Name: Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer hoe je liposomen met nabij-infrarode fluorescentiekleurstoffen bereidt voor hooggevoelige in vivo beeldvorming van ontstekingen. Deze methode optimaliseert detectie door efficiënte inkapseling en zuivering van de kleurstof.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft subsidies HI-698 / 10-1 en RU-1652 / 1-1. Wij danken Doreen mei voor uitstekende technische bijstand en het bedrijf DYOMICS GmbH, Jena voor hun vriendelijke steun.

OPMERKING: Alle procedures zijn goedgekeurd door de regionale dier commissie en in overeenstemming met internationale richtlijnen over de ethische gebruik van dieren. 1. Voorbereiding van de materialen en instrumenten <ol><li> Bereiding van spontaan gevormde vesicle dispersie (SFV) <ol><li> Los en worden voorraadoplossingen van de volgende fosfolipiden: 214 mg / ml ei fosfatidylcholine (EPC), 134 mg / ml cholesterol, 122 mg / ml 1,2-distearoyl- sn glycero-3-phosphoethanolamine- N - [methoxy (polyethyleen glycol) -2000] (ammoniumzout) (mPEG 2.000 -DSPE) en 2 mg / ml 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 -yl) (ammoniumzout) (NBD-DOPE) in chloroform en winkel in glazen flesjes. </li><li> Furnish ongeveer 3 ml chloroform in een rondbodemkolf en breng de juiste hoeveelheid fosfolipide stockoplossing in de rondbodemkolf liposomen samengesteld EP voorbereidenC: Chol: mPEG 2.000 -DSPE bij een molaire verhouding van 6,5: 3: 0.5. Voor dubbele fluorescentie etikettering van liposomen toe 0,3 mol% NBD-DOPE aan de lipide-oplossing. </li><li> Damp het chloroform uit de organische fosfolipide-oplossing onder verminderde druk (300 mbar) bij 55 ° C met een rotatieverdamper. </li><li> Na een homogene fosfolipide film wordt gevormd, het verminderen van de druk tot 10 mbar voor 1-2 uur om de resterende chloroform storting te verwijderen. </li><li> Terwijl de chloroform verdampt, ontbinden DY-676-COOH (6,181 uM) in 10 mM Tris buffer pH 7,4 en vul een Dewar vat met vloeibare stikstof. Schakel een ultrasoon bad en op 50 ° C. </li><li> Breng een geschikt volume (0.5-1 ml) van DY-676-COOH (6,181 uM) oplossing aan de rondbodemkolf tot de droge film fosfolipide en vortex krachtig tot een spontaan gevormd blaasje (SFV) dispersie vormen hydrateren. Zorg ervoor dat alle van de fosfolipiden zijn verspreid om lipide verlies te voorkomen. </li><li> Zorgvuldig transfer de rondbodemkolf die de SFV dispersie in vloeibare stikstof te bevriezen en de dispersie gedurende 3-5 min. Plaats de rondbodemkolf in een ultrasoon bad bij 50 ° C om de dispersie ontdooien dan vortex de dispersie krachtig gedurende 1-2 min. Herhaal dit zes keer, dus in totaal zeven vries en dooi cycli. </li></ol></li><li> Extrusie van SFV homogene liposoomvesikels vormen <ol><li> Breng de SFV dispersie in een 1 ml spuit (spuit-a) en extrusie van de dispersie door een 100 nm polycarbonaatmembraan met een LiposoFast Basic extruder in de injectiespuit-b. </li><li> Extrusie van de dispersie van de spuit-b, terug in de spuit-een, en herhaal de cyclus tien keer. Door extrusie, de oplossing in de injectiespuit verandert van een wazige verschijning aan een heldere dispersie tijd. Na tien cycli (twintig enkele extrusie stappen) op te zuigen-b van het apparaat en extrusie van de dispersie voor de laatste keer uit de spuit-a direct in een steriele1,5 ml reactie buis. </li></ol></li><li> Zuivering van liposomaal ingekapseld DY-676-COOH van vrije kleurstof <ol><li> Bereid een gel chromatografiekolom met G25 kralen gedrenkt in 10 mM Tris buffer pH 7,4 (kolomlengte 28 cm, diameter 0.8 cm). </li><li> Transfer 0,5 ml van geëxtrudeerd blaasje dispersie op de gel bed en laat het monster drain in de gel matrix. </li><li> Elueer de liposomen met 10 mM Tris buffer pH 7,4 (Figuur 1A) en spoel de kolom totdat de vrije kleurstof drains volledig uit de kolom. Indien nodig, te verzamelen en recyclen van de vrije kleurstof door ontzouten en uitdroging volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Concentreer de geëlueerde liposomen door ultracentrifugatie (200.000 xg, 2 uur bij 8 ° C) daarna dispergeren ze in voldoende hoeveelheid steriele 10 mM Tris buffer pH 7,4. </li></ol></li><li> Kwantificering van ingekapselde DY-676-COOH concentratie <ol><li> Maak een ijklijn door het oplossen van DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) in 10 mM Tris buffer, pH 7,4 die 0,1% Triton X100. </li><li> Los 2 ui (100 nmol uiteindelijke lipide van 50 mmol / l voorraad) van de liposomen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in 100 pl Tris-buffer die 1% Triton X100 de vesicles vernietigen en laat de ingekapselde kleurstof. Verdun monsters met 10 mM Tris buffer, pH 7,4 tot een uiteindelijke Triton-X100-concentratie van 0,1% (v / v) tot een totaal volume van 1 ml. Bereid alle monsters in duplo. </li><li> Meet de absorptie en emissie van alle monsters (gratis dy-676-COOH en Triton-X100 behandeld liposomen) bij een excitatie λ = 645 nm en een emissie λ = 700 nm. Opzetten en gebruik een ijkkromme van de vrije kleurstof concentratie van ingekapselde kleurstof te bepalen. </li></ol></li><li> Liposoom karakterisering <ol><li> Bepaal de grootte en de zeta potentiaal van liposomen door dynamische lichtverstrooiing. Verdun het liposomale monsters met filter gesteriliseerd (0,2 um) 10 mM Tris buffer pH 7,4 tot aconcentration van 100-300 pM (lipide). Breng de verdunde monsters in een laag volume wegwerp cuvet en volgens de instructies van de fabrikant van het meten van de sample. </li><li> Karakteriseren van de liposomen door elektronenmicroscopie de grootte, integriteit en homogeniteit van liposomaal vesicles staven volgens standaardprotocollen. </li></ol></li></ol> 2. Validatie van fluorescentie-harden en Activering van Prepared Liposomen <ol><li> Fysisch-chemische analyse van fluorescentiedoving en activering <ol><li> Bereid twee 1,5 ml buizen voor de Lip-Q en 2 buizen voor de gratis DY-676-COOH. Breng 100 nmol totale lipiden (2,38 pl van een 42 mmol / l Lip-Q voorraadoplossing, bevattende 138 ug / ml van de ingekapselde DY-676-COOH) in de overeenkomstige buizen. Transfer gratis DY-676-COOH gelijk aan de kleurstof inhoud van Lip-Q (0,38 ug wat resulteert bijvoorbeeld van 138 ug / 1000 ul x 2.38 pi Lip-Q gebruikt). Incubeer een bade van elke probe bij 4 ° C en vries de tweede buis bij -80 ° C gedurende de nacht (16 uur). </li><li> Verwarm een ​​verwarmingsblok bij 30 ° C. Vul een koelbox met ijs en equilibreren een hoeveelheid van 10 mM Tris buffer pH 7,4 bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de probes uit 4 ° C en equilibreren bij kamertemperatuur (verpakt in aluminiumfolie bescherming tegen licht) snel ontdooien probes van -80 ° C bij 30 ° C gedurende 5 min. Chill de ontdooide sondes op ijs gedurende 1 minuut voor het overzetten naar kamertemperatuur (ook gewikkeld in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht). </li><li> Voeg 10 mM Tris buffer (pH 7,4) aan elk van de probes tot 100 ui eindvolume en equilibreren alle probes bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Pipetteer 80 pi van elke sonde in een laag volume glazen cuvet en meet de absorptie van elke sonde 400-900 nm op een spectrometer. Zet de probe hun overeenkomstige buizen. </li><li> Breng 80 ul van elke probe in een geschikte glazen cuveten meet het fluorescentie-emissie op een spectrofluorometer prikkelen de probes bij 674 nm en meting van de fluorescentie 694-800 nm. </li></ol></li><li> Cellulaire opname en fluorescentie activering <ol><li> Verkrijg en cultuur de volgende cellijnen in hun corresponderende kweekmedia volgens standaardomstandigheden (37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtige atmosfeer). Hier gebruikt de murine macrofaag cellijn J774A.1 (Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal kalfsserum), de humane glioblastoma cellijn, U-118 mg (MEM met essentiële vitaminen en 10% (v / v) foetaal kalf serum) en het menselijk fibrosarcoma cellijn, HT-1080 (RPMI met 5% FCS). </li><li> Coat 8 putjes kamer objectglaasjes met poly-L-lysine (voeg 100 ul 0,001% poly-L-lysine aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. Zuig oplossing en laat de kamer objectglaasjes drogen tenminste 4 uur bij RT op een steriele werkbank. de kamer slides Spoel 3keer met 200 ul Hank&#39;s gebufferde zoutoplossing vervolgens verzegeld met paraffine en aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C tot nodig. </li><li> Terwijl de kamer glaasjes drogen, filter-steriliseer de liposomen en kleurstofoplossing en bewaar bij 4 ° C tot nodig. </li><li> Voor opname probe analyse met het hele lichaam in vivo NIR fluorescentie imaging systeem, bereid 5 kleine kolven voor elk van de 3 proef cellijnen (15 kolven in totaal). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg en HT-1080 cellen per kolf met 5 ml van de respectievelijke kweekmedium (in quintuples) en kweken gedurende 16-24 uur. Parallel aan de cultuur flacons, respectievelijk zaad 30.000 cellen van elke cellijn (J774A.1 en HT-1080) of 20.000 cellen (U-118 mg) tot 2 putjes van de kamer glijbaan en groeien in 500 ul kweekmedium voor 16-24 uur . </li><li> Op de volgende dag, voeg 100 nmol (uiteindelijke lipide hoeveelheid) van Lip-Q tot 2 flesjes per cellijn en een goed van elke cellijn op de kamer dia.Onmiddellijk overdracht 1 kolf per cellijn tot 4 ° C en de tweede kolf terug naar de incubator. Opmerking: Het volume van de probes aan de kolven toegevoegd en de kamer glijbanen zijn hetzelfde, waardoor de concentratie op kamer objectglaasjes 10-voudig hoger (5 ml wordt 500 pl cultuurmedium). Dit is noodzakelijk omdat microscopische detectie minder gevoelig zijn dan de NIR fluorescentie imaging systeem waarin celpellets uit de kolven worden afgebeeld. </li><li> Voeg de gratis DY-676-COOH in een concentratie gelijk aan de kleurstof inhoud van Lip-Q aan de cellen in 2 flesjes per cellijn en een goed van elke cellijn op de kamer dia, dan meteen overdragen 1 fles per cellijn tot 4 ° C (energiedepletie) en de andere kolf met de kamer schuif terug naar de incubator. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij de desbetreffende omstandigheden. De cellen in de kolf zonder probe dienen als onbehandelde controle. </li></ol></li><li> NIRF beeldvorming en semi-kwantitatieve analyse <ol><li> Na 24 uur incubatie tijd, oogst de cellen in kolven door wassen cellen 2x met Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) en vervolgens schrapen cellen in 500 pi HBSS en pellet door centrifugeren (5 min bij 200 xg) in 500 pl buizen. </li><li> Plaats de buizen met de cel pellets (en HBSS) in een NIRF imager en beeld met behulp van filters voor excitatie (615-665 nm) en emissie (knippen in&gt; 700 nm). </li><li> Aftrekken autofluorescentie en de intensiteit van de doelgroep te evalueren versus autofluorescence volgens de instructies van de fabrikant. Hierdoor wordt de semi-kwantitatieve niveaus van fluorescentie-intensiteit als gemiddeld signaal (geschaald tellingen / sec), die meetellen zichten betekent na schaling belichtingstijd, camera gain, binning en bitdiepte, zodat de metingen vergelijkbaar onderling geven. </li></ol></li><li> Confocale microscopie <ol><li> Na 24 uur incubatie, de oogst van de cellen op de kamer dia&#39;s door het wassen van 2 maal met 500 pi HBSS. </li><li> Bevestig de cells 200 pi HBSS dat 3,7% (v / v) formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl de fixatie aan de hand is, verdunnen het DNA vlek, Hoechst-33258 01:50 met montage-oplossing. </li><li> Na fixatie, was de cellen 2 keer met HBSS dan scheiden de kamers van de glasplaatjes. Voeg 50 ul montage oplossing die het DNA-vlek op elke plek overeenkomt met de putjes van de kamer dia. Bedek de cellen met dekglaasjes, verzegelen randen met transparante nagellak en drogen aan de lucht gedurende 10 min bij kamertemperatuur (donker). </li><li> Afbeelding cellen op een geschikte fluorescentie microscoop of confocale microscoop. Gebruik de volgende excitatie en emissie instellingen voor visualisatie van de overeenkomstige componenten: kernen (Hoechst-33258: excitatie 405 nm, emissie 420-480 nm). NBD-DOPE (liposoomlipide: excitatie 488 nm, emissie 530 nm). DY-676-COOH (NIR fluorescente kleurstof: excitatie 633-645 nm, emissie 650-700 nm). OPMERKING: Zorg ervoor dat de fluorescentie microscoop eenvailable is uitgerust met geschikte filters die excitatie en emissie golflengtes groter dan 630 nm mogelijk. </li></ol></li></ol> 3. liposoom-gebaseerde In vivo fluorescentie beeldvorming van Ontsteking <ol><li> Voorbereiding van de dieren en materialen <ol><li> Huis 8-12 weken oude mannelijke NMRI muizen met een gewicht van ongeveer 36 g onder standaard omstandigheden met voedsel en water ad libitum. </li><li> Zeven dagen voor de start van de experimenten geven alle muizen een lage feoforbide dieet om weefsel autofluorescentie te verminderen. </li><li> Vierentwintig uur voorafgaand aan elk experiment scheren muizen het gewenste bereik (bijvoorbeeld hele rug gebied indien beeldvorming van achterpoot oedeem gewenst). </li><li> Weeg de dieren en het berekenen van de hoeveelheid probe kg gewicht en gratis DY-676-COOH (gelijk aan worden geïnjecteerd per muis (Lip-Q en Lip-dQ bij 10 umol (lipide concentratie) per inhoud van Lip-Q gebruikte kleurstof) . </li><li> Afbeelding van de dieren ineen hele lichaam NIR fluorescentie imager met dezelfde instellingen gebruikt voor de cel pellets. Deze meting geeft autofluorescentie van de dieren. </li><li> Los 10 mg zymosan-A in 1 ml isotone zoutoplossing en bewaar overnacht bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Inductie van ontsteking en in vivo beeldvorming NIRF <ol><li> Bereid 3 spuiten per muis met de volgende oplossingen. Vul een spuit met 50 ul zymosan-A oplossing (10 mg / ml) en de tweede spuit met 50 ul fysiologische zoutoplossing. Vul de derde spuit met de sondes, waarbij Lip-Q en Lip-dQ (10 umol / kg gewicht (lipiden)) zijn aangewezen voor proefdieren en gratis DY-676-COOH (concentratie als in Lip-Q) voor de controle dieren. Controleer de probes verdund met steriele HBSS 150 pl eindvolume. </li><li> Solliciteer oogcrème op de ogen van de dieren tot droog te vermijden en verdoven van dieren met 2% isofluraan tot ze diep in slaap en reageren niet bij aanraking op de poten (Dit duurt ongeveer 2 min). </li><li> Plaats de muis op een warme mat (nog onder narcose) en injecteer de zymosan-A oplossing subcutaan op de rechter achterpoot en de zoutoplossing op de linker achterpoot. Onmiddellijk injecteer de sonde intraveneus en het imago van het dier daarna vervolgens recordtijd van injectie / meting (als t = 0 uur). Sla de resulterende beelden zoals kubussen en herhaal de bovenstaande stappen voor alle andere dieren en de respectieve sondes. </li><li> Afbeelding van de dieren om de 2 uur voor 10 uur na injectie en vervolgens 24 uur na de injectie, en zorg ervoor dat het stadium van de meetkamer is warm (bijvoorbeeld door het plaatsen van een warme mat eronder), om onderkoeling te voorkomen. Na elke meting, plaats de dieren in een kooi met voedsel en water ad libitum en plaats de kooi in een gematigd dier kamer. Euthanaseren van de dieren door de eerste verlamming met 2% isofluraan tot de dieren niet meer reageren op raken, dan euthanaseren met koolstofdioxide voor 5-10 min, waardoorzorgen dat de dieren volledig te stoppen met ademhalen en rigor mortis optreedt. </li><li> Ontleden de muizen volgens standaardprotocollen die online kan worden beoordeeld (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) en het beeld van de organen. </li><li> Evalueren van de meetresultaten volgens de instructies van de fabrikant door eerst aftrek van de totale fluorescentie van de dieren (ontmenging) dan het toewijzen van gebieden van belang voor autofluorescentie (linker achterpoot met zout) en target fluorescentie van ontstoken gebied (rechter achterpoot met zymosan-A). </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aangezien liposomen ook kan dienen als afgiftesystemen voor fluorescente kleurstoffen, zij stellen beeldvorming van doelziekten. Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals NIRF kleurstof, DY676-COOH hier gebruikt, leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving van de ingesloten kleurstof. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentratie kan in verschillende in vivo beeldvormende toepassingen, waarbij een hoge gevoeligheid en betrouwbare det...

Liposomen zijn intensief onderzocht en dienen als een van de meest biocompatibele biomedische geneesmiddelafgiftesystemen voor klinische toepassingen 1,2. Zij bestaan ​​hoofdzakelijk uit fosfolipiden en cholesterol, die beide biocompatibele verbindingen nabootsen delen van natuurlijke celmembranen. Overwegende dat hydrofiele stoffen kunnen worden ingesloten in de waterige interieur, kan lipofiele agenten binnen het liposomaal fosfolipidedubbellaag 3 worden opgenomen. Inkapseling van stoffen in het waterige inwendige van liposomen bescherming biedt tegen afbraak in vivo en voorkomt ook het hostsysteem van toxische effecten van chemotherapie voor de behandeling van ziekten, bijvoorbeeld chemotherapeutica gericht op het vernietigen van tumorcellen. De wijziging van de liposoomoppervlakte met polymeren zoals polyethyleenglycol (PEGylering) verdere uitbreiding van de liposomaal bloedcirculatie tijd in vivo vanwege sterische stabilisatie 4. Moreoveh, liposomen kunnen afzonderen hoge concentraties van verschillende stoffen zoals eiwitten 5,6, hydrofiele stoffen 7,8 en enzymen 9. Ze dienen dan ook als betrouwbare klinische therapeutische en diagnostische instrumenten die hun goedkeuring voor de levering van cytotoxische geneesmiddelen verdienen, zoals doxorubicine voor kankertherapie 4. Door hun flexibiliteit kunnen liposomen worden geladen met fluorochromen voor diagnostische en beeldgeleide chirurgische doeleinden. Fluorescentiebeeldvorming levert een rendabele en niet-invasief in vivo diagnostisch hulpmiddel vereist echter een aantal fundamentele eisen. Het kan worden aangetoond dat fluorchromen die het best voor in vivo beeldvorming past hebben karakteristieke absorptie en emissie maxima in het bereik waar het licht dispersie en verstrooiing evenals weefsel autofluorescence afkomstig van water en hemoglobine is laag. Aldus dergelijke probes hun abs / em maxima tussen 650 en 900 nm 10.<html> Daarnaast, de stabiliteit van de fluorochromen zowel in vitro en in vivo is kritisch, aangezien opsonisatie en snelle klaring sterk kunnen beperken hun toepassing in vivo beeldvorming 11. Andere effecten, zoals slechte stabiliteit en een lage gevoeligheid of cytotoxische effecten op doelorganen zoals gezien met indocyaninegroen (ICG) 12-16, zijn ongewenst en moet in aanmerking worden genomen bij het ​​ontwerpen van sondes voor in vivo beeldvorming. Deze waarnemingen hebben geleid tot de actieve ontwikkeling van verschillende preklinische NIR fluorochromen, nanodeeltjes en nieuwe technieken voor de in vivo beeldvorming van ontstekingsprocessen, kanker en voor beeldgeleide chirurgie 17-20. Ondanks de stabiliteit van de meeste preklinische NIRF (nabij-infrarood fluorescentie) kleurstoffen in vitro, hun snelle perfusie en klaring door de lever en nieren belemmeren het gebruik bij de in vivo optische beeldvorming van ziekten en ontstekingsprocessen. ntent &quot;&gt; We hebben daarom presenteren een protocol voor het inkapselen van fluorochromen zoals het goed gekarakteriseerd nabij-infrarood fluorescerende kleurstof DY-676-COOH, bekend om zijn neiging tot zelf-demping bij relatief hoge concentraties 21 in liposomen. Bij hoge concentraties H- dimeervorming en / of pi stapelen interacties tussen fluorofoor moleculen zich binnen elkaars Förster straal resultaat Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen het fluorochroom moleculen. Bij lage concentraties de ruimte tussen de fluorofoor moleculen toeneemt, waardoor-pi stapelen wisselwerking voorkomen en H-dimeervorming en resulteert in een hoge fluorescentie-emissie. De schakelaar tussen hoge en lage concentratie en de bijbehorende fluorescentiedoving en activering is een veelbelovende strategie die kan worden benut voor optische beeldvorming 22. Hierbij inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof NIRF DY-676-COOH in het waterige inwendige van liposomen is favorable voor in vivo beeldvorming dan de vrije kleurstof. De uitdaging van de werkwijze ligt allereerst in de juiste inkapseling en anderzijds in de validering van de voordelen van het inkapselen van hoge concentraties van de kleurstof. Vergelijking van de beeldvormende eigenschappen van liposomen geblust met die van de vrije kleurstof en ook een niet afgeschrikt liposoomformulering met lage concentraties van de kleurstof onontbeerlijk. We tonen door een eenvoudige maar zeer effectieve film hydratatie en extrusie protocol gecombineerd met afwisselend bevriezen en ontdooien cycli die inkapseling van uitdoving concentraties DY-676-COOH in liposomen haalbaar. Andere methoden voor het bereiden van liposomen zoals de omgekeerde fase verdamping werkwijze 23 en de ethanol injectiemethode 24 staat liposoompreparaat hoge efficiënties van inkapseling voor veel hydrofiele stoffen. De aard van de stof te kapselen kan de inkapseling efficiëntie beïnvloeden. In effect,de film hydratatie en extrusie-protocol hier gepresenteerde onthulde het hoogste rendement voor het inkapselen van DY-676-COOH. Om de voordelen van liposomale inkapseling van DY-676-COOH, een zymosan geïnduceerde oedeem model, dat de studie van ontstekingsprocessen binnen enkele uren laat illustreren, werd gebruikt. Hier wordt aangetoond dat liposomen met een hoge concentratie van het ingekapselde DY-676-COOH zijn meer geschikt voor het gehele lichaam in vivo optische beeldvorming van ontstekingsprocessen dan de vrije kleurstof of niet- afgeschrikt liposomale formulering met lage concentraties kleurstof. Dus de onderliggende protocol een eenvoudige en snelle methode om geblust fluorescerende liposomen en de validatie van de activering en imaging potentieel zowel in vitro als in vivo produceren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materialen en apparatuur voor de bereiding van liposomen</td></tr><tr><td>egg phospahtidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051P</td><td>Oplossen in chloroform en bewaar in glazen flesjes (214 mg/ml)</td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Oplossen in chloroform en bewaar in glazen flesjes (134 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium zout)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880120P</td><td>Oplossen in chloroform en bewaar in glazen flesjes (122 mg/ml)</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium zout)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145P</td><td>Oplossen in chloroform en bewaar in glazen flesjes (2 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td><td>Sartorius AG</td><td>Research RC 210 P</td><td>gebruikt voor het wegen van de fosfolipiden</td></tr><tr><td>Rotavapor</td><td>B&uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-114</td><td>gebruikt voor de hydratatie van fosfolipidenfilm</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>B&uuml;chi Labortechnik AG</td><td>R-481</td><td>gebruikt voor de hydratatie van fosfolipidenfilm</td></tr><tr><td>Vacuum Controller</td><td>B&uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-720</td><td>gebruikt voor de hydratatie van fosfolipidenfilm</td></tr><tr><td>Vacobox</td><td>B&uuml;chi Labortechnik AG</td><td>B-177</td><td>gebruikt voor de hydratatie van fosfolipidenfilm</td></tr><tr><td>Circulation Chiller</td><td>LAUDA DR. R. WOBSER GMBH &amp; CO. KG</td><td>WKL 230</td><td>gebruikt voor de hydratatie van fosfolipidenfilm</td></tr><tr><td>DY-676-COOH</td><td>Dyomics GmbH</td><td>676-00</td><td>Oplossen in 10 mM Tris en bewaar stock op -20&deg;C</td></tr><tr><td>Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Applichem</td><td>A1086</td><td>buffer 10 mM, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>Y015.2</td><td>gebruikt voor liposomen bereiding</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Merck Eurolab GmbH</td><td>USR 170 H</td><td>gebruikt voor liposomen bereiding</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-0256</td><td>gebruikt voor liposomen bereiding</td></tr><tr><td>Sephadex G25 medium&nbsp;</td><td>GE Healthcare Europe GmbH</td><td>17-0033-01</td><td>gebruikt voor liposomen zuivering</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Ferak Berlin GmbH</td><td>505002</td><td>gebruikt om liposomen te vernietigen&nbsp; voor kleurstof kwantificering</td></tr><tr><td>LiposoFast-Basic</td><td>Avestin Inc.</td><td></td><td>gebruikt voor de extrusie van liposomen</td></tr><tr><td>Polycarbonaat filtermembraan, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td><td>VWR</td><td></td><td>gebruikt voor de extrusie van liposomen via LiposoFast-Basic</td></tr><tr><td>Fluostar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>gebruikt voor kleurstof kwantificering</td></tr><tr><td>ZetaSizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>gebruikt voor de bepaling van liposomen grootte en zetapotentiaal</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>XL 80</td><td>gebruikt voor de concentratie van de monsters</td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckmann Coulter GmbH</td><td>SW 55 TI</td><td>gebruikt voor de concentratie van de monsters</td></tr><tr><td colspan="4">Materialen en apparatuur voor de evaluatie van liposomen en optisch beeldvorming</td></tr><tr><td>Zymosan-A van Saccharomyces cereviciae</td><td>Sigma</td><td>Z4250-250MG</td><td>gebruikt voor de inductie van ontsteking</td></tr><tr><td>Isotone zoutoplossing (0,9%)</td><td>Fresenius GmbH</td><td>PZN-2159621</td><td>gebruikt voor de verdunning van Zymosan-A</td></tr><tr><td>Isoflurane verdamper</td><td>Ohmeda Isotec 4</td><td></td><td>gebruikt voor het anesthesizeren van dieren</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Actavis GmbH&nbsp;</td><td>PZN-7253744</td><td>anesthesie</td></tr><tr><td>Thermo Mat Pro 20 W</td><td>Lucky Reptile</td><td>61202-HTP-20</td><td>gebruikt om dieren warm te houden tijdens anesthesie</td></tr><tr><td>Omnican-F (1 ml injectie)&nbsp;</td><td>Braun</td><td>PZN-3115465</td><td>gebruikt voor subcutane en intraveneuze toediening van sondes</td></tr><tr><td>Panthenol oogcrème</td><td>Jenapharm</td><td>PZN-3524531</td><td>gebruikt om droogheid van de ogen van dieren tijdens anesthesie te voorkomen</td></tr><tr><td>Hanks gebufferde zoutoplossing</td><td>PAA Laboratories /Biochrom AG</td><td>L2045</td><td>w/o Mg2+, Ca2+ en fenol rood. Voor verdunning van sondes en voor het wassen van cellen</td></tr><tr><td>8-Well kamer slides</td><td>BD Biosciences</td><td>354108</td><td>gebruikt voor celcultuur gevolgd door microscopie&nbsp;</td></tr><tr><td>Celcultuur flessen</td><td>Greiner BioOne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur media</td><td>Gibco (life technologies GmbH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal kalfs serum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine oplossing (0,01%, 50&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>gebruikt om celcultuur kamer slides te coaten</td></tr><tr><td>Mountant Permafluor</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>S21022-3</td><td>Montageoplossing voor microscopie</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>AppliChem</td><td></td><td>DNA-kleuring voor microscopie</td></tr><tr><td>Hera-Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>steriele werkbank gebruikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>HERA cell</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td>Incubator gebruikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>LSM510-Meta</td><td>Zeiss</td><td></td><td>gebruikt voor confocale microscopie</td></tr><tr><td>Maestro-TM in vivo fluorescentie beeldvormingssysteem</td><td>CRi, Woburn</td><td></td><td>gebruikt voor het beeldvormen van kleine dieren in hun geheel</td></tr><tr><td>Spectrofotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>gebruikt voor het meten van absorptie</td></tr><tr><td>Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td><td>Jasco</td><td>

fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood fluorofoor als een instrument voor in vivo optical imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optische beeldvorming biedt een breed scala aan diagnostische modaliteiten en heeft veel interesse gewekt als een hulpmiddel voor biomedische beeldvorming. Ondanks het enorme aantal beeldvormingstechnieken dat momenteel beschikbaar is en de vooruitgang in instrumentatie, is er nog steeds behoefte aan zeer gevoelige sondes die geschikt zijn voor in vivo beeldvorming. Een typisch probleem van beschikbare preklinische fluorescente sondes is hun snelle eliminatie in vivo, wat hun beeldvormingsgevoeligheid vermindert. Om snelle eliminatie te omzeilen, het aantal kleurstofmoleculen op de doelplaats te verhogen en daardoor de achtergrondautofluorescentie te verminderen, werd encapsulatie van de nabij-infrarode fluorescente kleurstof, DY-676-COOH in liposomen en verificatie van zijn potentieel voor in vivo beeldvorming van ontsteking uitgevoerd. DY-676 staat bekend om zijn vermogen om zichzelf te dempen bij hoge concentraties. We bepaalden eerst de concentratie die geschikt is voor zelfdemping en kapselen vervolgens deze dempingsconcentratie in het waterige binnenste van PEGyleren liposomen. Om de dempings- en activeringspotentieel van de liposomen te onderbouwen, gebruiken we een harde bevriezingsmethode die leidt tot schade aan liposomale membranen zonder de ingekapselde kleurstof aan te tasten. De liposomen gekenmerkt door een hoge mate van fluorescentiedemping werden Lip-Q genoemd. We tonen door experimenten met verschillende cellijnen aan dat opname van Lip-Q voornamelijk plaatsvindt door fagocytose, wat op zijn beurt de karakterisering van zijn potentieel als een hulpmiddel voor in vivo beeldvorming van ontsteking in muismodellen mogelijk maakte. Verder gebruiken we een zymosan-geïnduceerd oedeemmodel in muizen om het potentieel van Lip-Q in optische beeldvorming van ontsteking in vivo te onderbouwen. Gezien mogelijke opname als gevolg van ontstekingsgeïnduceerde verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect, werd een always-on liposoomformulering met een lage, niet-gedempte concentratie van DY-676-COOH (genoemd Lip-dQ) en de vrije DY-676-COOH vergeleken met Lip-Q in dierproeven.

Het inkapselen van hoge concentraties van fluorescente kleurstoffen zoals de NIRF kleurstof DY676-COOH hier in het waterige inwendige van liposomen leidt tot een hoog niveau van fluorescentie uitdoving. Fluorescentiedoving, een fenomeen gezien met vele fluoroforen in hoge concentraties, kunnen in verschillende in vivo imaging toepassingen waar een hoge gevoeligheid en betrouwbare detectie van het doelgebied zijn opgesteld worden benut. Het gebruik van liposomen ook bescherming van de kleurstof die onmisbaar is ...

Het gebruik van fluoroforen voor in vivo beeldvorming kan sterk beperkt worden door opsonisatie, snelle klaring, lage detectiegevoeligheid en cytotoxische effecten op de gastheer. Encapsulatie van fluoroforen in liposomen door filmhydratie en extrusie leidt tot fluorescentiekwelving en bescherming, wat in vivo beeldvorming met hoge detectiegevoeligheid mogelijk maakt.

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Het algemene doel van deze procedure is om een activaat liposome voor te bereiden dat in vivo beeldvorming van ontsteking met een hoge gevoeligheid mogelijk maakt. Dit wordt bereikt door eerst in de tweede stap een lipidefilm samengesteld uit fosfolipiden voor te bereiden. Spontane vesikel worden gevormd door de fosfolipidefilm te hydrateren met een geknepen concentratieoplossing van een nabij infrarood fluorescerende kleurstof.De spontaan gevormde vesikel of SFV worden geëxtrudeerd om de homogeniteit van de liposomale vesikel te waarborgen en vervolgens worden de liposomen gezuiverd van de resterende niet-gekapselde kleurstofmoleculen. Uiteindelijk worden spectrometrische metingen van absorbantie en fluorescentie-emissie gebruikt om de quench-toestand van de ingekapselde kleurstof in vivo te tonen. Nabij infrarood fluorescentiebeeldvorming wordt gebruikt om het potentieel van de liposomen voor beeldvorming van ontstekingsprocessen aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze technologie boven andere bestaande is dat we het signaal direct na internalisatie van het contrastmiddel in de cellen kunnen bepalen. Dat betekent dat ze worden geactiveerd in de cel, zodat het gedetecteerde signaal uitsluitend afkomstig is van de cellen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot diagnose en therapie van kanker.Aangezien fagocyten, zoals tumor-geassocieerde macrofagen, de liposomen kunnen opnemen en afbreken en daarbij therapeutische geneesmiddelen of beeldvormingssondes in de tumoren vrijgeven. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de encapsulatie-efficiëntie wordt beïnvloed door de eigenschappen van de DAI die wordt gebruikt en de effectiviteit van het hydratatieproces. Om een spontaan gevormde vesicale dispersie te initiëren, begint u door ongeveer drie milliliter chloroform toe te voegen aan een ronde bodemkolf, gevolgd door het juiste volume vers bereide fosfolipide-stalkoplossingen met een molaire verhouding van 6,5 tot drie tot 0,5 voor dubbele fluorescerende markering van de liposomen. Voeg vervolgens 0,3 molair procent N-B-D-D-O-P-E toe aan de lipideoplossing.Gebruik vervolgens een roterende verdamper om het chloroform uit de organische fosfolipideoplossing te verdampen onder verlaagde druk bij 300 millibar en 55 graden Celsius. Nadat een homogene fosfolipidefilm is gevormd, verlaagt u de druk tot 10 millibar gedurende een tot twee uur om eventuele resterende chloroformafzetting te verwijderen terwijl het chloroform verdampt. Los fluorescerende kleurstofcarboxylaatzuur op in buffer en vul een doer-vat met vloeibaar stikstof.Schakel vervolgens een ultrasoonbad in op 50 graden Celsius. Breng nu een geschikt volume van de kleurstofcarboxylaatzuur over naar de ronde bodemkolf om de droge fosfolipidefilm te hydrateren en schud krachtig totdat zich een spontaan gevormde vesikeldispersie vormt, zorg ervoor dat alle fosfolipiden zijn verspreid om lipideverlies te voorkomen. Vries vervolgens de ronde bodemkolf met de SFV-dispersie in vloeibaar stikstof.En na drie tot vijf minuten, plaats de kolf in het ultrasoonbad om de dispersie te ontdooien en schud de kolf nog eens een tot twee minuten krachtig. Om de vorming van homogene vesikel te vergemakkelijken, zuigt u de SFV-dispersie aan in een spuit van één milliliter en gebruik vervolgens een lipo sofa's basisextruder om deze door een 100 nanometer polycarbonaatmembraan te laten gaan in een tweede spuit van één milliliter. Extrudeer de dispersie terug in de eerste spuit en herhaal de overdracht 10 keer.De oplossing zou van een wazig uiterlijk moeten veranderen in een heldere dispersie. Verwijder na de 10e extrusiecyclus de tweede spuit en extrudeer de dispersie voor de laatste keer direct in een steriele 1,5 milliliter reactiebuis. Breng vervolgens 0,5 milliliter van de geëxtrudeerd vesikeldispersie over op het gelbed van een 28 centimeter gelchromatografiekolom geladen met G 25-kralen gedrenkt in trisbuffer en laat het monster in de gelmatrix druppelen.Elueer de liposomen met trisbuffer en verzamel de liposomenfractie totdat de liposomen volledig zijn afgevoerd. Concentreer vervolgens de geëlueerde liposomen door ultracentrifugering en verdun ze in een voldoende volume steriele trisbuffer. Elektronenmicrografen van de liposomen zouden een meestal onal-morfologie van de liposomale vesikel moeten onthullen om de fluorescentie-quenching en activeringscapaciteiten van de liposomen te analyseren. Breng vervolgens 100 nanomolair totaal van de juiste lipiden over in twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter.Breng vervolgens een vrije dicarboxylaatequivalent over op de kleurstofgehalte van lip Q in een andere 1,5 milliliterbuis en incubeer één buis van elk monster bij vier graden Celsius en de tweede bij min 80 graden Celsius. De volgende ochtend zet u een verwarmingsblok op 30 graden Celsius. Vul een koelbox met gemalen ijs en breng een aliquot trisbuffer in evenwicht tot kamertemperatuur.Breng vervolgens snel de monsters uit de min 80 graden Celsius opslag op 30 graden Celsius gedurende vijf minuten terwijl u de monsters van vier graden Celsius naar kamertemperatuur brengt gedurende vijf minuten. Koel vervolgens alle monsters aan ijs gedurende één minuut voordat u ze terugbrengt naar kamertemperatuur. Voeg nu trisbuffer toe aan elk van de monsters tot een eindvolume van 100 microliter.En na nog eens 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, pipet 80 microliter van elk monster in een glasbuisje met laag volume en meet de absorptie van 400 tot 900 nanometer op een spectrometer. Breng de monsters terug in hun overeenkomstige buisjes en breng vervolgens 80 microliter van elk monster over in geschikte glazen cuvetten. Om de fluorescentie-emissies te meten op een spectraal fluorimeter door de monsters te exciteren bij 674 nanometer en de fluorescentie te meten van 694 tot 800 nanometer.Om de ontstekingsdetectie-eigenschappen van de liposomen te evalueren, vult u één spuit met 50 microliter van xin een oplossing, één met 50 microliter isotone zoutoplossing en één met de experimentele sonde-oplossing,

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van een fluorescerende marker door saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles geleverd. Gebruikmakend muismodellen van kanker en artritis, laten we zien hoe de Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt voor een nauwkeurige kartering en biologische karakterisering van ziekteprocessen.

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde, real-time NIR-II fluorescentie beeldvormingsoperatie van een muis met behulp van een NIR-II optisch beeldvormingsapparaat.

Een heldere NIR-II fluorescentiesonde voor vasculaire en tumorbeeldvorming

Dit artikel beschrijft de tweekleurige labeling van lange RNA's op termini-posities en hun oppervlakte-immobilisatie via inkapseling in fosfolipideblaasjes voor FRET TIRF-microscopietoepassingen met één molecuul. De combinatie van deze technieken maakt nauwkeurige visualisatie en analyse van de RNA-dynamiek op het niveau van één molecuul mogelijk.

Fluorescerende eindlabeling en inkapseling van lange RNA's voor FRET-TIRF-microscopie met één molecuul

Leer hoe je liposomen met nabij-infrarode fluorescentiekleurstoffen bereidt voor hooggevoelige in vivo beeldvorming van ontstekingen. Deze methode optimaliseert detectie door efficiënte inkapseling en zuivering van de kleurstof.

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging

Meer video's verkennen