Zuiveren van de Onzuivere: Sequencing metagenomes en Metatranscriptomes van Complex-Animal geassocieerd Samples
22 december 2014
De cystic fibrosis luchtwegen als voorbeeld, het manuscript presenteert een uitgebreide workflow omvattende een combinatie van metagenomic en metatranscriptomic benaderingen van de microbiële en virale gemeenschappen in dieren door monsters te karakteriseren.
Het algemene doel van deze procedure is om complexe gastheer geassocieerde monsters te verzamelen en te verwerken, zoals sputum van cystische fibrose, om de virale en microbiële gemeenschappen te bestuderen met behulp van metagenomische en metatranscriptomische benaderingen. Dit wordt bereikt door het onderwerp eerst 7% hypertone zoutoplossing te laten inhaleren via een vernevelaar en vervolgens gedurende een periode van 30 minuten geïnduceerde sputummonsters te verzamelen. Vervolgens wordt het monster onmiddellijk gehomogeniseerd en gelijk verdeeld in vier buizen gelabeld als virologisch metagenoom, microbieel metagenoom, metatranscriptoom en extra sputum.
Vervolgens wordt de metatranscriptoombuis afgesloten, horizontaal geplaatst en het sputum gedurende 10 minuten op medium snelheid gehomogeniseerd. Ten slotte worden afzonderlijke aliquoten afzonderlijk verwerkt om virale of bacteriële cellen te isoleren en zuiveren vóór de isolatie van nucleïnezuur voor metagenomische studies. Uiteindelijk worden de geïsoleerde nucleïnezuren gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek voor hoogdoorvoer sequencing om metagenomische en metatranscriptomische bibliotheken te genereren.
Het grote voordeel van deze procedure is dat het een uitgebreide workflow biedt om complexe gastheer geassocieerde monsters te verwerken voor het bestuderen van virale en bacteriële gemeenschappen op DNA- en RNA-niveau. Visuele demonstratie van deze procedure is cruciaal, aangezien de voorbehandelingsstappen van het monster belangrijk zijn om een goede behandeling van het monster te garanderen, terwijl de stappen voor zuivering van virale en microbiële cellen moeilijk te leren zijn vanwege de complexiteit van de procedure. Vóór de monsterverzameling moeten vier 15 milliliterbuizen per monster worden gelabeld met het volgende: de eerste met virologisch metagenoom, de tweede als microbieel metagenoom, de derde met metatranscriptoom en buis nummer vier als extra sputum. Voeg twee milliliter 0,1 millimeter silicabeadjes toe aan de buis gelabeld met metatranscriptoom, gevolgd door zes milliliter GITC-RNA-lysebuffer op basis van guanidine-isothiocyaanzuur of GITC-lysebuffer.
Volg de in de tekstprotocol beschreven monsterverzamelprocedure en gebruik voorwade monsterbekers. Schat het monstervolume door de beker na de monsterverzameling te wegen en trek het gewicht van de lege beker af. Voor het resterende gewicht is één gram gelijk aan één milliliter monster. Als het volume van het monster minder is dan acht milliliter, voeg dan het juiste volume van 0,02 micrometer gefilterde eenmalige XPBS toe om het eindvolume op acht milliliter te brengen.
Gebruik vervolgens onmiddellijk een drie milliliter spuit om het monster te homogeniseren totdat er geen zichtbare klontjes meer in het sputum aanwezig zijn. Gebruik dezelfde spuit om onmiddellijk twee milliliter sputum op te trekken en dit in de microtranscriptoombuis te injecteren die silicabeadjes en GITC-lysebuffer bevat. Sluit het deksel en gebruik parafilm om het deksel stevig te verzegelen. Gebruik een vortex om het sputum onmiddellijk gedurende 10 minuten op medium snelheid te homogeniseren om lekkage te voorkomen. Gebruik dezelfde spuit om elk twee milliliter sputum in de buizen te doseren die zijn gelabeld met viraal metagenoom en microbieel metagenoom, en breng het resterende sputum van de sputumbeker over in de buis gelabeld met extra sputum.
Bewaar alle buizen bij vier graden Celsius of op ijs en vervoer ze indien nodig naar het laboratorium om een virologisch metagenoom te genereren. Na de bereiding van buffers en oplossingen. Behandel de monsters door 0,02 micrometer gefilterd magnesiumzoutoplossing toe te voegen tot een totaal volume van zes milliliter.
Om de oplossing van slijm te bevorderen, voegt u zes milliliter 6,5 millimolair DTT toe aan elk monster. Vortex krachtig om te mengen en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Na het krachtig voortbewegen van de monsters, centrifugeert u opnieuw bij 3056 Gs en 10 graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten.
Verzamel elk supernatant in een nieuwe 15 milliliterbuis. Gebruik vervolgens een punt 45 micrometer filter gemonteerd op een spuit om de supernatanten in nieuwe 15 milliliterbuizen te filteren. Verwijder 100 microliter monster in een microfugebuis en voer vervolgens chloroformbehandeling uit.
Extraheer het supernatant en voer DN een behandeling uit. Voeg een gelijk volume van 4% paraformaldehyde toe om het monster te fixeren. Raadpleeg voor epifluorescentiemicroscopie het tekstprotocol voor een catch-all virale deeltjes verrijkingsaanpak.
Gebruik anders vers bereide cesiumchlorideoplossingen om een cesiumchloridegradiënt op te zetten door een milliliter 1,7 gram per milliliter cesiumchlorideoplossing in elke buis te laden, gevolgd door een milliliter 1,5 gram per milliliter, een milliliter 1,35 gram per milliliter en ten slotte een milliliter 1,2 gram per milliliter cesiumchlorideoplossing. Laad vervolgens zes tot acht milliliter monster in afzonderlijke gradiëntbuizen. Markeer afzonderlijke lagen om de locatie van elke fractie aan te geven.
Breng vervolgens elk tegenoverliggend paar van twee binnen één milligram in balans. Vergrendel elke buis voorzichtig in de draaibak. Laad op de rotor en centrifugeer bij 82.844 Gs en vier graden Celsius gedurende twee uur.
Na centrifugatie verwijdert u de buizen voorzichtig uit de houder zonder de dichtheidsgradiënten te verstoren met een 18 gauge naald die is bevestigd aan een drie milliliter spuit. Zorg ervoor dat de open kant van de naald naar boven wijst. Prik de buis net onder de dichtheidslaag van 1,5 gram per milliliter en trek langzaam ongeveer 1,5 milliliter oplossing in de spuit.
Verwijder langzaam de naald en laat de resterende fractie in de buis druppelen in een nieuwe 15 milliliterbuis door de punctie. Label dit als bovenste fractie. Breng de oplossing in de spuit met de V ps over in twee nieuwe microfugebuizen. Zodra de buffers en oplossingen zijn bereid, voegt u volgens het tekstprotocol vijf volumes van 0,22 micrometer gefilterde eenmalige XPBS toe om elk homogenaat te verdunnen onder een chemische kap. Voeg bèta-MAR-capta-ethanol toe tot een eindconcentratie van 2% volume op volume en schud het mengsel
Overzicht
Deze studie presenteert een uitgebreide workflow voor het karakteriseren van microbiële en virale gemeenschappen in luchtwegmonsters van patiënten met cystische fibrose middels metagenomische en metatranscriptomische benaderingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Virologie
- Genomica
Achtergrond
- Cystische fibrose wordt geassocieerd met complexe microbiële gemeenschappen.
- Inzicht in deze gemeenschappen kan inzicht verschaffen in ziekte mechanismen.
- Metagenomische en metatranscriptomische technieken zijn essentieel voor het bestuderen van deze gemeenschappen.
- De monsterverwerking is cruciaal voor een nauwkeurige analyse.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een workflow voor het verwerken van complexe gastheer-geassocieerde monsters.
- Het bestuderen van virale en microbiële gemeenschappen op DNA- en RNA-niveau.
- Het verbeteren van het begrip van de interacties binnen deze gemeenschappen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van sputummonsters van patiënten met cystic fibrosis.
- Homogenisatie en verdeling van monsters in specifieke buisjes.
- Isolatie en zuivering van virale en bacteriële cellen.
- Voorbereiding van high-throughput sequencing bibliotheken voor metagenomische studies.
Belangrijkste resultaten
- Er is een uitgebreide workflow opgezet voor de monsterverwerking.
- Succesvolle isolatie van nucleïnezuren voor sequencing.
- Er zijn inzichten verkregen in de samenstelling van microbiële en virale gemeenschappen.
- De methode bleek effectief bij het verwerken van complexe monsters.
Conclusies
- De ontwikkelde workflow is essentieel voor het bestuderen van gemeenschappen die gerelateerd zijn aan cystische fibrose.
- Een juiste monsterbehandeling is van vitaal belang voor nauwkeurige resultaten.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere complexe biologische monsters.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
High-throughput sequencing van metagenomen en metatranscriptomen uit complexe, met dieren geassocieerde monsters maakt een uitgebreide profilering van microbiële en virale gemeenschappen mogelijk, zelfs in uitdagende matrices zoals sputum van patiënten met cystische fibrose. Deze workflow verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij de karakterisering van het microbioom en ondersteunt een robuuste validatie van targets voor studies naar gastheer-microbe interacties. De aanpak is strategisch gepositioneerd om vroege ontdekkingen en translationele onderzoekspijplijnen te informeren door menselijke DNA-contaminatie te minimaliseren en de getrouwheid van het microbiële signaal te maximaliseren.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt functionele en taxonomische profilering van microbiële en virale gemeenschappen in ziekte-relevante monsters mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door echte microbiële signalen te onderscheiden van contaminanten van gastheer- en extracellulair DNA.
- Faciliteert hypothese-gestuurd onderzoek naar gastheer-microbe interacties voor targetvalidatie.
- Verbetert de triage van portfolio's door het leveren van betrouwbare gegevens over de samenstelling van de gemeenschap.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gevalideerde nucleïnezuurpreparaten die geschikt zijn voor downstream sequencing en kwantitatieve analyse.
- Standaardiseert de monsterverwerking om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies te waarborgen.
- Maakt robuuste assay-ontwikkeling mogelijk door storend menselijk DNA te minimaliseren en het herstel van microbieel RNA te maximaliseren.
- Bereidt monsters voor op schaalbare high-throughput screening van verschuivingen in microbiële gemeenschappen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt metagenomische en metatranscriptomische resultaten uit met ziekterelateerde biomarkers bij cystische fibrose en soortgelijke indicaties.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale microbiome-profilering mogelijk te maken.
- Levert kwantitatieve gegevens om risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in translationele pijplijnen te onderbouwen.
- Verbetert voorspellende risicoreductie door de stabiliteit van de microbiële gemeenschap en de respons op interventies te valideren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow integreert op het snijvlak van vroege ontdekking en translationeel onderzoek, waardoor een naadloze overgang mogelijk wordt van monstername naar community-profilering met een hoge betrouwbaarheid en de ontdekking van biomarkers.
- Discovery Biology: Ondersteunt rigoureuze hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in gastheer-microbe-studies.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve nucleïnezuuroutputs voor assay-gereedheid en comparatieve analytics.
- Analytics: Levert hoogwaardige sequentiedata voor robuuste statistische analyse van de structuur van microbiële en virale gemeenschappen.
- Translationeel Onderzoek: Maakt longitudinale en cross-sectionele biomarker-afstemming mogelijk in ziekte-relevante systemen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerde, herbruikbare workflow voor complexe monstertypes over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in microbiome-onderzoek.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare monsterverwerking voor complexe matrices.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het leveren van betrouwbare gemeenschapsprofielen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van microbiome-gerichte programma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, microbiologie en high-throughput sequencing-workflows.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor nucleïnezurextractie en de bereiding van sequencing-bibliotheken.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Moet worden aangepast voor verschillende monstertypes en matrices op basis van contaminatieprofielen.
- Zorgvuldige behandeling en biosafety-protocollen zijn essentieel vanwege mogelijke blootstelling aan pathogenen.
