Name: Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van Cargo Mapping Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer hoe je moleculaire motor-eiwitten op axonale cargo karakteriseert met behulp van cargo mapping-analyse in primaire muizenhippocampusneuronen. Deze methode correleert motorcompositie met transportrichting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman en Daniel Whisler voor hun hulp bij de aanpassing en ontwikkeling van de software voor kwantitatieve cargo-mappinganalyses, en Emily Niederst voor haar hulp bij het maken van de microfluïdische apparaten. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-NIA-subsidie AG032180 aan L.S.B.G., en het Howard Hughes Medical Institute. L.S. werd gedeeltelijk ondersteund door een NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. werd ondersteund door een Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, en door een subsidie van The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C werd ondersteund door een NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 en door de Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgende goedgekeurde protocollen en volgens de institutionele richtlijnen voor de humane zorg van proefdieren. Pasgeborene muizen werden gedood door onthoofding. 1. Voorbereiding van Microfluïdische Inrichtingen voor Cell Culture <ol><li> Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdische inrichtingen voor het kweken van hippocampale neuronen zoals beschreven door Harris en collega&#39;s 17-19. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de lading mapping protocol. OPMERKING: microfluïdische inrichtingen zijn ook commercieel verkrijgbaar (Materials List), waardoor toegang tot een fabricage faciliteit niet noodzakelijk. </li><li> Bereid No. 1½ dekglaasjes (24 x 40 mm) door wassen driemaal met aceton, gevolgd door driemaal wassen met 100% ethanol en drie wassingen van water. WINKEL dekglaasjes in water bij 4 ° C tot gebruik. Deze behandelingen helpen ervoor te zorgen dat coverslips schoon zijn van puin die kunnen interfereren met plating van CELls, vervuiling, en overleving. LET OP: aceton en ethanol zijn brandbaar en gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), van contact met de ogen (irriterend), van inslikken, van inademing. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen. </li><li> Als u klaar bent om te gebruiken, plaatst u een dekking van glas in een 60 mm celkweekschaaltje per microfluïdische apparaat, en laat het aan de lucht drogen zonder deksel gedurende 45 min in een bioveiligheid kast om besmetting te voorkomen. </li><li> Na apparaten zijn geknipt uit de meesters en stoten zijn gesneden om de reservoirs te creëren (Figuur 1A, B), leg ze met de microfluïdische kanalen side-up in een bioveiligheid kast voorzien van een UV-lamp voor 45 min voor sterilisatie. OPMERKING: Leaving apparaten onder UV behandeling langer dan 2 uur kan de integriteit van de PDMS beïnvloeden. </li><li> Monteer de apparaten door het plaatsen van één apparaat op elke dekking van glas in de 60 mm plastic celkweekschaaltje zodat de microfluïdische kanalen naar beneden. Druk zachtjes op de top of het apparaat (raak het microkanalen) een niet-permanente verbinding van de inrichting aan het dekglas. Bedek elk 60 mm celkweek schaal met deksel. </li><li> Met een micropipet, hydrateren de inrichtingen door toevoeging celkweekniveau water boven twee microfluïdische reservoirs (1 en 2 in figuur 1A), waardoor water doorstromen. Verwijder water met een micropipet en voeg 1 mg / ml poly-L-lysine in microfluïdische reservoir 1 (200 ui) en 2 (100 pl). Het volume verschil zal voor de poly-L-lysine te stromen door de microkanalen (Figuur 1A, B). </li><li> Om de apparaten in de 60 mm celcultuurschalen niet omvallen in een 37 ° C incubator, nog drie 60 mm celkweek schalen met de hulpmiddelen in een 150 mm kunststof celkweekschaal en bedek de schaal met een deksel. Incubeer O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Meestal meer dan 90% van de kanalen bruikbaar per apparaat en doeneventuele luchtbellen of fysieke blokkade niet bevatten. </li><li> Op de volgende dag vervangen poly-L-lysine met water en laat inrichting incubator gedurende ten minste 1 uur. Herhaal dit drie keer wassen. Verwijder water en voeg Neurobasal-A groeimedium (die 2% B-27 supplement en 500 uM GlutaMAX) aan elk apparaat. Laat O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO2. </li><li> Op de volgende dag, plaat hippocampale cellen zoals hierna beschreven. </li></ol> 2. Plating van Mouse hippocampus primaire neuronen in Microfluïdische Devices OPMERKING: De voorbereiding van gekweekte hippocampale neuronen van pasgeborene ratten is eerder gepubliceerd in Jupiter 25. Hieronder zijn enkele wijzigingen die werden aangepast aan de plaat muis hippocampale neuronen in microfluïdische apparaten, en die optimaal zijn voor transfecties waren. <ol><li> Voor muizenhersenen dissectie, voorverwarmen Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum(FBS; zonder antibiotica), Mengsel A (125 mg DL-cysteïne, 125 mg runderserumalbumine (BSA) en 3.125 g D-glucose in 500 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), filter gesteriliseerd door een 0,22 um filter) en deoxyribonuclease I oplossing (DNase I: 50 mg DNase I en 0,5 ml van een 1,2 M MgSO4 oplossing in 100 ml Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) filter gesteriliseerd door een 0,22 urn filter) in een 37 ° C waterbad. <ol><li> Voorverwarmen Neurobasal-A groeimedium in een 37 ° C incubator met 5% CO2 om de pH in evenwicht. </li></ol></li><li> Ontleden hippocampus 1-3 dagen oude pasgeboren muizen volgens vastgestelde protocollen 26. Houd hippocampus in een 15 ml conische buis met 10 ml dissectie buffer (HBSS bevattende 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM glucose, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine), op ijs. Zet maximaal 4 zeepaardjes per 15 ml conische buis. </li><li> Voer de resterende protocol is onder steriele toestands in een bioveiligheid kast. </li><li> Verdun 45 eenheden van papaïne in 5 ml van mengsel A, vortex en incubeer gedurende 5 min bij 37 ° C totdat papaïne poeder wordt opgelost. Voeg 1 ml DNase I oplossing. Filter de mix door een 0,22 pm spuitfilter unit. </li><li> Zorgvuldig aspireren HBSS &#39;van 15 ml conische buis met hippocampus. Voeg 10 ml koude (4 ° C) HBSS tot hippocampus en laten bezinken naar de bodem van de buis. Aspireren HBSS voorzichtig van 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 1 ml papaïne / DNase I mix tot 4 hippocampus en incubeer gedurende 20-30 min bij 37 ° C. Kantel conische buis om de 5 min naar hippocampus baden met mix. Als alternatief plaatst hippocampus in een 37 ° C waterbad shaker met zachtjes schudden (~ 100 rpm). </li><li> Zuig papaïne / DNase I mengen en wassen hippocampus tweemaal met voorverwarmd DMEM (37 ° C) bevattende 10% FBS. </li><li> Na de tweede wasbeurt, voeg 2 ml voorverwarmde DMEM met 10% FBS aan hippocampus en handmatig vermaal hippocampus door pipetterenop en neer ~ 10-12 keer met behulp van een 1 ml pipet tip om neuronen te distantiëren. </li><li> Laat trituraat regelen voor ~ 1 min, omdat dit zal toelaten niet-gesplitste neuronen te vestigen op de bodem van de conische buis. Breng supernatant dat gedissocieerd neuronen in nieuw 15 ml conische buis vermeden Transmissie van grote weefsel dat zich op de bodem van de buis. </li><li> Spin cellen bij 1000 xg gedurende 2 min en supernatant voorzichtig verwijderen zonder de cel pellet. Resuspendeer cellen in 80 ul Neurobasal-A groeimedium door pipetteren voorzichtig. </li><li> Verwijder medium uit microfluidic reservoir 1 en 1 &#39;. Solliciteer 20 ul van cellen (~ 275.000) naar microfluïdisch reservoir 1, en hen in staat stellen om door stromen. Plaats inrichting 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 20 minuten. </li><li> Kijk onder de microscoop om ervoor te zorgen dat cellen hebben gehandeld op grond van de dekking van glas. Voeg Neurobasal-A groeimedium naar boven uit alle reservoirs. Terug inrichting met cellen tot een 37 ° C incubator met 5% CO <sub&gt; 2. </li><li> Controleer apparaten elke verdamping ~ 2-3 dagen en top off reservoirs met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement (zonder GlutaMAX) te vermijden. Neuronen beginnen hun axons uitstrekken door microkanalen ~ 2-3 dagen na uitplaten. Onderwerp neuronen meestal 7-10 dagen na transfectie plating. </li></ol> 3. Transfectie van hippocampale neuronen Grown in Microfluïdische Device <ol><li> Per apparaat, bereid een mengsel van 1,2 ul Lipofectamine 2000 in 30 ui Neurobasal-A en een mengsel van 0,5 ug fluorescerende lading fusieplasmide in 30 ui Neurobasal-A en incubeer 5 min bij RT. Voeg Lipofectamine mengsel DNA mix en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 60 ul van Neurobasal-A met 4% B-27 supplement aan het DNA / Lipofectamine mix en meng door flicking de buis. </li><li> Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 2 en 2 &#39;en zorgvuldig opvullen putten met Neurobasal-A met 2% B-27 supplement zonder te morsen op de middellange into de andere compartimenten. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit microfluidische reservoir 1 en 1 &#39;. Voeg 120 ul van DNA / Lipofectamine mix aan microfluïdische reservoir 1 en laat het stromen. Terug apparaat 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 3-4 uur. </li><li> Verwijder alle media uit microfluidische reservoir 1 en 1 &#39;en te vervangen door Neurobasal-A met 2% B-27 supplement voor 24 uur (of tot het moment van afbeelding). Typisch, 5-7 axonen die groeien door microkanalen worden getransfecteerd in die omstandigheden, die ongeveer 1-3% transfectie-efficiëntie in overeenstemming met efficiëntie gepubliceerd voor de hippocampus gekweekte cellen 26 vertegenwoordigen. </li></ol> 4. &quot;Cargo Mapping&quot; Analyses <ol><li> Live-Imaging van vracht-verkeer <ol><li> Voer de beeldvorming over een omgekeerde epifluorescente lichtmicroscoop uitgerust met een 37 ° C incubator en een CO 2 regelkamer. </li><li> Monteer het dekglaasje met hippocampale neuronen gekweekt in een microfluidic apparaat op de microscoop podium. Tot neuronale dood te voorkomen, werken vlot naar de monsters bij de microscoop gedurende niet langer dan 1 uur. </li><li> Met een doelstelling hoge resolutie (100X), vind axonen van getransfecteerde cellen die zich door kanalen microfluidic kamers en noteer het aantal kanalen waarin de getransfecteerde axon gevonden. Tel het aantal kanalen met behulp van een hand tally teller. <ol><li> Voor optimale opnamen van live-beweging en de daaropvolgende colocalization analyse, kiest axonen die relatief vlak te groeien door de kanalen zodat de beeldvorming van de meeste blaasjes in focus kan worden uitgevoerd. </li></ol></li><li> Verwijder het grootste deel van het medium uit reservoirs 2 en 2 &#39;met een 1 ml plastic transferpipet. Latere aanpassing van vaste beelden met beweging trajecten op kymographs vergemakkelijken lijn de rechterrand van de microkanalen met het gezichtsveld tijdens beeldvorming (Figuur 1B, C). </li><li> Om fixin vergemakkelijkeng van de monsters tijdens de beeldvorming, live beeldvorming met twee mensen. Als alternatief, als levende beeldvorming wordt uitgevoerd door één persoon, gebruikt een microscoop systeem voorzien drift correctie. </li><li> Start imaging live-beweging vracht met time-lapse specificaties die specifiek zijn voor de dynamiek vervoer van de vracht die wordt geanalyseerd (microscoop specificaties en instellingen voor beeldvorming YFP- PrP C zijn gespecificeerd in de legenda van figuur 2 en Materials List). </li><li> Na voldoende levende beweging zijn verzameld, één persoon vullen reservoirs 2 en 2 &#39;met voorverwarmd 4% paraformaldehyde in PBS dat 0,04 g / ml sucrose aan de cellen vast. Vermijd het aanraken van de microfluïdische apparaat, aangezien dit de focus van de live beeldvorming zal verstoren. Hebben de andere persoon pas de scherpstelling, terwijl het fixatief wordt toegevoegd. Fixatie is succesvol wanneer onmiddellijke stop van de beweging wordt waargenomen. Fixatief Naar 1 en 1 &#39;daarna reservoir. OPMERKING: Tijdelijke photobleaching van de lading fluorescentie kunnen ook worden waargenomen, maar de fluorescentie aanhoudt nadat IF kleuring voor motor-eiwitten is afgerond (volgende stap). OPMERKING: Paraformaldehyde is schadelijk bij inademing, bij aanraking met de huid en opname door de mond. Irriterend voor de ogen, de ademhalingswegen en de huid. Afvalverwijdering volgens overheidsbepalingen. </li></ol></li><li> IF kleuring van motorische eiwitten voor colocalization analyse OPMERKING: kwantificering van relatieve niveaus van motorische eiwitten (zoals bepaald door antilichaam kleuring), met betrekking tot individuele bewegende ladingen, valideren en titreer antilichamen zodat het antilichaam-antigeen-bindende verzadigd. Dit wordt gedaan door het bepalen van de specificiteit van het antilichaam met neuronen waarin het eiwit van belang is of knock-out of aangereden, en door het uitvoeren IF analyse met toenemende concentraties antilichaam. Voor negatieve controles, worden neuronen gekleurd met secundaire antilichamen in de afwezigheid van primaire antilichamen. Meer gedetailleerdeBeschrijving van antilichaam validatie vindt in Encalada et al. 16 en Szpankowski et al. 20. <ol><li> Verwijder het dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat uit de microscoop podium. Gebruik het microfluïdische apparaat niet los van het dekglaasje, zoals de microkanalen nodig om de fase en vaste beelden af ​​intact blijven. Voer de volgende stappen in een vochtige kamer. </li><li> Om de stroom van oplossingen in de microkanalen garanderen handhaven buffervolume verschil tussen reservoirs 1, 1 &#39;en 2, 2&#39; ten minste 30 ui. in alle daaropvolgende stappen. Bijvoorbeeld, voeg 100 ul medium volume microfluïdische reservoir 2, 2 &#39;, en 70 pl media volume microfluïdische reservoir 1, 1&#39;. </li><li> Verwijderen fixatief van de kamers van het microfluïdische apparaat en wassen cellen driemaal met PBS 10 min wachten tussen wasbeurten. </li><li> Permeabilize cellen door 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS gedurende 5 min alle reservoirs. </li><li> Verwijder oplossing uit alle reservoirs en wassen met PBS. Herhaal dit drie keer wassen wachten 10 min tussen de wasbeurten. </li><li> Verwijder oplossing uit alle reservoirs en toepassing blokkerende buffer bevattende 10% Normaal Ezel Serum en 3% protease vrij en immunoglobuline G (IgG) vrij BSA in PBS en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spin primair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang de blokkerende buffer van microfluïdische apparaat met antilichaam oplossing. Incubeer monsters gedurende 2 uur bij KT of O / N bij 4 ° C. </li><li> Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten. </li><li> Spin secundair antilichaam stockoplossing bij 20.000 xg gedurende 5 minuten om neerslagen te verwijderen. Verdun antilichaam aan een geschikte concentratie in blokkerende buffer. Vervang PBS met secundair antilichaam oplossing. Broedenmonsters gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Verwijder oplossing uit alle reservoirs en was driemaal met PBS, 10 min wachten tussen wasbeurten. </li><li> Vervang PBS met ~ 10-20 ul fixeermiddel door direct pipetteren fixeermiddel in de opening van de kanalen verbinden de reservoirs. Laat de montage media drogen ~ 20 min - 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Opslag apparaten op 4 ° C beschermd tegen licht te vermijden fotobleken en beeld axonen binnen twee dagen (maximaal één week) van kleuring. </li><li> Na het kleuren is voltooid, monteren dekglaasje met hippocampusneuronen geteeld in microfluïdische apparaat op de microscoop podium. Zoek het gebied van de getransfecteerde axon afgebeeld in stap 4.1.1-4.1.7. </li><li> Verwerven Z-stack afbeeldingen (300 nm treden) voor elk van de drie kanalen: lading, motor 1, motor 2, met een objectief met hoge resolutie (bijvoorbeeld een hoge numerieke apertuur olie of water objectief). OPMERKING: Verwerving van Z-stacks is belangrijk als axonen vaak niet perfect vlak groeienin microkanalen en dus niet alle fluorescerende puncta in hetzelfde focal plane. </li></ol></li><li> Cargo Mapping <ol><li> Genereer een kymograaf van vracht-verkeer met behulp van software voor beeldanalyse. De ImageJ plugin ontwikkeld door Rietdorf en Seitz (EMBL) wordt aanbevolen voor het genereren kymographs (te downloaden zie Materials List). OPMERKING: ImageJ is een publiek domein, Java-gebaseerde beeldverwerking programma ontwikkeld aan de National Institutes of Health 27,28 (te downloaden zie Materials List). </li><li> Lijn de stilstaande beelden van de fluorescerende lading (opgewekt in stap 4.2.14) handmatig door superpositie ze op de positie van de banen in de kymograaf op het fixatiepunt (figuur 2A, B), met een algemeen verkrijgbare grafische software (Materials lijst). Handmatig uitlijnen door eerste afbeelding van de vaste lading superpositie op de kymograaf en handmatig kiezen van de lading puncta die overeenkomt met een specifiek traject opde kymograaf. Voor de beste uitlijning resultaten gebruikt de Z slice dat is in het beste focus voor de lading in kaart gebracht. Verscheidene Z segmenten worden gebruikt. </li><li> Voor elk beeld in de Z-stack (cargo, motor 1 en motor 2, gegenereerd in stap 4.2.14) bepalen de XY-coördinaten en intensiteit amplitudes voor elke fluorescerende puncta via een vastgestelde algoritme voor 2D Gaussische passen bij de puntspreidingsfunctie dat vertegenwoordigt elke puntbron in elk van de drie kanalen 16,20,21 (figuur 2D). OPMERKING: Om de XY coördinaten, een op maat gebouwde MATLAB software pakket genaamd &quot;Motor colokalisatie&quot; werd ontwikkeld 16,20, wat een Gauss fitting algoritme ontwikkeld door Jaqaman, Danuser en collega&#39;s 21-23 bevat verkrijgen. Het softwarepakket en gedetailleerde instructies voor het gebruik ervan kan worden verkregen op aanvraag. </li><li> Voor elk van de individuele lading puncta die werden in kaart gebracht op de mobiele of vaste trajecten op de kymograaf, selecteert tHij XY coördinaten en intensiteit amplitudes van de resultaten van het programma &quot;Motor colocalization&quot; (deze ladingen individueel geëtiketteerd in figuur 2B). Gebruik meerdere Z-stack beelden verkregen in stap 4.2.14) om meer ladingen die zijn gevonden op verschillende brandpunten vliegtuigen in kaart. </li><li> Vergelijk de individuele XY coördinaten voor de toegewezen lading die verkregen voor elk van de motor kanalen in de overeenkomstige Z-segment (Figuur 2D). Bepaal en selecteer de XY motor coördinaten die binnen een straal van 300 nm van de lading. Voor ladingen en motoren dat signaal binnen dezelfde focal plane hebben, gebruik dan de &quot;Motor colokalisatie&quot; softwarepakket om de puncta die zich bevinden binnen een straal van 300 nm te bepalen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+superfamily+proteins+and+the+mechanism+of+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport.</a> Science. 279, 519-526 (1998).</li>
<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+in+neurons%3A+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function%2C+development%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li>
<li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport along microtubules.</a> Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).</li>
<li>Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+transport+of+organelles%3A+unity+and+struggle+of+opposing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors.</a> Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).</li>
<li>Gross, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hither+and+yon%3A+a+review+of+bi-directional+microtubule-based+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport.</a> Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).</li>
<li>Gross, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+regulation+of+molecular+motors+in+Xenopus+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores.</a> J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).</li>
<li>Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+opposite-polarity+microtubule+motors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination of opposite-polarity microtubule motors.</a> J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+and+dynein+move+a+peroxisome+in+vivo%3A+a+tug-of-war+or+coordinated+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement.</a> Science. 308, 1469-1472 (2005).</li>
<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tug-of-war+between+dissimilar+teams+of+microtubule+motors+regulates+transport+and+fission+of+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).</li>
<li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+control%3A+regulation+of+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).</li>
<li>Hendricks, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Coordination+via+a+Tug-of-War+Mechanism+Drives+Bidirectional+Vesicle+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport.</a> Current Biol. 20, 697-702 (2010).</li>
<li>Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -h, Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+kinesin+and+dynein+assemblies+drive+the+axonal+transport+of+mammalian+prion+protein+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles.</a> Cell. 144, 551-565 (2011).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-plasma+Bonding+of+PDMS+for+Inexpensive+Fabrication+of+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+Microfluidic+Device+for+the+Compartmentalization+of+Neuron+Soma+and+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons.</a> J Vis. Exp. 7 (261), (2007).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpixel+colocalization+reveals+amyloid+precursor+protein-dependent+kinesin-1+and+dynein+association+with+axonal+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+localization+II%3A+Improvement+in+super-resolution+by+relative+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking.</a> J. Microsc. 211, 230-248 (2003).</li>
<li>Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+fluorescent+tag+detection+in+3D+with+super-resolution%3A+application+to+the+analysis+of+chromosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement.</a> J. Microsc. 208, 49-64 (2002).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> Biotechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Moore, D. S., McCabe, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+DS+%22Introduction+to+the+Practice+of+Statistics%22">Introduction to the Practice of Statistics</a>. , 5th edition, W.H. Freeman. New York, NY. (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde protocol kan de correlatie van gerichtheid verkeer van individuele fluorescerende microtubule gebaseerde bewegende lading deeltjes met het type en de relatieve hoeveelheid geassocieerde motor eiwitten in levende neuronen. Eerder, de totale motor samenstelling van axonale vesiculaire lading werd getest op heterogene populaties van biochemisch gezuiverd blaasjes en organellen 9,15. Echter kenmerkend motor samenstelling voor één soort lading in cellen uitdagend v...

Intracellulair transport is essentieel in alle celtypes voor de afgifte van eiwitten, membranen, organellen, en signaalmoleculen verschillende cellulaire domeinen 1. Neuronen zijn zeer gespecialiseerd cellen met lange, gepolariseerde projecties die belangrijke mate afhangen van intracellulaire transport van essentiële goederen voor hun lange afstand levering aan diverse axonale microdomeinen. Dit transport wordt gemedieerd door kinesins en dyneins - twee grote families van de moleculaire motor eiwitten - die binden aan ladingen en spoor langs gepolariseerd microtubuli in anterograde en retrograde richtingen, respectievelijk. Terwijl retrograde beweging wordt voornamelijk gemedieerd door dynein, wordt beweging in de anterograde richting vergemakkelijkt door een groot, functioneel diverse familie van kinesine motors. Bijgevolg kunnen anterograde transport van axonale ladingen worden gemedieerd door verschillende familieleden van de kinesine superfamilie 1-5. Hoewel sommige ladingen bewegen voortdurend in beide richtingen, most ladingen bewegen bidirectioneel en reverse vaak op hun weg naar hun eindbestemming 1,5-13. Verder is aangetoond dat de motoren van de tegengestelde gerichtheid associate gelijktijdig tot lading, het verhogen van de vraag hoe gereglementeerde beweging van ladingen wordt gecoördineerd door tegenovergestelde polariteit motoren 5-7. Samen axonale transport van lading is een gecoördineerde proces dat wordt gereguleerd door de samenstelling van motoren en hun specifieke biochemische activiteiten, die op hun beurt afhankelijk van diverse adapters en regelgevende bindingspartners 14. Trouw beschrijven mechanisme van axonaal transport voor een bepaalde lading en de onderliggende regulering van dat transport ontdekken, is het noodzakelijk dat de samenstelling van motorische eiwitten en hun regulatorische bindingspartners geassocieerd met individuele goederen tijdens het vervoer van levende bepalen. Andere methoden, zoals biochemische benaderingen schattingen over gemiddelde motof samenstellingen op gezuiverd heterogene blaasje populatie, maar deze schattingen niet het type of de bedragen van de motoren gekoppeld aan enkele bewegende blaasjes onthullen. Ook reconstitutie van vesicle transport langs voorgemonteerde microtubules in vitro geactiveerd meten van de hoeveelheid van een type motor op een vesicle level 15. Echter, deze experimenten niet direct correleren het aantal motoren van de transporteigenschappen van deze vesicles en transport gemeten in afwezigheid van cellulaire regulerende factoren. Een protocol wordt hier gepresenteerd, waarvan de motor samenstelling (type en de relatieve hoeveelheid van de motoren) van de afzonderlijke bewegende blaasjes uit immunofluorescentie (IF): gegevens die endogeen tot expressie motor eiwitten bepaalt, en correleert deze parameters om het vervoer van levende exact dezelfde blaasjes in neuronen 16. Deze methode is gebaseerd op een nauwkeurige kartering van IF-to-live-beweging vracht gegevens. Dit wordt bereikt door growing hippocampus muis neuronen in microfluïdische systemen, volgens vastgestelde protocollen 17-19. Deze apparaten zorgen voor de identificatie en correlatie (&quot;mapping&quot;) van axonen en enkele bewegende lading in vaste en live lichtmicroscopie modaliteiten (Figuur 1). Gekweekte neuronen worden getransfecteerd met fluorescent gelabelde lading eiwitten waarvan het transport wordt afgebeeld op een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te gedetailleerde informatie beweging die is uitgezet in kymographs verkrijgen. Tijdens beeldvorming wordt neuronen gefixeerd met paraformaldehyde, en vervolgens gekleurd met antilichamen tegen endogene eiwitten motor. Vaste lading en motorische beelden worden gelegd op live-beweging kymographs naar &quot;kaart&quot; (colocaliseren) hen naar de live-beweging vracht trajecten 16. Om de live-beweging van ladingen met de vereniging van motorische eiwitten correleren, is colocalization geanalyseerd met behulp van een op maat gemaakte MATLAB software pakket genaamd &quot;Motor colokalisatie &quot;16,20. Fluorescent gelabelde ladingen en motoren genereren buigingsbegrensd punctate functies die gedeeltelijk kunnen overlappen. Om de positie van overlappende puncta lossen, eerst de software past automatisch Gaussische functies aan elke puntspreidingsfunctie, wat neerkomt op individuele fluorescerende puncta, om hun precieze XY sub-pixel-positie te bepalen coördineert en intensiteit amplitudes 21-23. De posities van motoren en ladingen zijn vervolgens vergeleken met elkaar colocalization 16,20 bepalen. Daarom is deze werkwijze nader kent colocalization tussen fluorescente puncta vergelijking met andere methoden 24. De kracht van deze methode is het vermogen om de colocalization motoren met individuele lading beoordelen gefixeerde cellen, waarvoor levende beweging trajecten (bijvoorbeeld de richting waarin zij bewegen bij de fixatie) zijn rec geweestorded. Met deze methode werden kinesins en dyneins vond gelijktijdig koppelen aan blaasjes die het normale prioneiwit dragen (PrP C -cellular), een neuronaal verrijkt lading die in twee richtingen beweegt of stilstaat in axonen 16. Deze analyse liet de formulering van een werkmodel voor de regulering van PrP C blaasje beweging waarin anterograde (kinesine) en retrograde (dynein) motoren hun activiteiten coördineren om de blaasjes te verplaatsen in beide richtingen of stationair te blijven, terwijl in verband met de lading . Een ander sterk punt van deze methode is het potentieel brede toepasbaarheid voor het karakteriseren van colocalization / vereniging van vele fluorescent gelabelde ladingen die in bewegen vrijwel elk type cel, met een andere proteïne (s) van belang. Zo zou levende / vaste correlatie mogelijk maakt detectie van voorbijgaande proteïne-lading interacties kan zoveel afzonderlijke fluorescent gelabelde bewegende deeltjes worden geanalyseerd over een gewenst period van tijd. Gezien de brede toepasbaarheid en de aard van de vragen die deze methode kan pakken, zal dit protocol van belang zijn voor een breed publiek van cel biologen waaronder die studeert handel en transport in neuronen of in andere celtypen.

<table><tbody><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Free Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution)</td><td>Life Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&rsquo;s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Water for Cell Culture&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-cysteine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (bovine serum albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I grade II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;11668027</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution 16% EM Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>Let op: Schadelijk bij inademing, bij contact met de huid en indien ingeslikt. Irriterend voor ogen, ademhalingswegen en huid. Weggooien volgens de officiële voorschriften.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>BSA fatty acid and IgG free</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Axis microfluidic device, 450 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ camera&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>150 mm cell culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies Used:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kinesin light chain, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>sc-13362</td><td>specificiteit geverifieerd met behulp van KLC1-/- neuronen (Ref. 16), aanbevolen verdunning 1:100.</td></tr><tr><td>Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>sc-9115</td><td>specificiteit geverifieerd met behulp van shRNA tegen DYN1HC1 (Ref. 16), aanbevolen verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp;aanbevolen verdunning 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp;aanbevolen verdunning 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp;aanbevolen verdunning 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp;aanbevolen verdunning 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Plugins en Macro's</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp;http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp;</a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

karakteriseren van de samenstelling van moleculaire motoren op moving axonale cargo met behulp van &quot;cargo mapping&quot; analyse

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Inzicht in de mechanismen waarmee moleculaire motoren hun activiteiten coördineren om vesiculaire ladingen binnen neuronen vervoeren vereist de kwantitatieve analyse van motor / vracht verenigingen bij de enkele blaasje niveau. Het doel van dit protocol kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebruiken correlatie (&quot;kaart&quot;) de positie en richting van de beweging van levende lading van de samenstelling en relatieve hoeveelheden van motoren verbonden met dezelfde lading. &quot;Cargo mapping&quot; bestaat uit levend beeldvorming van fluorescent gelabelde ladingen bewegen axons gekweekt op microfluïdische inrichtingen, gevolgd door chemische fixatie tijdens de opname van levende beweging en daaropvolgende immunofluorescentie (IF) kleuring van exact dezelfde axonale gebieden met antilichamen tegen motoren. Colokalisatie tussen ladingen en hun bijbehorende motoren wordt beoordeeld door het toewijzen van sub-pixel positie coördinaten naar motor en vracht kanalen, door het aanbrengen van Gaussische functies om de diffractie-limited puntspreidingsfuncties vertegenwoordigen individuele fluorescerende puntbronnen. Vaste lading en motorische beelden worden vervolgens gelegd op percelen van vracht-verkeer, tot &quot;kaart&quot; om hun bijgehouden trajecten. De sterkte van dit protocol is de combinatie van levende en IF gegevens aan voor het transport van vesiculaire ladingen in levende cellen opgetekend en motoren gekoppeld aan deze exact dezelfde vesicles te bepalen. Deze techniek overwint eerdere uitdagingen die biochemische methoden gebruiken om de gemiddelde motor samenstelling van gezuiverd heterogene bulk blaasje populatie te bepalen, omdat deze methoden niet composities op enkele bewegende lading onthullen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van andere transport- en / of handel trajecten in andere celtypes om de beweging van afzonderlijke intracellulaire structuren correleren met hun eiwitsamenstelling. Beperkingen van dit protocol zijn de relatief lage omzet hebben vanwege de lage efficiëntie van de transfectie van gekweekteprimaire neuronen en een beperkt gezichtsveld beschikbaar voor hoge-resolutie imaging. Toekomstige toepassingen kan werkwijzen omvatten het aantal neuronen tot expressie fluorescent gelabelde lading verhogen.

Figuur 1 toont een overzicht van de microfluïdische inrichting waarmee hippocampale neuronen groeien (Figuur 1A, B). Neuronen worden uitgeplaat in reservoir 1. De grootte van de microkanalen voorkomt de diffusie van cellichamen (soma) in het axonale compartiment terwijl de lengte van de kanalen voorkomt dendritische uitsteeksels vanaf kruising tot aan het axonale compartiment. Na ~ 2-3 dagen in cultuur, beginnen de neuronen een verlenging van hun axonen over microkanalen in het axonale ...

Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van &quot;Cargo Mapping&quot; Analyse

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Het algemene doel van cargo mapping is om de relatieve hoeveelheid en het type moleculaire motoreiwitten te bepalen die zich associëren met en beweegbare vesiculaire ladingen verplaatsen en om deze samenstelling van motoren te correleren met een richting van levend laadbeweging. Dit wordt bereikt door eerst primaire muis hippocampus neuronen in microfluïdische apparaten te laten groeien, zodat axonen relatief recht groeien en door de levende intracellulaire beweging van fluorescent gelabelde ladingsproteïnen in de axonen van tijdelijk getransfecteerde neuronen op te nemen. De tweede stap is het fixeren van neuronen tijdens het beeldvormen van levende ladingen en vervolgens het kleuren van de axonen met antilichamen tegen moleculaire motoreiwitten zoals kinesine en dines, gevolgd door beeldvorming met immunofluorescentie microscopie.Vervolgens worden de bevestigde lading en motor afbeeldingen uitgelijnd met de plots van laadbeweging over tijd, ook wel krafts genoemd om de levende laadbeweging te correleren met de gekleurde geassocieerde motoren zoals bepaald door de immunofluorescente kleuring. De laatste stap is het bepalen van de subpixel posities van lading en motor eiwitten met behulp van een op maat ontwikkelde MATLAB software pakket genaamd motor colocalisation. Deze software geeft de precieze XY coördinaten van elke lading en motor positie, evenals de relatieve hoeveelheid van fluorescentie intensiteiten geassocieerd met ladingen en motoren.Uiteindelijk biedt correlatie van fluorescentie microscopie van levende en vaste ladingen en motoren op subpixel resolutie niveau informatie over de soorten motoren die geassocieerd zijn met specifieke ladingen waarvan de richting van beweging bekend is. Dus deze methode biedt inzicht in het mechanisme van exon transport. Het kan worden toegepast op andere studies die levensmicroscopie correleren met immunofluorescente kleuring, zoals de Associatie van Eiwitten met microtubials tijdens microtubulaire dynamica of de recrutering van eiwitten tijdens endocytose.Visuele demonstratie van deze methode zal helpen om de beeldvorming, fixatie en analyse stappen uit te voeren, die anders moeilijk te leren kunnen zijn omdat ze een gespecialiseerde opstelling vereisen. De muis hippocampus primaire neuronen voor deze procedure worden bereid zoals beschreven in de protocol tekst en opnieuw gesuspendeerd in neuro basale eigroei. Medium om de neuronen in de microfluïdische apparaat te plateren.Verwijder medium van microfluïdisch reservoir een en een prime. Breng 20 microliter cellen aan op het microfluïdisch reservoir een en laat ze stromen. Plaats het apparaat in een 37 graden Celsius incubator met 5%CO2 gedurende 20 minuten.Kijk onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen hechten aan het bedekt glas. Voeg neuro basaal, een groeimedium toe om alle reservoirs af te sluiten. Breng het apparaat met cellen terug naar de incubator tegen dag negen.In cultuur, verlengen de neuronen axonen door de micro kanalen en zijn klaar voor transfectie voor de expressie van fluorescente proteïnen. De levende beeldvorming van de getransfecteerde muis hippocampus primaire neuronen wordt uitgevoerd op een omgekeerde epi fluorescentie licht microscoop, uitgerust met een 37 graden Celsius incubator en een CO2 controle kamer. Om deze procedure te beginnen, selecteer de 100 x olie objectief.Breng olie aan op het objectief en monteer de dekglas met de hippocampus neuronen die in een microfluïdisch apparaat zijn gekweekt, op de microscoop stage. Om neuronale dood te voorkomen, werk snel om de monsters niet langer dan een uur in de microscoop te houden. Zoek axonen van getransfecteerde cellen die zich uitstrekken door de kanalen van de microfluïdische kamer.Noteer het aantal kanalen waarin het getransfecteerde axon werd gevonden. Tel het aantal kanalen met behulp van een hand tellingteller voor optimale registratie van levende beweging en daaropvolgende colocalisation analyse. Kies axonen die relatief plat groeien door de kanalen zodat beeldvorming van de meeste blaasjes kan worden uitgevoerd in focus.Om de daaropvolgende uitlijning van vaste beelden met bewegingstrajecten op chm graft te vergemakkelijken. Lijn de rechter rand van de micro kanalen uit met het beeldveld tijdens beeldvorming. Om de cellen succesvol te fixeren tijdens levende beeldvorming, wordt de procedure het beste uitgevoerd met twee mensen, één persoon om het fixeermiddel toe te voegen en een andere persoon om de focus aan te passen.Het is ook belangrijk om alle reagentia klaar te hebben en binnen handbereik. Gebruik een plastic transfer pijpje van één milliliter. Verwijder het meeste medium uit reservoirs twee en twee Prime Start beeldvorming levende laadbeweging met time lapse specificaties specifiek voor de transportdynamica van de lading die wordt geanalyseerd.Nadat voldoende levende bewegingsgegevens zijn verzameld, laat één persoon reservoirs twee en twee prime vullen met voorverwarmd fixeermiddel. Vermijd het aanraken van het microfluïdische apparaat, omdat dit de focus van de levende beeldvorming zal verstoren. Laat de andere persoon de focus aanpassen terwijl het fixeermiddel wordt toegevoegd.Op dezelfde manier, vul de reservoirs een en een prime met het fixeermiddel. Fixatie is succesvol wanneer onmiddellijke stopzetting van de beweging wordt waargenomen. Vervolgens worden de vaste neuronen gekleurd met antilichamen tegen endogene motor eiwitten en beeldvorming zoals beschreven in de protocol tekst. Om cargo mapping te beginnen, genereer een chromograaf van de laadbeweging met behulp van beeldanalyse software.De Image J plugin ontwikkeld door Rich Dorf Insights wordt aanbevolen voor het genereren van Kraft met behulp van commercieel verkrijgbaar grafische software. Handmatig pas de immunofluorescence beeld van lading aan op de CHM grafiek van laadbeweging, superponeer de lading punten op de positie van de trajecten in de chm grafiek op het punt van fixatie zodat elke lading punt overeenkomt met een specifiek traject op de CHM grafiek. Voor de beste uitlijning resultaten, gebruik de Z slice die in de beste focus is voor de gekarteerde lading. Verschillende Z slices kunnen worden gebruikt voor elke afbeelding in de Z stack.Bepaal de XY coördinaten en intensiteit amplitudes voor elke fluorescente punt met behulp van een gevestigd algoritme om 2D gaussians te passen aan de punt spreidingsfunctie die de puntbronnen in elk van de drie kanalen vertegenwoordigt. Om de XY coördinaten te verk

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.

Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

Hier wordt een protocol voorgelegd aan Kinesin-1 ladingen te identificeren. Een motorloze mutant van de kinesine-1 zware keten (KIF5B) aggregaten in het cytoplasma en induceert aggregatie van de ladingen. Beide aggregaten gedetecteerd onder fluorescentiemicroscopie. Een soortgelijke strategie kan worden toegepast om ladingen van andere auto eiwitten te identificeren.

Identificatie van kinesine-1 Cargos Met behulp van fluorescentiemicroscopie

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Het artikel beschrijft de optimalisatie van de acquisitieparameters van fluorescentiemicroscopie om het axonale transport van endogene gelabelde ladingen met een resolutie van één neuron in een levende nematode te visualiseren.

Optimalisatie van visualisatie van axonaal transport van endogene lading door fluorescentiemicroscopie in levende Caenorhabditis elegans

Leer hoe je moleculaire motor-eiwitten op axonale cargo karakteriseert met behulp van cargo mapping-analyse in primaire muizenhippocampusneuronen. Deze methode correleert motorcompositie met transportrichting.

Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse

Meer video's verkennen