Name: Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer een protocol voor grootschalige handmatige dissectie van kloppende harten uit levende zebravisembryo's. Deze methode maakt extractie van hartspecifiek RNA mogelijk voor transcriptoomanalyse van genexpressie tijdens de hartontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen C. Burns, C. McRae bedanken voor het schetsen van het basisprincipe van dit zuiveringsprotocol, en F. Priller voor de eerste implementatie van deze methode in ons lab. S.A.-S. wordt ondersteund door een Heisenberg-hoogleraarschap van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie SE2016/7-1.

Dit protocol volgt de verzorging van dieren richtlijnen van de Duitse en Berlijn staat de wet; zebravis administratiekosten werd gecontroleerd door de lokale autoriteiten voor de bescherming van dieren (LaGeSo, Berlin-Brandenburg). 1. Het verkrijgen van zebravis embryo&#39;s voor Hart Extraction <ol><li> Kruis cardiale reporter zebravis, zoals de Tg (myl7: EGFP) twu34 transgene lijn 9 om embryo&#39;s te verkrijgen met hart-specifieke GFP expressie. </li><li> Handhaving van de embryo&#39;s in ei water bij 28,5 ° C tot de gewenste embryonale fase 10,11. Zorg ervoor dat de verzamelde embryo bevolking homogeen is zowel genetisch en door ontwikkelingsstadium om variaties in genexpressie te beperken. </li><li> Dechorionate de embryo&#39;s handmatig. </li></ol> 2. Ontleden de zebravis embryonale Hearts OPMERKING: Houd alle oplossingen op het ijs. Indien mogelijk, doe teamwork: één persoon ontleedt de harten van de EMBzelfgerolde sigaretten toe terwijl een ander sorteert de harten onder de fluorescentie stereomicroscoop. Dit maakt de verwerking van verscheidene honderden embryo&#39;s in een paar uur. <ol><li> Breng ongeveer 100 embryo&#39;s in een 1,5 ml centrifugebuis. Verdoven de embryo&#39;s met tricaïne (0,16 mg / ml in medium E3). Tijd na de embryo duidelijk verdoofd (en niet zwemmen en sediment naar de bodem van de buis, maar hun hart nog kloppen). </li><li> Verwijder de tricaïne / E3 oplossing en was het embryo eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium en op ijs handhaven. OPMERKING: De L-15/10% FBS medium belang organen en cellen in leven gedurende de gehele dissectie totdat de harten werden overgebracht naar RNAlater of Trizol. </li><li> Voeg 1 ml L-15/10% FBS medium om de embryo&#39;s en pipet op en neer 5-8 keer met een Round Gel Laden Tip totdat de dooier volledig wordt verstoord. Pipetteer de embryo druppelsgewijs op het oppervlak van de oplossing, zodat de druppel barsten ende embryo&#39;s worden voorzichtig verstoord. OPMERKING: Hoe krachtig en hoe vaak de embryo&#39;s hebben om te worden gepipetteerd en neer hangt af van het ontwikkelingsstadium van het embryo, dat wil zeggen meer pipetteren nodig is op de late stadia (bijvoorbeeld bij 56 HPF). </li><li> Voor de eerste partij ontleed embryo, beoordeelt de integriteit van het embryo en de hoeveelheid ontleed harten onder een stereomicroscoop, aangezien sommige harten blijven aan het embryo als ook voorzichtig gepipetteerd. Pas de wijze van pipetteren de volgende rondes van dissectie dienovereenkomstig. OPMERKING: Gebruik een lage retentie pipet tips en microcentrifugebuisjes om de harten vast te houden aan het plastic te minimaliseren. </li><li> Breng het monster op een 100 um filter geplaatst op een 50 ml centrifugebuis; Spoel 1,5 ml buis met 1 ml L-15/10% FBS medium en breng dit op de filter om verlies van monster te minimaliseren (sommige harten kunnen kleven aan de wanden van de buis). Was het filter tweemaal met 1 ml L-15 / 10% FBS. In deze stap het hart door het filter en worden verzameld in de 50 ml buis. </li><li> Breng de doorstroming op een 30 urn filter geplaatst op een 15 ml centrifugebuis en spoel de filter eenmaal met 1 ml L-15/10% FBS medium. In deze tweede filtratiestap, worden de harten vastgehouden in de filter en kleinere vuil wordt weggespoeld. </li><li> Draai het filter ondersteboven en spoel de harten uit de filter in een 1% agarose gecoate petrischaal door toepassing van drie opeenvolgende wassingen met 1 ml L-15/10% FBS. </li><li> Handmatig scheiden GFP-positieve harten van de fluorescent embryonale vormt (zoals ooglenzen) met een pincet onder een fluorescentie stereomicroscoop en ze te concentreren in het midden van de schaal. Verzamel ze volgens stap 3. OPMERKING: Als de embryo&#39;s ouder zijn dan 24 HPF, moet de harten te kloppen, wat aangeeft dat de weefsels nog fysiologisch normaal. </li></ol> 3. Het isoleren van mRNA uit Dissected Hearts <ol><li> Verzamel de harten in het kleinst mogelijke volume (bijvoorbeeld 10 pi) en pipet in een 1,5 ml buis met 0,75 ml RNAlater (op ijs). Controleer of er geen harten blijven in de pipet door het bekijken van het onder een fluorescentie stereomicroscoop. </li><li> Als alternatief, als een chemische kap is verkrijgbaar in de onmiddellijke nabijheid van de fluorescentie microscoop, de overdracht van de verzamelde harten tot Trizol (LET) onder de chemische motorkap. Dit omzeilt het mogelijke verlies van harten steken in de pipet tip en ook tijdens het centrifugeren van de harten (stappen 3.4, 3.5 en 3.7). Bundelen de harten van verschillende rondes van isolatie in dezelfde buis met Trizol en ga direct naar stap 3.8; het eindvolume niet meer dan 10% van het oorspronkelijke TRIzol volume. LET OP: Lees de Trizol Material Safety Data Sheet (MSDS) voor gebruik. Handvat Trizol reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Contact met de huid, ogen en clothi voorkomenng. Verwijder alle ontstekingsbronnen. </li><li> Verzamel de harten van verscheidene rondes van isolatie in dezelfde buis met RNAlater (op ijs), de efficiëntie van RNA isolatie verbetert de hoeveelheid weefsel verzameld. Als de totale steekproef volume van meer dan 10% van de oorspronkelijke RNAlater volume, gebruik dan een extra buis met 0,75 ml RNAlater voor opslag (op ijs). </li><li> Centrifugeer de monsters bij 15.700 xg gedurende 20 min bij 4 ° C om de harten sedimenteren. </li><li> Onder een fluorescentie stereomicroscoop, verzamel voorzichtig zoveel supernatant mogelijk in een 1% agarose gecoate petrischaal die 3 ml L-15/10% FBS medium, maar de gesedimenteerde harten niet verstoren de bodem van de centrifugebuis. Aangezien tot 15% van de harten in de supernatant blijven vanwege de hoge viscositeit van RNAlater, halen ze als beschreven in stap 3.7. </li><li> Onder een chemische motorkap, voeg 0,5 ml Trizol aan de buis met het bezonken harten en blijf op ijs. </li><li> Onder de fluorescerende Micrpe, breng de harten (uit stap 3.5) van de 1% agarose gecoate schaaltje met het RNAlater / L-15/10% FBS oplossing in een 1% agarose gecoate schaal met 3 ml L-15/10% FBS te verdunnen uit de RNAlater. Verzamel de harten in het midden van de petrischaal en overbrengen in een klein volume in de buis gesedimenteerd harten in Trizol onder een chemische kap. </li><li> Vortex 1,5 ml buis met de harten in Trizol het hart verstoren en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Onder een chemische motorkap, voeg 100 ul chloroform (LET), meng en breng de Trizol / chloroform oplossing in een 1,5 ml voorgevulde gesponnen PLG buis (centrifuge 30 sec bij maximale snelheid voor gebruik). Incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur. LET OP: Lees de chloroform MSDS voor gebruik. Handvat chloroform reagens onder een kap en slijtage persoonlijke veiligheidsuitrusting is aanbevolen. Vermijd contact met de huid, ogen en kleding. Uit de buurt van onverenigbare houden zoals metalen, basen. </li><li> Centrifugalege het monster bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en breng de waterige fase naar een nieuwe buis van 1,5 ml. </li><li> Voeg 5-10 gg glycogeen en 250 pl voorgekoeld (bij -20 ° C) isopropanol; Meng goed en incubeer overnacht bij -20 ° C. </li><li> Centrifugeer het monster bij 15.700 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Was de pellet met 1 ml 75% ethanol, centrifugeer bij 15.700 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Laat het ethanol verdampen door drogen de pellet bij kamertemperatuur totdat deze wit (bijv 10-15 min). </li><li> Voeg 20 ul RNase-free DDH 2 O tot de pellet en incubeer gedurende 10-15 min bij 55 ° C om het RNA te lossen; dan blijven op ijs. </li><li> Beoordeel de RNA-concentratie en zuiverheid door absorptie meting. Beoordeel de RNA integriteit door het uitvoeren van het monster op een 1% agarosegel. </li></ol>

<ol><li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li>
<li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li>
<li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li>
<li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+technology+-+enhanced+versatility%2C+persistent+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li>
<li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li>
<li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li>
<li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li>
<li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li>
<li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li>
<li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol maakt de snelle verrijking van de zebravis embryonale hartweefsel voor genexpressie analyses. De kwantiteit en kwaliteit van de cardiale-specifieke RNA-monster is sterk afhankelijk van een aantal cruciale stappen: eerst wordt de hoeveelheid van het monster sterk verbeterd als het verlies van de harten wordt voorkomen bij elke stap van het protocol, omdat RNA zuivering werkt alleen met voldoende uitgangsmateriaal. Ten tweede, de zuiverheid van het monster, die volledig afhankelijk is van de experimentator, w...

Zebravis (Danio rerio) wordt veel gebruikt in ontwikkelingsbiologie in organogenese in vivo te bestuderen vanwege zijn snelle, transparante en buitenbaarmoederlijke embryonale ontwikkeling, in combinatie met de geringe omvang en de beschikbaarheid van transgene reporter lijnen met weefsel-specifieke expressie van fluorescerende eiwitten. Dit kleine gewervelde is bijzonder geschikt voor hartontwikkeling studeren, omdat oxygenatie van de vroege zebravis embryo niet afhankelijk hartslag en bloedstroom; Deze functies zijn toegelaten de karakterisering van grote aantallen cardiovasculaire mutanten 1,2 en de zebravis is nu algemeen erkend modelorganisme hartziekten 3 bestuderen. Om de genexpressie te bestuderen tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn transcripties vaak geanalyseerd door geheel-mount in situ hybridisatie (WISH) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6, of next generation sequencing (RNA-Seq) 7. TerwijlWISH kan een ruimtelijk-temporele analyse van genexpressie in het gehele embryo worden transcript niveaus gewoonlijk bepaald door RT-qPCR, microarrays of RNA-Seq benaderingen. Deze werkwijzen vereisen weefsel verrijking voor genexpressie profilering. Omdat het zebravis embryonale hart slechts een klein deel van de gehele embryo, transcriptoom studies gedurende cardiale ontwikkeling vereist een protocol voor dissectie en verrijking van harten. Bovendien fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de cardiale weefsel volledig functioneel tot RNA-extractie behouden. We beschrijven hier een protocol voor het snel isoleren fysiologisch normaal en kloppende harten van honderden zebravis embryo&#39;s van hoge kwaliteit RNA monsters efficiënt te krijgen voor verdere analyses. De onderhavige werkwijze is gebaseerd op het protocol beschreven door Burns en MacRae, 2006 8. Voor verrijking van hartweefsel beide methoden een transgene myocardiale reporter lijnen profiteer van de differentiële hechting eigenschappen van de zebravis embryonale harten versus andere weefsels. Kort pipetteren veel embryo en neer door een smalle pipetpunt, harten gelijktijdig vrijkomen uit embryonale organen en vervolgens gescheiden uit embryonale puin in twee stappen snel filtreren; fluorescent gelabelde harten worden vervolgens handmatig gesorteerd blijft vuil en verzameld voor verdere verwerking.

<table><tbody><tr><td>Equipment for raising fish and collecting eggs&nbsp;</td><td></td><td></td><td>zie het Zebrafish Book11 voor details</td></tr><tr><td>Fluorescentie stereomicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Spectrofotometer</td><td></td><td></td><td>bijv. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Nucleïnezuur elektroforesekamer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 4 cm &Oslash;, gecoat met 1% agarose in E3 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten en tips (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml centrifugebuizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml en 50 ml centrifugebuizen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paar Dumont #5 pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExactaCruz&trade; Ronde Gel Loading Tips in steriele Rack, 1-200&mu;l&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;m filter (Pre-Separation Filters-30 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock gel, heavy, 1,5 ml buizen&nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Eiwater medium</td><td></td><td></td><td>60 &mu;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0,00001% (w/v) Methyleen Blauw</td></tr><tr><td>E3 medium&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoëzuurethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine stamoplossing, pH 7</td></tr><tr><td>1% agarose (in E3 medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% agarose gel (in TBE buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&acute;s L-15 medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &micro;g/&micro;l in RNase-vrij water</td></tr><tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water of gesteriliseerde DEPC behandelde ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleïnezuur laadbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer voor elektroforese</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

grootschalige de zebravis embryonale hart dissection voor transcriptionele analyse

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

De zebravis embryonale hart is samengesteld uit slechts een paar honderd cellen, die slechts een klein deel van de gehele embryo. Daarom, om de cardiale transcriptoom van wordt gemaskeerd door het wereldwijde embryonale transcriptoom voorkomen, moet voldoende harten voor verdere analyse te verzamelen. Zoals zebravis hartontwikkeling snel verloopt, hart inzameling en RNA winningsmethoden moet snel zijn om de homogeniteit van de monsters te verzekeren. Hier presenteren we een snelle handleiding dissectie protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten van de zebravis embryo&#39;s. Dit is een essentiële voorwaarde voor verdere cardiaal-specifieke RNA-extractie cardiale genexpressie te bepalen door transcriptoom analyse, zoals kwantitatieve real-time polymerase-kettingreactie (RT-qPCR). De methode is gebaseerd op differentiële klevende eigenschappen van de zebravis embryonale hart in vergelijking met andere weefsels; Dit maakt een snelle PHYsieke scheiding van cardiale van extracardiale weefsel door een combinatie van vloeibare dwarskracht verstoring stapsgewijze filtratie en handmatige verzameling van transgene fluorescent gelabelde harten.

We beschrijven hier een representatief hart dissectie experiment met behulp van de zebravis Tg (myl7: GFP) twu34 transgene lijn 9, die groen fluorescerend eiwit (GFP) drukt uitsluitend binnen het myocard (afb. 1). We verzamelden zowel ontleed hart en de embryo&#39;s waarvan ze zijn afgeleid om de zuiverheid van het hart monster beoordelen. In het kort, homozygote Tg (myl7: GFP) twu34 zebravis 9 werden outcrossed met wild-type, zodat alle embryonale harten wer...

Cardiale genexpressie profielen te analyseren tijdens zebravis ontwikkeling van het hart, heeft totaal RNA worden geëxtraheerd uit geïsoleerde harten. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van functionele / kloppende harten door snelle handmatige dissectie van de zebravis embryo&#39;s tot cardiale-specifieke mRNA te verkrijgen.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Het algemene doel van deze procedure is om harten te verzamelen door snelle handmatige dissectie van levende zebravis-embryo's om hartspecifiek Mr.NA te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst met een pipet veel verdovde embryo's op en neer door een smalle pipettentip te pijpen om tegelijkertijd de harten los te maken van de embryonale lichamen. Vervolgens worden de gedissekteerde harten in twee snelle filtratiestappen gescheiden van embryonaal afval. Daarna worden de fluorescentie gelabelde harten handmatig gesorteerd van overgebleven afval.Ten slotte wordt hartspecifiek RNA uit de verzamelde harten geëxtraheerd. Uiteindelijk wordt het hartdissectieprotocol gebruikt om voldoende hoeveelheden embryonale harten te verzamelen om transcriptoomanalyse uit te voeren. Deze methode zal helpen om belangrijke vragen te stellen in het ontwikkelingsveld van het zilvervishart, zoals welke transcripten worden uitgedrukt binnen het hart in verschillende ontwikkelingsstadia, en ook de expressie van wilde en mutante harten vergelijken Om zebravis-embryo's te verkrijgen voor hartextractie, kruist u volwassen transgene vissen die een fluorescente eiwit in het hart tot expressie brengen, zoals transgene mijl zeven EGFP onder de stereomicroscoop.Bewaak de ontwikkeling van de embryo's. Controleer of de harten inderdaad fluorescent gelabeld zijn en ontmantel de embryo's handmatig wanneer de embryo's de gewenste fase hebben bereikt. Breng ongeveer 100 embryo's over in een 1,5 milliliter fugebuis en voeg punt 16 milligram per milliliter trica in E drie medium toe om ze te verdoven.Plaats de buis op ijs. Verwijder de trica-oplossing en gebruik één milliliter ijskoud L 15 10%FBS medium om de embryo's te wassen, houd ze op ijs. Na het verwijderen van deze was, voeg één milliliter van L 15 FBS toe en gebruik een ronde gel laadtip om de embryo's vijf tot acht keer op en neer te pipetten om de dooiers volledig te verstoren, pipet de embryo's druppelsgewijs op het oppervlak van de oplossing zodat de druppel zal barsten en de embryo's zachtjes worden verbroken.Voor deze eerste batch van gedissekteerde embryo's onder een stereomicroscoop, beoordeelt u hun integriteit en de verhouding van gedissekteerde harten en past u de manier van pipetteren dienovereenkomstig aan. Voor volgende batches, plaatst u een 100 micrometer filter op een 50 milliliter centrifugeerbuis en brengt u het embryonale monster aan. Gebruik vervolgens één milliliter van L 15 FBS om de fugebuis te spoelen en breng de oplossing aan op het filter om de harten die in het filter zijn gebleven weg te spoelen.Gebruik L 15 FBS om het twee keer te wassen. Plaats vervolgens een 30 micrometer filter op een 15 milliliter centrifugeerbuis en breng de stroom door het bevattende harten aan. Gebruik L 15 FBS om deze filter te spoelen, die de harten vasthoudt en kleiner afval wegspoelt.Keer vervolgens de 30 micrometer filter ondersteboven over een agros gecoate petrischaal en breng drie een milliliter was van L 15 FBS medium aan om de harten uit het filter te spoelen Onder een fluorescente microscoop, gebruik een tang om GFP-positieve harten handmatig te scheiden van niet-fluorescente weefsels, concentreer ze in het midden van de schaal. De fysiologie van de harten lijkt normaal omdat ze na de dissectie nog steeds kloppen.Procedure. Om mRNA uit de harten te isoleren, verzamel ze in het kleinst mogelijke volume medium en pipet ze in een 1,5 milliliter buis op ijs bevattende 0,75 milliliter RNA.Later onder de fluorescente microscoop. Bekijk de pipettentip om te controleren of er geen harten aan de pipettentip vastzitten. Nadat de harten uit verschillende rondes isolatie in de RNA-buis zijn getrokken, centrifugeer de monsters volgens het tekstprotocol bij 15.700 Gs en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Vervolgens verzamelt u onder een fluorescente microscoop zorgvuldig zoveel mogelijk sate en brengt u deze over in een met 1% agros gecoate petrischaal bevattend drie milliliter van L 15 10%FBS medium. Vervolgens voegt u onder een chemische kap 0,5 milliliter triol toe aan de buis met de gesedimende harten en bewaart deze op ijs Onder de fluorescente microscoop brengt u de harten die in het supernatant zijn achtergebleven over in een verse met 1% agros gecoate schaal met L 15 10%FBS om de RNA later, die erg stroperig is, uit te verdunnen. Verzamel vervolgens de harten in een klein volume en breng ze over in de buis met gesedimeerd harten in triol om de harten te verstoren, vortex de buis en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens onder een chemische kap 100 microliter chloroform toe, meng grondig en breng de oplossing over in een 1,5 milliliter PrepU, PLG buis. Incubeer gedurende drie minuten op kamertemperatuur, centrifugeer een monster bij 15.700 Gs en vier graden Celsius gedurende 15 minuten en breng de waterige fase over in een nieuwe 1,5 milliliter buis. Voeg vervolgens vijf tot tien microgram glycogeen en 250 microliter voorgekoelde isopropanol toe. Meng goed en incubeer een nacht bij min 20 graden Celsius de volgende dag.Centrifugeer de monsters bij 15.700 Gs en vier graden Celsius gedurende 30 minuten en gooi de snat weg. Breng één milliliter 75%ethanol aan om de paletcentrifuge te wassen en gooi de snat weg. Laat het resterende ethanol op kamertemperatuur uit het pellet verdampen tot het pellet wit wordt.Voeg 20 microliter RNA's vrij, tweemaal gedistilleerd water toe aan het pellet en incubeer bij 55 graden gedurende 10 tot 15 minuten om de RNA op te lossen. Plaats vervolgens de buizen op ijs. Gebruik een spectrofotometer om de RNA-concentratie en -zuiverheid te bepalen en voer een monster uit op een 1% agros gel om de integriteit van de RNAA te beoordelen Een vergelijking van de hartmonsters vóór het sorteren van embryonaal afval bij 56 uur na bevruchting versus 36 uur na bevruchting wordt hier getoond.Embryo's bij 56 uur na bevruchting leverden meer embryonaal af

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een duidelijke, gestandaardiseerde methode voor dissectie en isolatie van de zebravis hart op meerdere ontwikkelingsstadia worden beschreven. Annotatie en kwantificatie technieken worden ook besproken.

Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Deze video beschrijft een techniek om het hart te isoleren van een zebravis in meerdere ontwikkelingsstadia om hartontwikkeling, rijping en veroudering te bestuderen.

Hartdissectie: een methode om zebravis hartontwikkeling te observeren

Het gebruik van zebravissen voor cardiovasculair onderzoek breidt zich uit naar onderzoek naar volwassen harten. Voor deze toepassingen is snelle en eenvoudige isolatie van hartweefsels essentieel om postmortale veranderingen te voorkomen en om een voldoende aantal monsters te verkrijgen. Hier beschrijven we een snelle en reproduceerbare methode voor het dissecteren van harten van volwassen zebravissen.

Herstel van de Adult zebravis Harten voor High-throughput Toepassingen

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

Het doel van dit protocol is om een nieuwe methode voor de beoordeling van de segmentale cardiale functie bij embryonale zebravissen onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden te beschrijven.

Verplaatsinganalyse van Myocardiale mechanische vervorming (DIAMOND) onthult segmentale heterogeniteit van cardiale functie bij embryonale zebravis

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Deze studie stelt een op gevoelige immunofluorescentie gebaseerde beeldvormingsmethode vast om globale DNA-methylering in individuele zebravisembryonale harten te kwantificeren. Deze aanpak overwint de uitdaging van beperkt weefselmateriaal en omzeilt de noodzaak van bisulfietconversie.

Detectie van wereldwijde DNA-methylering in het hart van zebravislarven

Leer een protocol voor grootschalige handmatige dissectie van kloppende harten uit levende zebravisembryo's. Deze methode maakt extractie van hartspecifiek RNA mogelijk voor transcriptoomanalyse van genexpressie tijdens de hartontwikkeling.

Grootschalige de zebravis embryonale Hart Dissection voor Transcriptionele Analyse

Meer video's verkennen