Karakteriseren van de Samenstelling van moleculaire motoren op Moving Axonale Cargo Met behulp van "Cargo Mapping" Analyse
30 oktober 2014
Intracellulair transport van ladingen, zoals blaasjes of organellen, wordt uitgevoerd door moleculaire motoreiwitten die op gepolariseerde microtubuli volgen. Dit protocol beschrijft de correlatie van de directionele richting van transport van individuele vrachtdeeltjes die zich binnen neuronen bewegen, naar de relatieve hoeveelheid en het type van geassocieerde motoreiwitten.
Het algemene doel van cargo mapping is om de relatieve hoeveelheid en het type moleculaire motoreiwitten te bepalen die zich associëren met en beweegbare vesiculaire ladingen verplaatsen en om deze samenstelling van motoren te correleren met een richting van levend laadbeweging. Dit wordt bereikt door eerst primaire muis hippocampus neuronen in microfluïdische apparaten te laten groeien, zodat axonen relatief recht groeien en door de levende intracellulaire beweging van fluorescent gelabelde ladingsproteïnen in de axonen van tijdelijk getransfecteerde neuronen op te nemen. De tweede stap is het fixeren van neuronen tijdens het beeldvormen van levende ladingen en vervolgens het kleuren van de axonen met antilichamen tegen moleculaire motoreiwitten zoals kinesine en dines, gevolgd door beeldvorming met immunofluorescentie microscopie.
Vervolgens worden de bevestigde lading en motor afbeeldingen uitgelijnd met de plots van laadbeweging over tijd, ook wel krafts genoemd om de levende laadbeweging te correleren met de gekleurde geassocieerde motoren zoals bepaald door de immunofluorescente kleuring. De laatste stap is het bepalen van de subpixel posities van lading en motor eiwitten met behulp van een op maat ontwikkelde MATLAB software pakket genaamd motor colocalisation. Deze software geeft de precieze XY coördinaten van elke lading en motor positie, evenals de relatieve hoeveelheid van fluorescentie intensiteiten geassocieerd met ladingen en motoren.
Uiteindelijk biedt correlatie van fluorescentie microscopie van levende en vaste ladingen en motoren op subpixel resolutie niveau informatie over de soorten motoren die geassocieerd zijn met specifieke ladingen waarvan de richting van beweging bekend is. Dus deze methode biedt inzicht in het mechanisme van exon transport. Het kan worden toegepast op andere studies die levensmicroscopie correleren met immunofluorescente kleuring, zoals de Associatie van Eiwitten met microtubials tijdens microtubulaire dynamica of de recrutering van eiwitten tijdens endocytose.
Visuele demonstratie van deze methode zal helpen om de beeldvorming, fixatie en analyse stappen uit te voeren, die anders moeilijk te leren kunnen zijn omdat ze een gespecialiseerde opstelling vereisen. De muis hippocampus primaire neuronen voor deze procedure worden bereid zoals beschreven in de protocol tekst en opnieuw gesuspendeerd in neuro basale eigroei. Medium om de neuronen in de microfluïdische apparaat te plateren.
Verwijder medium van microfluïdisch reservoir een en een prime. Breng 20 microliter cellen aan op het microfluïdisch reservoir een en laat ze stromen. Plaats het apparaat in een 37 graden Celsius incubator met 5%CO2 gedurende 20 minuten.
Kijk onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen hechten aan het bedekt glas. Voeg neuro basaal, een groeimedium toe om alle reservoirs af te sluiten. Breng het apparaat met cellen terug naar de incubator tegen dag negen.
In cultuur, verlengen de neuronen axonen door de micro kanalen en zijn klaar voor transfectie voor de expressie van fluorescente proteïnen. De levende beeldvorming van de getransfecteerde muis hippocampus primaire neuronen wordt uitgevoerd op een omgekeerde epi fluorescentie licht microscoop, uitgerust met een 37 graden Celsius incubator en een CO2 controle kamer. Om deze procedure te beginnen, selecteer de 100 x olie objectief.
Breng olie aan op het objectief en monteer de dekglas met de hippocampus neuronen die in een microfluïdisch apparaat zijn gekweekt, op de microscoop stage. Om neuronale dood te voorkomen, werk snel om de monsters niet langer dan een uur in de microscoop te houden. Zoek axonen van getransfecteerde cellen die zich uitstrekken door de kanalen van de microfluïdische kamer.
Noteer het aantal kanalen waarin het getransfecteerde axon werd gevonden. Tel het aantal kanalen met behulp van een hand tellingteller voor optimale registratie van levende beweging en daaropvolgende colocalisation analyse. Kies axonen die relatief plat groeien door de kanalen zodat beeldvorming van de meeste blaasjes kan worden uitgevoerd in focus.
Om de daaropvolgende uitlijning van vaste beelden met bewegingstrajecten op chm graft te vergemakkelijken. Lijn de rechter rand van de micro kanalen uit met het beeldveld tijdens beeldvorming. Om de cellen succesvol te fixeren tijdens levende beeldvorming, wordt de procedure het beste uitgevoerd met twee mensen, één persoon om het fixeermiddel toe te voegen en een andere persoon om de focus aan te passen.
Het is ook belangrijk om alle reagentia klaar te hebben en binnen handbereik. Gebruik een plastic transfer pijpje van één milliliter. Verwijder het meeste medium uit reservoirs twee en twee Prime Start beeldvorming levende laadbeweging met time lapse specificaties specifiek voor de transportdynamica van de lading die wordt geanalyseerd.
Nadat voldoende levende bewegingsgegevens zijn verzameld, laat één persoon reservoirs twee en twee prime vullen met voorverwarmd fixeermiddel. Vermijd het aanraken van het microfluïdische apparaat, omdat dit de focus van de levende beeldvorming zal verstoren. Laat de andere persoon de focus aanpassen terwijl het fixeermiddel wordt toegevoegd.
Op dezelfde manier, vul de reservoirs een en een prime met het fixeermiddel. Fixatie is succesvol wanneer onmiddellijke stopzetting van de beweging wordt waargenomen. Vervolgens worden de vaste neuronen gekleurd met antilichamen tegen endogene motor eiwitten en beeldvorming zoals beschreven in de protocol tekst. Om cargo mapping te beginnen, genereer een chromograaf van de laadbeweging met behulp van beeldanalyse software.
De Image J plugin ontwikkeld door Rich Dorf Insights wordt aanbevolen voor het genereren van Kraft met behulp van commercieel verkrijgbaar grafische software. Handmatig pas de immunofluorescence beeld van lading aan op de CHM grafiek van laadbeweging, superponeer de lading punten op de positie van de trajecten in de chm grafiek op het punt van fixatie zodat elke lading punt overeenkomt met een specifiek traject op de CHM grafiek. Voor de beste uitlijning resultaten, gebruik de Z slice die in de beste focus is voor de gekarteerde lading. Verschillende Z slices kunnen worden gebruikt voor elke afbeelding in de Z stack.
Bepaal de XY coördinaten en intensiteit amplitudes voor elke fluorescente punt met behulp van een gevestigd algoritme om 2D gaussians te passen aan de punt spreidingsfunctie die de puntbronnen in elk van de drie kanalen vertegenwoordigt. Om de XY coördinaten te verk
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het intracellulaire transport van vracht binnen neuronen, waarbij specifiek wordt gekeken naar de rol van moleculaire motorproteïnen. Het protocol beschrijft hoe de directionaliteit van de vrachtbeweging gecorreleerd kan worden met de typen en hoeveelheden geassocieerde motorproteïnen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Intracellulair transport is essentieel voor de neuronale functie.
- Moleculaire motorproteïnen faciliteren de beweging van vesikels en organellen langs microtubuli.
- Het begrijpen van de dynamiek van motorproteïnen kan inzicht geven in neuronale transportmechanismen.
- Deze studie maakt gebruik van live-imagingtechnieken om de beweging van ladingen te analyseren.
Doel van de studie
- Om de associatie van moleculaire motorproteïnen met vesiculaire vracht in kaart te brengen.
- Om de samenstelling van motorproteïnen te correleren met de directionaliteit van de vrachtbeweging.
- Om het begrip van intracellulair transport in neuronen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Primaire hippcampale neuronen van muizen werden gekweekt in microfluïdische apparaten.
- Live-imaging van fluorescentielabelled vruchte-eiwitten werd uitgevoerd.
- Neuronen werden gefixeerd en gekleurd met antilichamen tegen motor-eiwitten.
- Immunofluorescentiemicroscopie werd gebruikt om motor-eiwitten te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Er is een correlatie vastgesteld tussen de bewegingsrichting van de vracht en de samenstelling van de motorproteïnen.
- Er is speciale MATLAB-software ontwikkeld voor de precieze lokalisatie van vracht en motorproteïnen.
- Metingen van de fluorescentie-intensiteit gaven inzicht in de dynamiek van motorproteïnen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de mechanismen van intracellulair transport.
Conclusies
- De studie correleert succesvol motorproteinetypes met de directionaliteit van het transport van vracht.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar neuronale transportprocessen informeren.
- Deze methodologie kan worden toegepast om intracellulaire dynamiek in diverse celtypen verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Inzicht in de samenstelling en dynamiek van moleculaire motoren op individuele bewegende vrachten biedt cruciaal mechanistisch inzicht voor target-validatie in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. Deze benadering maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te stroomlijnen door de functie van motorproteïnen te koppelen aan transportfenotypen van vrachten in fysiologisch relevante neuronale systemen. De methode ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in vroege discovery-fasen door de associaties tussen motor en vracht te kwantificeren die de axonale integriteit en synaptische functie beïnvloeden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om hypothesen over motorproteïnen te onderzoeken door specifieke kinesine- en dyneine-samenstellingen te correleren met directionele vrachttransporten in levende axonen.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve fluorescentiemetingen met sub-pixelresolutie om de motorstochiometrie op individuele vesicles te beoordelen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt het beperken van risico's bij het selecteren van targets door te onthullen hoe veranderingen in de motorsamenstelling het vrachttransport beïnvloeden, wat bijdraagt aan mechanistische modellen van transportgerelateerde pathologie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Assayklaarheid: Genereert gestandaardiseerde, correlatieve datasets die trajecten van levende cargo koppelen aan gefixeerde motor-immunostaining, wat reproduceerbare co-lokalisatieanalyse mogelijk maakt.
- Kwantitatieve output: Levert XY-coördinaten en fluorescentie-intensiteitsamplitudes voor cargo- en motorproteïnen, wat objectieve vergelijking tussen experimentele condities ondersteunt.
- Platformaanpasbaarheid: Kan worden uitgebreid naar andere intracellulaire transportpaden en celtypen om proteincompositie-functierelaties in transportprocessen te bestuderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Toepasbaar op modellen van neurodegeneratieve aandoeningen waarbij defecten in het axonaal transport vroege pathogene kenmerken zijn, zoals bij prionproteïne- of tau-gerelateerde pathologieën.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen live functionele beeldvorming en data over de moleculaire samenstelling, wat een biomarker-georiënteerde beoordeling van de transportgetrouwheid in preklinische modellen ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door dissociatiegebeurtenissen tussen motor en vracht te kwantificeren die correleren met transportfalen in ziekterelateerde systemen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De workflow voor cargo-mapping integreert live-imaging, fixatie en gemultiplexte immunofluorescentie om motor-eiwitanalyses te positioneren binnen het vroege ontdekkingscontinuüm, van target-engagement tot fenotypische screening in neuronale modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door het verlies of de mutatie van motorproteïnen te koppelen aan specifieke veranderingen in de richting en loopafstand van vracht in microfluïdische axonen.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via vaste referentiepunten (kymografen) en sub-pixel uitlijning, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en experimentele batches verbetert.
- Analytics: Biedt co-lokalisatiemetrieken en intensiteitsverhoudingen waarmee teams de rekrutering van motoren kunnen kwantificeren en condities kunnen vergelijken, zoals wild-type versus knockout-neuronen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de samenstelling van moleculaire motoren met transportfenotypes, wat de evaluatie van therapeutische kandidaten ondersteunt die gericht zijn op het herstellen van axonale tekorten in preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van motor-vrachtinteracties over diverse vesikeltypen (bijv. synaptische vesikels, organellen, pathogene aggregaten) in primaire neuronale culturen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in transportfenotypes door de motorsamenstelling direct te meten op functioneel gedefinieerde, bewegende vrachten.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde fixatie tijdens live-imaging en algoritmische co-lokalisatie, waardoor gebruikersafhankelijke variabiliteit in beelduitlijning wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van transportgerelateerde werkingsmechanismen mogelijk te maken, wat de investering in targets met een zwakke fenotypische correlatie in neuronale systemen vermindert.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogebaseerde prioritering van targets op basis van hun vermogen om specifieke motor-vrachtassociaties te herstellen of te moduleren die gekoppeld zijn aan een gezonde axonale flux.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire neuronale culturen, het hanteren van microfluïdische apparaten en live-cell imaging onder gecontroleerde omgevingscondities.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie met een hoge resolutie, stabiele driftcorrectie en multichannel-registratie voor een nauwkeurige sub-pixel uitlijning.
- Vereist cross-team standaardisatie van de timing van fixatie, antilichaamvalidatie en image-analyse pipelines om consistente co-lokalisatiescores tussen verschillende locaties te waarborgen.
- Aanpassing aan andere celtypen of transportroutes kan optimalisatie vereisen van de transfectie-efficiëntie, cargo-labeling en motor-antilichaampanels.
- Praktische beperkingen omvatten een lage transfectie-efficiëntie in primaire neuronen en een beperkt gezichtsveld, wat de doorvoer voor grootschalige screeningcampagnes kan beperken.
