Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Het algemene doel van deze procedure is om de interactie tussen twee eiwitten of eiwitdomeinen in kaart te brengen. In dit geval worden de kankergerelateerde eiwitdomeinen still en CHFR bestudeerd. Het algemene doel van deze procedure is om de interactie tussen twee eiwitten of eiwitdomeinen in kaart te brengen.

In dit geval worden de kankergerelateerde eiwitdomeinen still en CHFR bestudeerd. De tweede stap is om de CHFR-peptidearray in te couveer met zijn bindingspartner, het still-eiwit. Vervolgens wordt de array gewassen en geïncubeerd met paardenradijs peroxidase, geconjugeerd antilichaam.

De array wordt vervolgens onderworpen aan chemisch luminescentiedetectie om de binding te detecteren. De laatste stap is om de resultaten te analyseren en de bindingsplaatsen tussen de eiwitten te identificeren. Deze studie baant de weg voor het ontwerpen van rationele remmers van de stille CHFR-binding, waarvan de ongecontroleerde interactie kan leiden tot de ontwikkeling van kanker.

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het onderzoek naar eiwitinteractie te beantwoorden, zoals wat de specifieke regio's zijn die mediëren. Een interactie tussen twee eiwitten, verdeel de sequentie van het doeleiwit in 10 tot 20 residuepeptiden. Die gedeeltelijk overlappen. De hoeveelheid overlapping kan worden gevarieerd, maar in principe geldt: hoe langer de overlapping, hoe beter.

Bij het ontwerpen van de peptiden moet rekening worden gehouden met bekende secundaire structuurelementen in het eiwit die verantwoordelijk kunnen zijn voor de interactie. De ontworpen peptidearray kan worden besteld via commerciële leveranciers. Voor dit experiment worden peptiden van de CHFR-domeinresiduen 4 24 tot 6 62 covalent aan de array gebonden via het C-uiteinde.

Na ontvangst van de ontworpen array, bereid deze voor op het experiment door hem eerst te blokkeren om niet-specifieke binding te voorkomen. Maak een blokkeeroplossing van 2,5% gewicht per volume. Magermelkpoeder in tris-bufferoplossing met 0,05% Tween 20 of TBST om niet-specifieke binding te voorkomen.

Dompel de array onder in vijf milliliter blokkeeroplossing. Incubeer de array twee tot vier uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius op een schudder. Was de array eerst met vijf milliliter blokkeeroplossing gedurende 30 seconden.

Was vervolgens de array twee keer met vijf milliliter TBST gedurende vijf minuten op een schudder bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens de gewassen array met vijf milliliter poly histidine-getagd eiwit oplossing bevattende 2,5% gewicht per volume. Magermelkpoeder om niet-specifieke binding te voorkomen.

Hier wordt een 4,5 micromolaire oplossing van still-eiwitresiduen 500 tot zes 50 gebruikt. Incubeer vervolgens de array in de eiwit oplossing gedurende drie tot acht uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Na incubatie in de eiwit oplossing.

Was de array met vijf milliliter TBST gedurende 30 seconden op een schudder bij kamertemperatuur, gevolgd door twee extra vijf minuten wasbeurten. Incubeer nu de gewassen array met vijf milliliter verdunde paardenradijs peroxidase geconjugeerd antilichaam in een incubatiebuffer die dezelfde ingrediënten bevat bij dezelfde concentraties als de blokkeeroplossing gedurende een uur op een schudder bij kamertemperatuur, het antilichaam kan zich binden aan het doeleiwit of het tag, voer controle-experimenten uit, test de interactie van het antilichaam met peptiden op de array door hetzelfde protocol te herhalen op een aparte array-slide zonder te incuberen met het eiwit voor het lezen van de arrays. Was ze zoals eerder met vijf milliliter TBST.

Voer chemiluminescentieontwikkeling uit met een verbeterde chemiluminescentie western blotting substrate kit. Voer de detectie uit met een lumineuze beeldanalysator zoals een Fuji film LAS 3000 camera. Analyseer de resultaten en zorg ervoor dat beide duplicaten op de array dezelfde signalen laten zien, zodat de resultaten betrouwbaar zijn.

Als de structuur van de eiwitpartner bekend is, zoek op de structuur naar de bindingspeptiden en zoek naar de bindingsplaatsen. Houd er rekening mee dat peptiden die ver in de sequentie staan, samen kunnen zijn in de tertiaire structuur en een bindingsplaats kunnen creëren. In ons voorbeeld is still een zeer belangrijk Centro Somaal eiwit dat de normale celdeling en celproliferatie regelt en interacteert nog steeds met verschillende eiwitten via zijn intrinsiek onregelmatige regio.

Met behulp van de ontworpen peptidearray werden de still-bindingsplaatsen in de tumorsuppressor CHFR onthuld. Elke zwarte vlek in de array vertegenwoordigt een A-C-H-F-R-afgeleid peptide dat zich aan still bond, merk op dat elk peptide twee keer verschijnt omdat het in duplicaat bestaat, wat de betrouwbaarheid van de resultaten verifieert. Het peptidearray-screening onthulde zeven CHFR-afgeleide peptiden die zich aan de nog steeds intrinsiek onregelmatige regio bonden, residuen 500 tot zes 50.

Deze resultaten stelden ons in staat om de bindingsplaats van still op CHFR in kaart te brengen. Ondanks de afstand van deze zeven peptiden op de primaire CHFR-sequentie. Ze creëren een goed gedefinieerde bindingsplaats voor still in de CHFR tertiaire structuur.

Deze methode is toepasbaar voor het karakteriseren van elke eiwit-eiwit interactie. Volg deze procedure. Kwantitatieve methoden zoals fluorescentie en isotoop of ITC moeten worden gebruikt om te verifiëren, om de peptide-introductie te kwantificeren.