Grondmonstername en isolatie van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidea)

Het doel van deze procedure is om de methoden en technieken te demonstreren die gewoonlijk worden gebruikt voor bodemmonsterneming en isolatie van enteropathogene nematoden. Dit wordt bereikt door eerst bodemmonsters te verzamelen door middel van een transectbenadering, of zoals aangetoond, een willekeurige bemonsteringsbenadering. Vervolgens worden de bodemmonsters afgenomen met insecten om selectief enteropathogene nematoden te herstellen.

De laatste stap is om de nematoden uit geïnfecteerde insecten te verzamelen met behulp van een gemodificeerde witte val. Uiteindelijk vertegenwoordigen deze technieken sleutelstappen voor de succesvolle vestiging van enteropathogene nematodenculturen in het laboratorium en vormen de basis voor downstream bioassays. Het voordeel van de bodemmonsternemingstechniek is dat we naar het veld kunnen gaan en volwassen stadia van pathogene nematoden kunnen verzamelen.

Ik verzamel liever monsters van insecten die zijn geïnfecteerd met deze nematoden, wat zelden voorkomt. De willekeurige monsterstrategie die we hanteren, wordt veel gebruikt om de diversiteit van pathogene nematoden uit een groot geografisch gebied of een gebied te beoordelen. Deze techniek werd voor het eerst beschreven door betting in Accur in 1975.

Het is een selectieve procedure gebaseerd op de premisse dat vrijlevende stadia zich aangetrokken zullen voelen tot insectengastheer en deze zullen parasiteren. Het demonstreren van de procedures zal de Rue Orozco afstudeerstudent zijn, en Ming Mingle onderzoekstechnicus in mijn laboratorium. De site voor het verzamelen van monsters moet een minimale oppervlakte van twee vierkante meter hebben, en indien mogelijk, groter zijn dan vier vierkante meter.

Voor elk bodemmonster neemt u ten minste drie kleinere submonsters binnen het DM een C-monstergebied. De submonsters kunnen worden gecombineerd als dit aan de doelstellingen van het onderzoek voldoet. Verzamel de bodemmonsters op een diepte van nul tot 15 centimeter.

Elk monster moet 250 gram tot één kilogram zijn. Gebruik bodemCORAs troffels, handschoppen of vergelijkbare gereedschappen en verzamel op minstens vijf willekeurige plaatsen binnen elk geselecteerd bemonsteringsgebied. Elk monster moet dubbel worden verpakt en gelabeld met een waterdichte markering.

Het label moet informatie bevatten over de site, locatie, hoogte, datum en omgevingsvariabelen zoals habitatbeschrijving met bijbehorende vegetatie en temperatuur op de site. Maak een notitie van de lokale insecten en andere ongewervelde soorten. Verzamel soorten die niet onmiddellijk kunnen worden geïdentificeerd voor latere identificatie in het lab tussen verzamelplaatsen grondig wassen de verzamelgereedschappen met water en desinfecteer ze vervolgens met 70%ethanol of 0,5%bleach.

Bewaar de bodemmonsters in een koelbox bij acht tot vijftien graden Celsius voor transport. CES scheidt een deel van het monster om de grove kenmerken van de bodem zoals de samenstelling, textuur, geleidbaarheid, enzovoort te analyseren. Verwijder uit elk bodemmonster het puin dat kan leiden tot seic microbe contaminatie.

Bevochtig vervolgens de bodem met water zodat de nematoden daarin gemakkelijk kunnen bewegen. Laad 200 tot 250 gram van de vochtige grond in een plastic container met een deksel. Voeg vervolgens insectenlokstoffen toe.

Vijf tot tien insecten zijn voldoende. Bevestig het deksel, draai de container om en zet het in het donker. Bij kamertemperatuur elke twee tot drie dagen, verwijder de dode insecten en vervang ze indien nodig door gezonde insecten voor extra weging.

Als het insectenkadaver bruin of oker is, suggereert dit Stein en Nema parasiterend parit. Terwijl als het lijk steenrood tot donkerpaars is, verwacht u hetero. Gebruik een gemodificeerde witte val om de nematoden te verzamelen die de insectenlokstoffen hebben geparasiteerd.

Plaats eerst het deksel van een 50 of 60 millimeter petrischaal in de basis van een 100 millimeter schaal. Plaats vervolgens een vel rond watman. Nummer één filterpapier in de kleinere schaal.

Spoel de insectenkadvers met gesteriliseerde water en breng ze over naar het filterpapier. Verspreid ze zodat ze niet met elkaar in contact komen. Vul alleen de grotere schaal met ongeveer 20 milliliter gedistilleerd water en bedek de assemblage met het deksel van de grotere schalen.

Label de schalen met de naam van de nematode, de datum van het insectenlokstof en datum. De val is ingesteld. Houd de vallen bij kamertemperatuur en controleer op infectieuze, juveniele nematoden of IJ's die uit de insectenkadvers komen.

Dit kan 10 tot 25 dagen duren en is afhankelijk van de temperatuur en het vochtgehalte van waar de val wordt bewaard. Als het waterniveau in de val is verdampt, zorg er dan voor dat u het opnieuw vult op platen met IJ's. Verzamel het water uit de grotere schaal, die nematoden zou moeten bevatten.

Laat de nematoden een paar minuten zinken en giet vervolgens langzaam het water af. Zodra de nematoden in een klein volume water achterblijven, spoel ze een paar keer af door water toe te voegen en het dan voorzichtig af te gieten. Maak vervolgens seriële verdunningsreeks om de nematodenpopulatie te schatten.

In een 250 milliliter kweekfles, pas de concentratie van de nematode aan tussen één en 3000 nematoden per milliliter. Bewaar deze suspensie tussen 10 en 20 graden Celsius. Over het algemeen in de natuur zijn de kansen om insecten geparasiteerd door enteropathogene nematoden te vinden erg laag.

Daarom werd het beschreven protocol met gebruik van G melanoma larven als lokaas gebruikt om dergelijke nematoden met een veel efficiëntere snelheid te isoleren. Na vijf dagen waren de insecten geïnfecteerd en hadden een rode kleuring. Gemodificeerde witte vallen toonden nematodensporen.

Na 15 dagen van deze vallen hadden de nematoden die in water werden verzameld, een schone uitstraling en waren vrij van insectenweefsels. Een enkele extractiecyclus met gallium Melania-larven kan onvoldoende zijn om alle Oma-pathogene nematoden te herstellen die zich in een bodemmonster bevinden. Daarom raden we aan dit meerdere keren te doen.

Ook raden we gebruikers aan om andere insecten te overwegen dan Galleria, wat ook de herstelkansen zal verbeteren. Het debatteren van bodemmonsters met insecten is een techniek die ook kan