Name: Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer live-beeldvorming van het Drosophila-puppenoog voor neuro-epitheliale ontwikkeling. Deze methode stabiliseert levend weefsel en visualiseert celgrenzen met GFP-gelabelde eiwitten voor gedetailleerd onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken David Larson voor het ontwikkelen van het oorspronkelijke protocol voor het beeldvormen van het levende Drosophila popogen. We danken onze collega's Richard Carthew, Shoichiro Tsukita en Matthew Freeman, die de transgene vliegen ontwikkelden die we combineerden om onze vliegenlijnen voor live-beeldvorming te genereren. Brittany Baldwin-Hunter gaf nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door startfondsen toegekend aan Ruth Johnson door Wesleyan University.

Figuur 3 toont een overzicht van de experimentele procedure. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Om de gevolgen van gewijzigde expressie van een gen van interesse, het opzetten van de volgende kruis in tweevoud te bepalen en bij 25 ° C te houden: UAS-transgen (mannetjes) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (maagdelijke vrouwtjes) OPMERKING: Om de controle weefselkruisreactiviteit UAS-lacZ- verkrijgen mannetjes aan GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP vrouwtjes. β-galactosidase produceert geen defecten in cel gedrag in de retina. </li><li> Om de effectiviteit van RNAi transgenen verbeteren, kruis UAS-RNAi mannetjes aan GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b maagdelijke vrouwtjes. OPMERKING: Incidenteel defecten in cel gedrag retina ectopische expressie Dcr-2 waargenomen (gegevens niet getoond). Waakzaamheid is aan te bevelen bij gebruik van deze aanpak. </li><li> Select witte pre-poppen van geschikte genotypen en plaats in 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Als de poppen te uiten DCR-2 selecteert u mannelijk of vrouwelijk poppen: uitdrukking van UAS-DCR-2, een insert op het X-chromosoom, is sterker bij mannen. Poppen worden gesekst op 0 uur APF voor pigmentatie van het popstadium - de gonaden van mannetjes zichtbaar grote doorschijnende bollen aan de zijkanten van de pop (ongeveer een derde van de posterior). </li><li> Incubeer microcentrifugebuisjes met poppen, in een schone plastic tip-doos bij 25 ° C. Om uitdroging te voorkomen van poppen plaats een 10 cm 2 stukje weefsel, gedrenkt in gedestilleerd water, in de punt-doos. OPMERKING: als de luchtvochtigheid in de punt-doos te hoog wordt het popstadium geval kan drassig en moeilijk te ontleden in de volgende stappen te worden. </li><li> Incubeer gedurende juiste moment. Naar cel gedrag geassocieerd met patroonvorming het oog vast te leggen, poppen voor de beeldvorming te bereiden op rond 17 uur APF, 20 uur APF of 24 hr APF. Zie Representatieve resultaten voor verdere discussie over wanneer specifieke cel gedrag het best worden waargenomen. </li><li> Leg een stuk verse dubbelzijdige tape op een zwarte Sylgard dissectie schotel. Plaats een pop, dorsale zijde naar boven, met het hoofd van de pop gehandeld op grond van de dubbelzijdige tape (figuur 1A) .Probeer niet aan de thoracale en abdominale regio&#39;s van de pop houden aan de dubbelzijdige tape. Met een pincet voorzichtig op te tillen en verwijder de operculum de pupal hoofd bloot. Scheur langs de kant van de pupal zaak naar het gebied rond één oog bloot. </li><li> Verwijder voorzichtig de pop van het plakband. Als de pop blijft aanhanger, breng een kleine hoeveelheid gedestilleerd water tot aan de kruising tussen de pupal zaak en tape om de hechting te verzwakken. </li></ol> 2. Montage <ol><li> Teken een kleine 15 mm2 lijst van vloeipapier en slaat een gat in de middlethat 5,5 mm in diameter (figuur 1B). Onderdompelen in gedestilleerd water en plaats inhet centrum van een microscoopglaasje. Met behulp van een 30 cc spuit, knijp erin om een ​​uniforme ring vaseline aan het vloeipapier kader omringen. Zorg ervoor dat de vaseline ring marginaal hoger is dan de breedte van de pop en dat de diameter van de ring fractie kleiner is dan de breedte van een dekglas. </li><li> Voeg een kleine kraal van vaseline direct op de glijbaan, in het gat geslagen in het vloeipapier (figuur 1C) .Carefully regelen de pop, op zijn kant, ondersteund door de vaseline kraal (figuur 1D). </li><li> Plaats een dekglaasje bovenop de vaseline ring zodat deze de epitheel boven het oog neuroepithelium (figuur 1D). Zachtjes te comprimeren de voorbereiding op het dekglaasje tegen de vaseline verzegelen en het genereren van een kleine platte contactoppervlak tussen de pupal oog regio en het dekglaasje. </li></ol> 3. Fluorescentie Imaging <ol><li> Afbeelding de pupal voorbereiding met behulp van eenfluorescentiemicroscoop. Elke 7 min capture seriecoupes door het apicale gebied van het oog neuro-epitheel, in het gebied van de contactplaatsen. LET OP: a) Passende seriecoupes zijn meestal 4-5 per z-stack bestaat uit 0,2 micrometer z-stappen. b) Onregelmatigheden in de topologie van het epitheel, waaronder lichte stoten en vouwen, kan het een uitdaging om in-focus afbeeldingen van grote weefselgebieden te verkrijgen. Terwijl de beeldvorming, kan een deel van een gebied van belang te vinden te zijn in-focus, en een naburige regio om out-of-focus. Inclusief een kleine druppel gedestilleerd water tussen het popstadium oog en dekglaasje kan een aantal acute weefsel plooien maar niet weg licht ongelijke topologie kenmerk van de vroege stadia van popstadium oog morfogenese. In deze gevallen oversample het weefsel door de uitbreiding van de z-stack tot in-focus plakjes worden verworven voor het gehele gebied. c) Het vastleggen seriecoupes elke 7 min moet levend-imaging voor 3 tot 4 uur mogelijk te maken zonder een significante reductie in de intensiteit van GFP fluorescentie dat de beeldkwaliteit in gevaar kan brengen. Kortere intervallen kan de totale tijd van de beeldvorming te verminderen. </li><li> Verder beeldvorming voor 3 tot 4 uur. Heeft een automatische scherpstelling en tijdfunctie die op veel fluorescerende microscopen niet gebruiken omdat popstadium groei en pompen van de hemolymfe verplaatst de positie van het netvlies en waakzaam heroriëntatie nodig elke 14-21 min. NOTA VAN dat beeldvorming dan 4 uur kan vertragen of kraam morfogenese van het oog. </li><li> Gebruik geschikte deconvolutie software om de achtergrond te verminderen en het contrast van de seriële sectie afbeeldingen. Voor elke z-stack-bestand, voert u de volgende in LAS AF software (zie tabel van Materialen): Ga naar het deelvenster Gereedschappen, selecteert u 3D Deconvolutie en klik op Toepassen. </li><li> Genereer afbeelding een maximale uitval (MP) voor elke deconvoluted stack bestand: Navigeer naar het deelvenster Gereedschappen, selecteer 3D-projectie en klik op Toepassen. Opmerking: De maximale projectie algoritme kan niet aan een uniform te genererenafbeelding ly in-focus voor weefsel dat is overbemonsterde. Een techniek voor het slijpen van out-of-focus regio&#39;s wordt beschreven in stap 5.2. </li></ol> 4. Post-beeldvorming Pupal Rescue en Fenotype Verification <ol><li> Aan te pakken of artefacten werden ingevoerd of de pop geschaad tijdens de beeldvorming, verwijder voorzichtig de pop uit de beeldvorming rig: met behulp van een tang verwijder het dekglaasje en breng de pop aan een schoon flesje van voedsel. Bewaren bij kamertemperatuur of 25 ° C, totdat de volwassen vlieg tevoorschijn. </li><li> Zorgvuldig onderzoeken het fenotype van de volwassen oog en te vergelijken met de ogen van volwassen vliegen die uit de oorspronkelijke vlieg kruis. </li></ol> 5. Beeldverwerking <ol><li> Automatic Image Alignment: OPMERKING: De live Drosophila weefsel zal verschuiven en te groeien in de hele beeldvorming proces. Bijgevolg centra afbeeldingen verzamelden op opeenvolgende tijdstippen mogelijk niet overeen met hetzelfde punt in de Drosophila weefsel. Ook degehele netvlies roteert ongeveer 30 ° tussen ~ 21 en 23 uur APF. Om individuele cel gedrag te benadrukken en afleiding veroorzaakt door organismaal groei te verminderen, uitlijnen elk MP image.While dit kan handmatig worden uitgevoerd, de beeldbewerkingssoftware hier gebruikt (zie tabel van Materialen) heeft ingebouwde algoritmen die het proces kunnen versnellen. <ol><li> Vanaf het tabblad Bestand van het hoofdmenu geopend Scripts en selecteer Bestanden laden naar stapel. </li><li> Importeer de MP-beeldbestanden in het paneel Load Lagen en selecteer OK. Zorg ervoor dat de poging om Bronafbeeldingen optie automatisch uit te lijnen niet is geselecteerd. OPMERKING: Als deze optie is geselecteerd, kan de software een uitlijningsalgoritme dat de beeldgegevens vervormt gebruiken. </li><li> Zodra alle MP-bestanden in het deelvenster Lagen hebt geladen, zorg ervoor dat alle beelden zijn in chronologische volgorde, zodanig dat het vroegste tijdstip is aan de bovenkant van de laag stack. Als de lagen zijn niet in de juiste volgorde, slepen en neerzetten, totdat ze worden besteldcorrect. </li><li> Kies Lagen automatisch uitlijnen van het tabblad Bewerken van het hoofdmenu. Kies herpositioneren en klik op OK. </li><li> Als de Auto-Align algoritme niet in slaagt de frames oriënteren op een relevante brandpunt, kleine aanpassingen met behulp van het gereedschap Verplaatsen. </li></ol></li><li> Composiet Slijpen: OPMERKING: Out-of-focus gebieden van een afbeelding initiële MP kunnen geslepen worden door &quot;gewassen&quot; de overeenkomstige deconvoluted stack in LAS AF software. Bijsnijden een stapel bestand kan men het interval van een z-stack die wordt onderworpen aan de maximale projectie algoritme handmatig beperken. <ol><li> Zoek de Crop functie in het deelvenster Gereedschappen (onder het tabblad Proces). Handmatig beperken de eerste en laatste plakjes zodanig dat ze overspannen alleen de hechting riem binnen de aanvankelijk out-of-focus regio. Apply een nieuwe stapel bestand dat is geoptimaliseerd voor deze streek genereren. </li><li> Genereer een nieuwe maximale uitval voor de lokaal geoptimaliseerd stack en export als een TIFF-bestand. </li><li> In the beeldbewerkingssoftware (zie tabel van Materialen), open Scripts (gelegen in het tabblad Bestand van het hoofdmenu) en selecteer Bestanden laden naar stapel. </li><li> Importeer de eerste afbeelding MP-bestand en lokaal geoptimaliseerd MP-bestand voor een bepaald tijdstip in het paneel Load Lagen en selecteer OK. Zorg ervoor dat de poging om Bronafbeeldingen optie automatisch uit te lijnen niet is geselecteerd. </li><li> Selecteer beide lagen in het Lagen deelvenster en kies vervolgens Lagen automatisch overvloeien (gelegen in het tabblad Bewerken van het hoofdmenu) naar de juiste regio&#39;s van de twee beelden automatisch te maskeren, waardoor een gelijkmatig in-focussen retinale veld. Sla deze afbeelding composiet als TIFF-bestand. </li><li> Herhaal de stappen 5.2.1 tot 5.2.5 voor alle suboptimale MP beelden. </li></ol></li><li> Verdere aanpassingen: draaien, bijsnijden en aanpassen van de niveaus van de Movie Lagen: <ol><li> Met alle lagen geselecteerd, gebruikt u de tool Transform (Bewerken&gt; Vrije transformatie) om de afbeeldingen te roteren zodat de dorsale-ventrale as van het netvlies is uitgelijndde y-as van het filmbeeld. </li><li> Indien nodig, gebruik maken van de Crop tool om het gezichtsveld te reduceren tot een gewenste grootte en vorm. </li><li> Gebruik niveau-aanpassing (van de afzonderlijke frames) ter verbetering van het contrast tussen de celmembraan en de cel lichaam. </li><li> Voor stilistische doeleinden en om specifieke cel gedrag te benadrukken, introduceren valse kleur aan bezienswaardigheden in elk frame te markeren. </li></ol></li><li> Animatie: Zet de afbeeldingen in een film: <ol><li> Open het deelvenster Animatie van het tabblad Windows van het hoofdmenu. Selecteer Maak Frames van Lagen van het menu in de rechterbovenhoek van het deelvenster Animatie. </li><li> Merk op dat de lagen worden toegevoegd in het animatie in volgorde beginnend vanaf de bodem van de stapel. Als u de volgorde van de frames te keren, alle frames selecteren en dan kunnen selecteren Reverse Frames van het deelvenster Animatie menu. </li><li> Selecteer een kader vertragingstijd voor elk frame met behulp van de dropdown menu onder het frame duimnagel. LET OP: Het frame vertraging Movies 1-4 in dit document is 0,8 sec. </li><li> Vanaf het tabblad Bestand van het hoofdmenu geopend Exporteren en selecteer Video renderen. Kies QuickTime Export onder Bestand op Opties en selecteer een gewenste videoformaat. Onder Render Opties instellen Frame Rate op Aangepast, voer een beeldsnelheid van 15, en klik Render. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19(1993).</li>
<li>Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li>
<li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA%2FmiRNA+silencing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li>
<li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706(2011).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li>
<li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841(2010).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112(1989).</li>
<li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li>
<li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li>
<li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De beschrijving van wild-type ontwikkeling (hierboven) vormt de basis voor vergelijkingen van patroonvorming gebeurtenissen in RNAi of overexpressie genotypen. Vergelijkingen van live-ontwikkeling weefsel zijn van onschatbare waarde bij het nauwkeurig bepalen welke cel gedrag wordt gereguleerd door een eiwit van belang. Verder, en niet hier beschreven, live cell imaging maakt het mogelijk om kwalitatieve en / of kwantitatieve beschrijving van de functie van een gen van interesse maken de gebeurtenissen die patroon het o...

De verbinding Drosophila oog wordt gekenmerkt door de stereotiepe opstelling van de ~ 750 ommatidia gescheiden door een honingraat-rooster accessoire pigmentcellen 4,5. Deze pigment cellen worden gevormd door een gecoördineerde combinatie van gebeurtenissen: de lokale cel bewegingen, celgroei, veranderingen in cel vorm, en apoptose. Live-weergave van deze epitheel maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze gebeurtenissen in een fysiologisch relevante en onverstoord driedimensionale context te bestuderen. In tegenstelling tot eerdere protocollen 6,7, de techniek geschetste bevat een efficiënte methode voor het stabiliseren van vreemde weefsels beweging die niet losgekoppeld van het belichtingsproces kan worden. Deze werkwijze verhoogt studies cel gedrag in de ontwikkeling Drosophila popstadium oog epitheel - een weefsel dat groeit, roteert en verplaatst de loop van beeldvorming. Naast de motion-stabilisatietechniek dehier beschreven zal nuttig zijn voor het bestuderen van cellen in andere contexten waarin vreemde beweging optreedt. Om celgrenzen visualiseren het netvlies gebied Drosophila, werden transgene vliegen lijnen gegenereerd die expressie Ubi-DE-Cadherin: GFP en UAS-α-catenine: GFP onder controle van de oog-specifieke driver GMR-GAL4 1-3. Het gebruik van twee GFP-gelabeld membraan markers maakt de visualisatie van celgrenzen lagere lichtintensiteit. Dit minimaliseert weefselschade en fotobleking bij herhaalde blootstelling aan hoge-energie-golflengtes, waardoor hogere framerate en film duur. Om de effectiviteit van RNAi transgenen, UAS-DCR-2 werd ook verwerkt in een tweede vlieg lijn 8 te verbeteren. In een derde update eerdere protocollen wordt een eenvoudiger beeldvormend toestel dat gemakkelijk wordt gemonteerd in de meeste laboratoria beschreven. Dit apparaat voorkomt de eis om een ​​gespecialiseerde beeldvorming r hebbenig gegenereerd door een universiteit &#39;werkplaats&#39; of een soortgelijke dienst. Deze beeldvorming rig is vergelijkbaar met die gebruikt worden om het andere pupal weefsels 9,10. Hier voorgesteld is een eenvoudig live cell imaging protocol dat kan worden gebruikt om het morfogenetische gebeurtenissen die bijdragen aan oog patroonvorming van ~ 17-42 uur na verpopping formatie (hr APF) direct beoordelen. Specifiek, dit protocol laat toe de gevolgen van het modificeren genexpressie tijdens popstadium ontwikkeling bepalen.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Beschikbaar op verzoek bij auteurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&nbsp;</td><td>Beschikbaar op verzoek bij auteurs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte Sylgard dissectiebak</td><td></td><td></td><td>Vul glazen petrischaal tot aan de rand met Sylgard (zwart gekleurd met fijn gemalen houtskoolpoeder) of Sylgard 170; laat 24-48 uur op kamertemperatuur staan om te polymeriseren</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Zwart)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Glazen petrischaal</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm glazen microscoopglaasje</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm glazen dekglas</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Pincet&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatografiepapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Of koop bij de lokale apotheek.</td></tr><tr><td>30 ml spuit</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 microscoopsoftware</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-beeldvorming van de drosophila pupal eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherente processen van Drosophila pupal ontwikkeling kan verschuiven en vervormen het oog epitheel op manieren die individuele cel gedrag moeilijk te volgen tijdens live cell imaging maken. Deze werkwijzen omvatten: retinale rotatie celgroei en organismale beweging. Bovendien onregelmatigheden in de topologie van het epitheel, waaronder subtiele stoten en plooien vaak voorgesteld als de pop wordt voorbereid voor beeldvorming, maakt het moeilijk om in-focus afbeeldingen van meer dan enkele ommatidia verwerven één brandvlak. De workflow hier geschetste remedies deze kwesties, zodat u gemakkelijk de analyse van cellulaire processen tijdens Drosophila ontwikkeling pupal oog. Toepasselijk-gefaseerde poppen zijn opgesteld in een beeldvormend toestel dat gemakkelijk kan worden gemonteerd in de meeste laboratoria Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP en GMR-GAL4 driven UAS-α-catenine: GFP gebruikt om celgrenzen visualiseren in het oog epitheel 1 -3. Na deconvolutie istoegepast op fluorescerende beelden die zijn vastgelegd op meerdere brandpuntsvlakken, zijn maximale projectie beelden gegenereerd voor elk tijdstip en verbeterde software voor fotobewerking. Alignment algoritmen worden gebruikt om snel stabiliseren overbodige beweging, waardoor individuele cel gedrag gemakkelijker te sporen.

Live beeldvorming van het popstadium oog een succesvolle strategie cel gedragingen die bijdragen tot patroonvorming van de neuroepithelium observeren. De rol van specifieke eiwitten kunnen gemakkelijk worden beoordeeld door expressie transgenen die eiwitgehalte wijzigen tijdens de ontwikkeling oog. Om dit GMR-GAL4- doen wordt gebruikt om transgene expressie rijden achter de morfogenetische groove. Dit biedt het voordeel van niet te verstoren eerdere gebeurtenissen die het veld oog te vestigen tijdens de eerste ...

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Het algemene doel van deze procedure is om een efficiënte methode te demonstreren voor het maken van live-imagingfilms van de ontwikkeling van het oog van de drosophila-pup. Dit wordt bereikt door eerst de O-permeabiliteit van de pupale huls te verwijderen en langs de zijkant open te scheuren om het neuro-epitheel van één oog bloot te leggen. De tweede stap is het assembleren van een imaging-opstelling en het monteren van de pop op een klein bolletje vaseline.Vervolgens worden seriële doorsneden van het neuroepithelium in de regio van de adhesiegordel vastgelegd met een standaard fluorescentiemicroscoop. De laatste stap is het stabiliseren van het beeldmateriaal en het aanbrengen van kleurcorrecties in standaard software voor beeldbewerking. Uiteindelijk wordt live-cell imaging van het drosophila-neuroepithelium gebruikt om het celgedrag te ontrafelen dat ten grondslag ligt aan het patroon.De visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het gedeeltelijkly disseceren van een pop en het vervolgens correct monteren in de beeldvormingsopstelling lastig kan zijn, omdat poppen in dit stadium vrij fragiel zijn. Daarnaast zijn de juiste oriëntatie van de pop en de correct

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

In deze video, beschrijven we een methode voor het live-cell imaging van asymmetrisch te verdelen zintuig progenitor cellen en epidermale cellen in...

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

De Tomaat / GFP-FLP / FRT methode houdt in het visualiseren van mozaïek fotoreceptorcellen in levende Drosophila. Het kan worden gebruikt om individuele fotoreceptor celtypes in het netvlies te volgen gedurende dagen of weken. Deze methode is geschikt voor studies van retinale degeneratie en neurodegeneratieve ziekten of fotoreceptorcel ontwikkeling.

De Tomaat / GFP-FLP / FRT Methode voor Live Imaging van Mozaïek Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorcellen

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer live-beeldvorming van het Drosophila-puppenoog voor neuro-epitheliale ontwikkeling. Deze methode stabiliseert levend weefsel en visualiseert celgrenzen met GFP-gelabelde eiwitten voor gedetailleerd onderzoek.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Meer video's verkennen