Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

Het algemene doel van het volgende experiment is het construeren van gentargetingvectoren met behulp van subkloning plus insertie. Dit wordt bereikt door de ruggengraat die e coli bevat met een recombinerend plasmide te transformeren. De tweede stap omvat het genereren van asymmetrische fosforolaat-insertiecassettes en subkloningsplasmiden door polymerasekettingreactie.

Na de toevoeging van arabinose worden de GBAA recombinatie-eiwitten tot expressie gebracht en wordt de terminaal gemodificeerde insertiecassette en het subkloningsplasmide geëlektroporeerd. De gewenste DNA-sequentie wordt gelijktijdig van de ruggengraat gevangen en gemodificeerd met de insertiecassette in het subkloningsplasmide. Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden zoals standaardrecombinatie, is dat de constructie van gentargetingvectoren in één enkele reactie kan worden uitgevoerd.

Om te beginnen ontwerpen oligo's voor de insertiecassette en het subkloningsplasmide, ontwerp elke oligo zodat deze 180 basenparen homologe armen bevat die het genomische doelwit omringen en 20 basenparen een specifieke primersequentie voor de insertiecassette of het subkloningsplasmide. Bepaal vervolgens de oriëntatie van de genomische DNA-invoegsel van de ruggengraatkloning met behulp van een webgebaseerde tool zoals clone db. Bepaal de richting van replicatie van of naar ES door de kaart van de ruggengraatplasmide-backbone te controleren die in de ruggengraat wordt gebruikt.

Bibliotheekconstructie, voeg twee terminale fosfo acht bindingen toe, zodat het vijf-prim-uiteinde van de oligo dat tegenover de richting van replicatie op de ruggengraatkloning ligt. Voeg vervolgens een vijf-prim-fosfaatmodificatie toe aan de omgekeerde oligo. Prik eerst een steriele pipettepunt in de ruggengraat agarcultuur en inoculeer 5,0 milliliter jodiumbouillon.

Laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius gedurende vijf uur met schudden bij 200 RPM. Koel vervolgens een 10% glyceroloplossing, microcentrifugebuizen en elektroporatie, cuvettes op een ijscooler, gekoelde grote centrifuge en microcentrifuge tot vier graden Celsius. Bepaal na incubatie de optische dichtheid van de cultuur met behulp van een spectrofotometer.

Meet de absorptie. Op 600 nanometer. Bereid de elektrocompetente cellen voor wanneer een OD 600-waarde van 0,3 tot 0,8 is bereikt.

Wanneer de cultuur klaar is, centrifugeer de cellen in een 50 milliliter centrifugeerbuis. Was de cellen met een milliliter gekoelde 10% glycerol en centrifugeer opnieuw. Voer deze wasstappen in totaal drie keer uit.

Resuspendeer de cellen in een totaal volume van 50 microliter en voeg 10 tot 200 nanogram van het recombinatie-plasmide toe. Verkrijg een enkele celsuspensie door meerdere keren op en neer te pipetten en breng de cellen vervolgens over naar een voorgekoelde elektroporatie. Vete. Plaats vervolgens de vete in een elektroporatieapparaat en elektro-bewerk de cellen onmiddellijk herstel de cellen in een milliliter LB en breng de cellen over naar een 50 milliliter centrifugeerbuis.

Laat de ruggengraatcultuur groeien bij 30 graden Celsius gedurende twee uur met schudden bij 200 RPM. Voeg na deze tijd negen milliliter LB toe aan de herstelde cultuur. Laat overnacht groeien bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM om de homologie-armen in de insertiecassette en het subc-kloningsplasmide te incorporeren.

Voer PCR uit met behulp van de lang gemodificeerde oligo's die eerder zijn bereid. Ofwel, lineariseer het plasmidesjabloon met behulp van een restrictie-enzym, kies er een dat buiten het PCR-amplificatiegebied snijdt en thermisch geactiveerd is. Stel de PCR in met behulp van een high fidelity hot start DNA-polymerase systeem.

Bereid een PCR-mastermix voor en voer thermische cyclus uit volgens de beste praktijken. Analyseer na de reactie PCR-producten door AROS-gelelektroforese. Laad één tot vijf microliter van elke PCR op een 1% AROS-gel.

Zuiver vervolgens de PCR-producten met behulp van een PCR-zuiveringskit. Kwantificeer het PCR-geamplificeerde DNA ten opzichte van een bekende set DNA-standaarden of met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer. Na een nachtelijke incubatie, verdun de ruggengraat GBAA-cultuur 50 keer en bereid een aparte cultuur voor als negatieve controle.

Laat de verdunde culturen groeien bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM gedurende één uur en 50 minuten. Koel vervolgens alle recombinatiematerialen en apparatuur af tot vier graden Celsius zoals eerder is aangetoond. Bereid een 10% gewicht per volume oplossing van OSE en filter steriliseer door een 0,2 micron spuitfilter.

Wanneer de OD van de ruggengraatcultuur het gewenste niveau bereikt, gaat u verder met het induceren van de recombinatie-eiwitten. Voeg 200 microliter van de 10% Arab-oplossing toe aan 10 milliliter van de ruggengraatcultuur om een ​​finale aose-concentratie van 0,2% te bereiken. Neem een ​​niet-geïnduceerde cultuur op om als negatieve controle te worden gebruikt. Breng de culturen over naar een schuddende incubator van 37 graden Celsius en induceer rode expressie gedurende 45 minuten met schudden bij 230 RPM.

Centrifugeer de cellen en was ze drie keer met 10% glycerol zoals eerder is aangetoond bij 600 tot 1000 nanogram. Elke insertiecassette en het subkloningsplasmide naar de recombinatiereactie omvatten een vector alleen en een vector plus enkelvoudig insert controle om de recombinatieproef en integriteit van de vector te controleren. Verkrijg vervolgens een enkele celsuspensie en elektro-bewerk de cellen zoals eerder is aangetoond.

Laat herstel toe in LB-medium bij 37 graden Celsius gedurende één uur voor multi-kopie plasmiden of in 10 lb bij 37 graden Celsius gedurende drie uur voor ruggengraatvectoren. Voltooi verschillende verdunningen met de herstelde cultuur op dubbele selectie. Agar alsjeblieft en groei bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur.

Wanneer klaar, pluk kolonies in vijf milliliter LB met het selectieve antibioticum en laat overnacht gro