale en immuuncellen van de crypte micromilieu. Tot de laatste jaren, in vitro studies van dunne darm beperkt tot cellijnen die afkomstig zijn van zowel goedaardige of kwaadaardige tumoren, en niet de fysiologie van normale darmepitheel en de invloed van de micro-omgeving waarin zij verblijven vertegenwoordigen. Hier tonen we een aangepaste werkwijze van Sato et al. (2009) voor het kweken van primaire muis intestinale crypte organoids afgeleid uit C57BL / 6 muizen. Daarnaast presenteren we het gebruik van de crypte organoïde culturen naar de crypte metabole profiel in real time door de maatregel assayment van basale zuurstofverbruik, glycolytic rate, ATP productie en respiratoire capaciteit. Organoids behouden eigenschappen gedefinieerd door hun bron en de aspecten van hun metabolische aanpassing weerspiegeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven behouden. Real time metabole studies in deze crypte organoïde kweeksysteem zijn een krachtig hulpmiddel om crypte organoïde energiemetabolisme te bestuderen, en hoe het kan worden gemoduleerd door voedings- en farmacologische factoren.

Crypte organoids werden vastgesteld op basis van 8 maanden oude C57BL / 6 muizen gevoed gezuiverd knaagdierendieet American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale crypte organoids kunnen worden gekweekt in cultuur voor langere tijd van een enkele crypte (Figuur 1A, enkele rode pijl). Organoids groeien uit crypte-achtige structuren in 18-20 dagen in kweek (Figuur 1B, rode pijlen). Crypten werden gepasseerd om de 3 weken en organoids efficiënt hersteld na elke passage. <p cl...

Dunne darm crypte organoids gekweekt ex vivo een weefselkweek systeem dat de groei van de crypten afhankelijk van stamcellen en hun niche recapituleert. We hebben een methode om het metabole profiel in real time in primaire muis crypte organoids assay. We vonden organoids behouden fysiologische eigenschappen gedefinieerd door hun bron.

Real Time Analyse van Metabool profiel in Ex Vivo Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Het doel van deze procedure is om het metabolische profiel van primaire muis crypt organoïden in realtime te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de dunne darm van de muis te verzamelen, gevolgd door het isoleren van de intestinale crypten en het plaatsen in matrigel. De tweede stap is om de crypten te kweken tot ze volledig ontwikkelde crypt organoïden vormen.De volgende stap is de voorbereiding van een cartridge assay voor metabolische studies. De laatste stap is om de cartridge en utiliteitsplaat in de XF 24 extracellulaire flux analyzator te laden en extracellulaire flux analyse uit te voeren om de zuurstofconsumptierate en extracellulaire acidificatierate van K crypt organoïden te meten. Uiteindelijk stelt deze procedure het mogelijk om het metabolische profiel van primaire muis intestinale crypt organoïden in realtime te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het gebruik van celcultuur voor metabolische essays is dat het ons in staat stelt om de metabolisme van intestinale crypten in realtime te beoordelen. Organoïde culturen benaderen de immuunstatus nauwkeuriger, en dit helpt om fysiologisch relevantere gegevens te genereren. De techniek kan ook worden uitgebreid tot het analyseren van andere XI 3D organoïde culturen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het kankerveld, zoals het karakteriseren van metabolische veranderingen in de dunne darm Crips tijdens tumorgenese, en in diabetes en metabolisme onderzoek zoals het vergelijken van metabolisme van normale en ziektestaten. Om deze procedure te beginnen, open je de buik van een geëuthanasieerde muis longitudinaal. Vul de dunne darm met ijskoud calcium- en magnesiumvrij PBS en twee keer antibioticum antimycoticum.Vervolgens isoleer je snel de dunne darm. Verwijder het mesenteriale vet met een scalpel. Wees voorzichtig om het weefsel niet te perforeren en houd het weefsel vochtig met ijskoud PBS gedurende de hele procedure.Open de darm en was hem grondig met ijskoud PBS. Snijd daarna de dunne darm in twee secties. Plaats ze plat met behulp van een natte wattenstaafje.Vervolgens schraap je voorzichtig de VII af met behulp van een preco slide. Was de weefsels krachtig in ijskoud PBS meerdere keren. Bewaar ze vervolgens in 20 milliliters van een XPBS met drie millimolar EDTA en 0,5 millimolar DTT gedurende drie minuten.Snij vervolgens de weefsels in stukken van twee tot vier millimeter op een preco slide. Gebruik een scheermes om de stukken over te brengen in een 50 milliliter buis met 20 milliliter ijskoud PBS. Pipetteer vervolgens voorzichtig 10 keer op en neer met behulp van een 10 milliliter steriele wegwerppipet.Nadat de weefselfragmenten door zwaartekracht zijn gezakt, verwijder je het SUP natum met een pipet. Herhaal de procedure nog drie keer en zorg ervoor dat de supernatant helder is. Breng nu de weefselstukken over in een 50 milliliter buis met 20 milliliter PBS met twee milli molar EDTA SW en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zacht schudden.Laat het weefsel vervolgens zakken en gooi het supernatant weg. Voeg 15 milliliters ijskoud PBS toe en pipet op en neer vijf keer. Laat de weefselfragmenten zakken en verzamel het supernatant als fractie één.Herhaal de procedure om fractie twee tot fractie vijf te verzamelen en houd de fracties gescheiden. Voeg vervolgens 15 milliliters ijskoud PBS toe en schud krachtig gedurende 15 seconden. Verzamel fractie zes en herhaal de procedure voor fractie zeven en fractie acht.Als de weefselstukken beginnen te zweven, tik op de buis om ze te laten zakken. Inspecteer vervolgens een aliquot van elke fractie voor Crips onder de microscoop. Dit is een voorbeeld van een slechte fractie, en dit is een voorbeeld van een goede fractie.Verzamel de stukken die Crips bevatten. Laat vervolgens de verzamelde fracties door een 70 micron nylon cell strainer lopen en verzamel de Crips in een 50 milliliter buis. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 100 keer G en vier graden Celsius, gooi het supernatant weg en suspendeer de PT in 10 milliliter ijskoud PBS met twee keer antibioticum antimycoticum.Breng vervolgens de Crips over naar een 15 milliliter buis en herhaal de wassing nog een keer. Was vervolgens de crypten eenmaal met 10 milliliters ijskoud, A DF advanced D-M-E-M-F 12 bevattend twee keer antibioticum antimycoticum. Was vervolgens de crypten eenmaal met 10 milliliters van een DF bevattend een keer antibioticum antimycoticum.Tel vervolgens de crypten met behulp van een hemo cytometer. Pas het cryptoplossingsvolume aan en breng het over naar een 1,5 milliliter buis zodat de uiteindelijke cryptconcentratie bij suspensie 100 tot 200 crypten per 20 microliters gelatineachtige eiwitmengsel is. Centrifugeer vervolgens de cryptoplossing gedurende vijf minuten bij 100 keer G en vier graden Celsius.Verwijder de Senna en suspendeer de crypten in de gelatineachtige eiwitmengsel. Plateer vervolgens 20 microliters van de crypt gelatineachtige eiwitmengsel suspensie per putje in een 24-wel utiliteitsplaat. Bewaar de plaat in een CO2 incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten totdat de suspensie is gestold.Voeg vervolgens 500 microliters ijskoud, compleet kweekmedium toe aan elke put en kweek de Crips tot ze volledig ontwikkelde organoïden zijn geworden. In deze procedure wordt de cartridge gedurende de nacht gehydrateerd in een niet-koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens het kweekmedium en was de organoïden twee keer met 500 microliters DMEM. Voeg na vijf minuten 675 microliters assaymedium toe aan elke put.Controleer vervolgens de microscopische morfologie van de crypt organoïden door ze een uur in een niet-koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius te incuberen. Bereid vervolgens 10 micromolar injecteerbare verbindingen in het assaymedium voor. Bereid de cartridge voor door 75 microliters van de 10 micromolar injecteerbare verbindingen achtereenvolgens in de poorten van de cartridge te laden.Bewaar vervol

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we demonstrate a technique to isolate whole crypts from a mouse’s small intestine. The isolated whole crypts can be used to propagate long-lived and self-renewing 3D organoids in vitro.

Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine Model

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.

Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen

We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Leer real-time metabool profielanalyse van primaire muis crypt organoïden met de XF 24 extracellular flux analyzer. Deze methode meet zuurstofverbruik en extracellulaire acidificatie voor inzicht in stamcelbiologie.

Real Time Analyse van Metabool profiel in Ex Vivo Muis Intestinale Crypt organoïde Cultures

Meer video's verkennen