Met behulp plusTipTracker Software om dynamiek van microtubuli Meet in Xenopus laevis Groei Kegels
7 september 2014
De MATLAB-gebaseerde, open source software pakket, plusTipTracker, kan worden gebruikt voor het analyseren afbeelding reeks van fluorescent gelabelde + tips om dynamiek van microtubuli kwantificeren.
Het doel van deze procedure is om kwantitatieve informatie te verkrijgen over Microtubule plus end tracking protein of plus tip-dynamiek en levende groeiknoppen met behulp van het softwarepakket plus tip tracker. Hier beschrijven we de stappen voor het analyseren van afbeeldingen van EB one GFP-dynamiek en gekweekte XUS lavis groeiknoppen, maar een soortgelijk protocol kan worden gebruikt voor andere celtypen na het verkrijgen van hoogwaardige live-afbeeldingen van getagde EB one en gekweekte embryonale groeiknoppen. De eerste stap in de procedure is om de opdracht plus tip, get tracks te gebruiken om de EB one GFP-kometen te detecteren, de kometen te linken in tracks en de parameters van microtubulusdynamiek te bepalen.
De tweede stap is om de opdracht plus tip C tracks te gebruiken om de microtubulustracks weer te geven die zijn gesuperponeerd op de groeikoppelafbeeldingen. De laatste stap is om plus tip group analysis te gebruiken om de microtubulustrackparameters van groepen films te analyseren en te vergelijken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het gebruik van handtracking om individuele plus tip-tracks te analyseren, is dat deze methode snelle en geautomatiseerde detectie, tracking, visualisatie en analyse mogelijk maakt.
De eerste stap in de beeldafbeeldanalyse is het detecteren van de EB one GFP-kometen, het linken van de kometen in tracks en het bepalen van de parameters van microtubulusdynamiek. Dit wordt verkregen met de opdracht plus tip. Get tracks vóór beeldafbeeldanalyse.
Converteer elke time-lapse film in een reeks TIFF-beeldbestanden en sla elke serie op in een eigen map genaamd images. Let op dat images hoofdlettergevoelig is. Om met de analyse te beginnen, opent u de MATLAB-toepassing en typt u plus tip get tracks in het opdrachtvenster.
Dit zorgt ervoor dat een nieuw dialoogvenster verschijnt. Klik op, nieuwe projecten instellen en selecteer een of meer van de vorige TIFF-beeldseries door de juiste images-map te selecteren. Na voltooiing van deze stap wordt een bestandsmap gemaakt.
Klik op, oké. Zodra de eerste afbeelding is weergegeven, gebruikt u de muis om te klikken en een veelhoek te maken. Dan omvat het de gehele groeikoppel.
Dubbelklik met de muis om de veelhoek te sluiten. Er verschijnt een dialoogvenster als de afbeelding nog een groeikoppel heeft. Om te analyseren, selecteert u ja.
Anders, selecteer nee. De volgende stap is om de projecten te selecteren die onmiddellijk worden geanalyseerd. Klik op projecten selecteren en selecteer de map.
Om een lijst te analyseren, verschijnt er een plakkerig scherm. Selecteer de projecten aan de linkerkant van het scherm en verplaats ze naar de rechterkant. Klik op, oké.
Kies een locatie om de projectlijst op te slaan en klik op opslaan, selecteer detectie, tracking en nabewerking. Zodra deze selecties zijn gemaakt, wordt de rechterkant van het dialoogvenster configureerbaar. Vul de nabewerkingsinstellingen in.
Afhankelijk van de gewenste specifieke instellingen voor beeldacquisitie, klikt u op starten. De software zal vervolgens de stappen uitvoeren die zijn ingevoerd. Het opdrachtvenster geeft de geschatte resterende tijd voor elke functie weer en geeft aan wanneer de stap klaar is met uitvoeren.
Nu micro tubial-tracks zijn gedefinieerd, wordt de functie plus tip C tracks gebruikt voor trackvisualisatie en om de micro tubial-tracks weer te geven die zijn gesuperponeerd op groeikoppelafbeeldingen. Dit wordt verkregen met de opdracht plus tip C tracks, typ plus tip C tracks in het opdrachtvenster. Nadat het dialoogvenster is geladen, klikt u op project selecteren.
Selecteer de bovenliggende map die het project bevat om te visualiseren en klik op map selecteren. Zodra het venster verschijnt, kies het bestand om te visualiseren en klik op. Oké, klik vervolgens op selecteer opgeslagen ROI, navigeer naar dezelfde regio van belangmap als degene die in de vorige stap is geselecteerd en selecteer het bestand genaamd R-O-I-Y-X.
Klik op selecteer uitvoermap om aan te geven waar MATLAB de trackvisualisatiebestanden zal opslaan en selecteer vervolgens maak trackfilmpje. Er verschijnt een scherm met alle tracks. Plus tip get tracks berekend uit de plus tip-opmerkingen.
De stap slaat de tracks in tijdreeksformaat op in een filmformaat. De laatste functie wordt gebruikt om groepen films te maken voor analyse en vergelijking van de micro tubial-trackparameters. Dit wordt verkregen met de opdracht plus tip groepanalyse.
Zodra plus tip get tracks voor meerdere films is uitgevoerd en verschillende gegevenssubsets klaar zijn voor vergelijking. Typ plus tip groepanalyse in het opdrachtvenster Om de groepen handmatig te selecteren om te vergelijken, deselecteer eerst autogroep uit de hiërarchie. Klik vervolgens op projecten selecteren.
Navigeer naar de bovenliggende mappen die alle ROI-mappen bevatten. Om een lijst te analyseren, verschijnt er een GUI-venster. Selecteer alle projecten die in de groepen moeten worden opgenomen aan de linkerkant van het scherm en verplaats ze naar de rechterkant.
Klik op, oké. Kies vervolgens een locatie om de projectlijst op te slaan en klik op opslaan, er verschijnt een venster. Klik op.
Oké en de lijst selecteert het plakkerige venster zal worden weergegeven. Selecteer opnieuw alleen de bestanden die overeenkomen met de eerste groep die samen moet worden getrokken en klik op.Oké. Voer de groepsnaam in en klik op, oké.
Er verschijnt een venster, antwoord dienovereenkomstig en blijf groepen selecteren. Kies vervolgens een locatie om de groepslijst op te slaan en klik op opslaan. Klik op selecteer uitvoermap om te kiezen waar de uitvoermappen zullen worden opgeslagen.
Selecteer ten slotte welk type groepanalyse u wilt uitvoeren. Hier selecteren we gegevens poolen van alle cellen en groepen. Klik op groepen vergelijken.
Deze afbeelding toont de parameters van Micro tubial-dynamiek verkregen uit de functie plus tip git tracks. Deze film demonstreert de microtubulustracks verkregen uit de functie plus tip C tracks. Ten slotte toont deze afbeelding de microtubulusparameters verkregen uit de functie plus tip groepanalyse.
Gebruik een spreadsheettoepassing. Deze parameters die zijn verkregen uit verschillende groepen films kunnen ook worden onderzocht als boxplots met behulp van een verwerkingsprogramma. Na het
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft het gebruik van het op MATLAB gebaseerde softwarepakket, plusTipTracker, voor het analyseren van microtubuli-dynamiek via fluorescent gelabelde +TIP's. De procedure biedt een systematische aanpak om het gedrag van microtubuli plus-uiteinde-trackende eiwitten in levende groeikegels te kwantificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microtubulusdynamiek
Achtergrond
- Microtubuli spelen een cruciale rol in de cellulaire structuur en functie.
- +TIPs zijn eiwitten die zich binden aan de groeiende uiteinden van microtubuli.
- Kwantitatieve analyse van de dynamiek van +TIPs is essentieel voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Bestaande methoden voor het volgen van microtubuli kunnen tijdrovend en minder efficiënt zijn.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het analyseren van microtubulidynamiek met behulp van plusTipTracker.
- Om het begrip van +TIP-gedrag in levende cellen te vergroten.
- Om de voordelen van geautomatiseerde tracking ten opzichte van handmatige methoden aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van het commando plusTip, get tracks om EB1-GFP-cometen te detecteren.
- Koppelen van cometen tot tracks om parameters van microtubuli-dynamiek te bepalen.
- Visualisatie van microtubuli-tracks met behulp van het commando plusTip C tracks.
- Groepsanalyse van microtubuli-trackparameters over meerdere films.
Belangrijkste resultaten
- Geautomatiseerde detectie en tracking van microtubuli-dynamiek werden gerealiseerd.
- Visualisatietechnieken boden duidelijke inzichten in het gedrag van microtubuli.
- Groepsanalyse maakte vergelijkende studies onder verschillende condities mogelijk.
- De methode bleek sneller en efficiënter dan traditionele trackingmethoden.
Conclusies
- plusTipTracker is een waardevolle tool voor het bestuderen van microtubulusdynamiek.
- De geautomatiseerde aanpak verbetert de nauwkeurigheid en efficiëntie van de analyse.
- Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende celtypen en condities.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het kwantificeren van microtubuli-dynamiek in neuronale groeikegels biedt mechanistische inzichten in axonale geleiding en synaptische vorming, processen die relevant zijn voor modellen van neurodevelopmentale stoornissen. Geautomatiseerde analyse van +TIP-komeetbanen maakt high-content screening mogelijk van verbindingen die de regulatie van het cytoskelet beïnvloeden, wat de validatie van targets in ontdekkingspijplijnen voor neurowetenschappen ondersteunt. Deze aanpak vermindert analytische bias en verhoogt de doorvoersnelheid in vergelijking met handmatige tracking, waardoor het voorspellende vertrouwen in vroeg stadium onderzoeken naar target-engagement wordt verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de polymerisatiedynamiek van microtubuli mogelijk als functionele read-out voor targets die axonale groei of stabiliteit reguleren.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve parameters (groeisnelheid, pauzefrequentie, catastrofesnelheid) voor een consistente beoordeling van het target-fenotype over diverse compound-bibliotheken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare, multiparametrische read-outs van microtubuli-gedrag, geschikt voor miniaturisatie en automatisering van assays in 96- of 384-well formats.
- Operationele waarde: Faciliteert de standaardisatie van assays tussen laboratoria door het definiëren van duidelijke ROI-selecties, trackingparameters en drempelwaarden voor groepsanalyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Verbindt in vitro microtubuli-dynamiekfenotypes met ziekte-relevante mechanismen in neurodevelopmentele of neurodegeneratieve modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van primaire neuronale culturen naar organotypische coupes of in vivo validatie door middel van een geconserveerde +TIP-trackingmethode.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de vroege ontdekking, waarbij kwantitatieve cytoskeletale fenotypes de selectie van doelwitten informeren voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen en preklinische efficiëntietests.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van kinase-, phosphatase- of microtubule-geassocieerde eiwitdoelen via directe meting van +TIP-komeetdynamiek in levende groeikegels.
- Screening: Levert assay-klare, genormaliseerde outputs (komeetdichtheid, tracklengte, snelheidsverdelingen) die berekening van de Z'-factor en hit-bevestiging mogelijk maken.
- Analytics: Biedt statistische vergelijkingen op groepniveau (gemiddelde, variantie, verschuivingen in distributie) die essentieel zijn voor het evalueren van compound-effecten over biologische replicaten heen.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt cytoskeletale fenotypes met assays voor axonale uitgroei of synapsvorming, in overeenstemming met preklinische functionele eindpunten.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een gecentraliseerd, MATLAB-gebaseerd analysekader dat toepasbaar is op diverse celtypen (neuronen, fibroblasten, kankerlijnen) die fluorescente +TIPs tot expressie brengen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitmodulatie door de variabiliteit die inherent is aan handmatige tracking te verminderen en het detecteren van subtiele dynamische verschuivingen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid via geautomatiseerde cometdetectie, gestandaardiseerde trackingalgoritmen en batchverwerking van time-lapse series.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go beslissingen door multiparametrische cytoskeletprofielen eerder in de ontdekkingstijdlijn aan te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van de kwantitatieve ernst van het microtubuli-fenotype en de door verbindingen geïnduceerde reddingsmagnitude.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in live-cell imaging, de MATLAB-omgeving en fluorescent eiwit-tagging (bijv. EB1-GFP) in primaire neuronale culturen.
- Is afhankelijk van resolutie-rijke acquisitiesystemen voor time-lapse met een lage fototoxiciteit, die in staat zijn om +TIP-komeetdynamiek vast te leggen met intervallen van 1–2 seconden.
- Vereist cross-team standaardisatie van de ROI-definitie (omtrek van de groeikegel), trackingparameters (koppelingafstand, framegap) en post-processing filters.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij variërende celmorfologieën (bijv. groeikegels versus axonale schachten) en +TIP-expressieniveaus over verschillende modelsystemen heen.
- Wordt beperkt door de vereiste van detecteerbare, persistente +TIP-kometen; mogelijk niet toepasbaar op condities met zeer onstabiele of schaarse microtubuli-polymerisatiegebeurtenissen.
