Name: Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer de SPOT-methode voor peptide-arrays om de substraatspecificiteit van eiwit-lysine-methyltransferases te analyseren. Deze techniek identificeert kritieke aminozuren en helpt bij het begrijpen van biologische functies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is ondersteund door de DFG-subsidie JE 252/7.

1. Bereiding van Peptide Arrays <ol><li> Programmering van de peptidesequenties <ol><li> Ontwerp peptidesequenties voor de synthese met de MultiPep Spotter software. Voer het peptide sequenties in enkele letter codes. Peptide 1: TARKSTGGKA </li><li> Genereer alanine of arginine lopen bibliotheken met een specifieke opdracht (.Plaats, A) om de belangrijke aminozuren die nodig zijn voor de erkenning van een bepaald substraat screenen. Bijvoorbeeld in het volgende voorbeeld de eerste lijn is de wildtype sequentie en van de tweede regel elk aminozuur in een peptide gewijzigd in alanine sequentieel. vervangen, A TARKSTG Een -ARKSTG T- Een -RKSTG TA-A -KSTG TARGET Een -STG TARK- Een -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Gebruik van soortgelijke opdrachten (.Plaats R,.Vervang N etc.) zoals beschreven in 1.1.2 met alle beschikbare natuurlijke aminozuurresiduen (eventueel weglaten cysteïne, methionine en tryptofaan, omdat deze resten zijn gevoelig voor oxidatie en soms lager synthese opbrengst) van een peptide-array synthetiseren voor het vaststellen consensus substraat sequentie motief voor een enzym. Opmerking: Zoals getoond in figuur 4A, de horizontale as de gegeven peptidesequentie en de verticale as de aminozuren die zijn geselecteerd commando. Vergelijkbaar met de in 1.1.2 sequentie A op de verticale as betekent dat een Ala opeenvolgend vervangt elke positie van de gegeven sequentie in de eerste rij in Fig. 4A. Evenzo arginine achtereenvolgens vervangt elk aminozuur in de tweede rij en zo verder met de andere aminozuren. Compleet peptide-array bibliotheken worden gesynthetiseerd door systematisch elk residu te vervangen in de verstrekte peptidensubstraat opeenvolging met elk van the andere natuurlijk beschikbaar aminozuurresiduen, dit helpt om de invloed van elke rest op elke positie van de bepaalde sequentie begrijpen. </li><li> Alternatief kan methylering van bekende of voorspelde peptide substraten gemakkelijk worden geverifieerd synthetiseren peptide bibliotheken de targetpeptiden van de PKMT samen met positieve en negatieve controles methylering (bijvoorbeeld peptiden waarvan bekend gemethyleerd of bekende niet gemethyleerd zijn). Synthetiseren peptiden door het uitwisselen van de vermeende doelwit lysine alanine aan methylatie van het doel lysine bevestigen, zoals hieronder getoond door handmatig programmeren. Wild-type peptide: STGG K PRQFL Mutant peptide: STGG Een PRQFL OPMERKING: De software heeft ook inherent scripts om verschillende bibliotheken te maken, net als epitoopmapping met een gewenste kader verschuiving van de reeks aan belangrijke aminozuren die nodig zijn voor een interactie in kaart. </li></ol></li><li> Voorbereiding van Membrane, Aminozuren eend Reagentia <ol><li> Pre-zwellen de SPOT-membraan in DMF (N, N-dimethylformamide) gedurende 10 minuten en plaats dan de natte membraan op de SPOT-synthesizer kader zonder luchtbellen of rimpels. </li><li> Was het membraan driemaal met 100% ethanol. Droog de membranen geheel ten minste 10 minuten voordat het synthese-programma. </li><li> Tegelijkertijd vers bereid 0,5 M werkende concentraties van commercieel verkrijgbare Fmoc-beschermde aminozuren op te lossen in NMP en ook de activator en de basis bereiden zoals beschreven in tabel 1. </li><li> Zorg ervoor dat al het afval oplossing containers van de SPOT-synthesizer werden geleegd en vul het oplosmiddel reservoirs met de DMF, ethanol en piperidine. LET OP: De machine is nu klaar voor de synthese. </li></ol></li><li> Spotten van het eerste aminozuur <ol><li> Om de amide band met de vrije aminogroep op het membraan te genereren, het activeren van de carboxylgroep van de inkomende aminozuur door adding de activator (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) en basische oplossing (Ethyl hydroxyimino cyaanacetaat) het aminozuurderivaat. </li><li> Spot de gewenste hoeveelheden van geactiveerde aminozuren aan de amino-PEG gefunctionaliseerd membraan met de programmeerbare robot. OPMERKING: Daardoor wordt de C-terminus van het aminozuur gekoppeld aan de aminogroep van het membraan. </li><li> Herhaal deze stap drie keer betere koppeling van de eerste geactiveerde aminozuur waarborgen. Incubeer het membraan gedurende 20 minuten en daarna wassen met DMF tot ontkoppelde aminozuren te verwijderen. </li></ol></li><li> Het blokkeren van de Vrije Ruimten on Non-spot Gebieden OPMERKING: Na de koppeling van de eerste C-eindstandige aminozuur van peptiden aan de aminogroep van het membraan, kan de aminogroepen tussen de vlekken en ook enkele van de aminogroepen in de spot gebieden niet banden met de amino- zuren. <ol><li> Blokkeer deze vrije aminogroepen door incubatie met de aftopping (20% azijnzuuranhydride in DMF)gedurende 5 min. Opmerking: Dit vermijdt de koppeling van aminozuren in de verdere cycli met het membraan in plaats van de groeiende peptideketen. </li></ol></li><li> Verwijdering van Fmoc Group <ol><li> Na de blokkering, was het membraan met DMF 4 keer en dan incubeer met 20% piperidine in DMF gedurende 20 min aan de Fmoc bescherming groep te verwijderen. OPMERKING: Deze stap leidt tot verwijdering van de amino beschermende Fmoc groepen en wordt deprotectie genoemd. </li><li> Daarna was de membraan tweemaal met DMF en tweemaal met ethanol en laat ze drogen. OPMERKING: Nu de membraan is klaar voor de koppeling van de volgende aminozuren. </li></ol></li><li> Kettingverlenging OPMERKING: toevoegen van elk aminozuur wordt een cyclus genoemd. Naast het koppelen van eerste aminozuur, de cyclus begint met de ontscherming van de Fmoc groep van de gekoppelde aminozuur en wordt gevolgd door het koppelen van de geactiveerde carboxylgroep van een inkomende aminozuur aan de aminogroep van de groeiende peptij keten. <ol><li> Herhaal de stappen 1.3 en 1.5 totdat het gewenste peptide lengte is bereikt. </li></ol></li><li> Vlekken OPMERKING: Na de laatste cyclus, worden de peptide arrays gekleurd met broomfenolblauw aan de geslaagde synthese van peptiden te bevestigen. Broomfenolblauw bindt met de vrije aminogroepen van de peptiden. Peptide vlekjes lichtblauwe kleur na kleuring maar de intensiteit van de vlekken varieert afhankelijk van de peptidesequentie. Deze kleuring maakt bevestiging van de volledige verwijdering van piperidine, want in aanwezigheid van piperidine broomfenolblauw niet de peptiden vlekken. Bovendien helpt dit ook om de peptide arrays voor verder gebruik markeren. <ol><li> Na de Fmoc-groep ontscherming in de laatste synthesecyclus, was het membraan met DMF en 100% ethanol. Vervolgens behandel het membraan met broomfenolblauw (0,02% broomfenolblauw in DMF) gedurende ten minste 5 minuten tot het volledig blauw. </li><li> Daarna was het membraan met DMF en ethanol gevolgd door drogen gedurende 10 min. Haal nu het membraan van de synthesizer en het uitvoeren van zijketen verwijdering van de bescherming (paragraaf 1.8) met de hand. Indien nodig, fotograferen het membraan naar de resultaten van de peptidesynthese (fig. 2) documenteren. </li></ol></li><li> Side Chain Deprotectie <ol><li> Behandel de membranen 20 tot 25 ml zijketen ontscherming mengsel bestaande uit 95% trifluorazijnzuur (TFA) aan de zijketen bescherming groepen scavenger-reagentia (2,5% water en 2,5% triisopropylsilaan) aan de zijketens van aminozuren tegen splitsen modificatie tijdens deze stap. Neem een ​​voldoende hoeveelheid deprotectie mengsel te verzekeren dat daaronder het membraan volledig in een goed gesloten chemisch bestendige doos en incubeer het gedurende 1-2 uur onder zacht schudden. </li><li> Was het membraan zesmaal 20-25 ml DCM (dichloormethaan) gedurende 2 minuten elk en tenslotte tweemaal met 100% ethanol en drogen in een exsiccator een nacht. OPMERKING: Nuhet membraan kan worden gebruikt voor experimenten. Een schema van het peptide-array synthese wordt gegeven in figuur 1. </li></ol></li></ol> 2. eiwitexpressie en zuivering <ol><li> Eiwit Expressie van PKMTs als GST Fusions <ol><li> Met behulp van standaard technieken, kloneren van het gen dat codeert voor de volledige lengte PKMT of het katalytische domein in een bacteriële expressievector (zoals pGEX-6p2) uit te drukken als GST-fusie-eiwit. </li><li> Breng de vector met de gewenste PKMT invoegen in BL21 of BL21 codon plus E. coli cellen door hitteschok methode of enige andere methode. </li><li> Bereid een voorkweek met 30 ml Luria-Bertani (LB) media op de dag van expressie en incubeer bij 37 ° C gedurende 7-8 uur onder voortdurend schudden. </li><li> Vervolgens overdracht 10 ml van de voorkweek in een 2 L grote baffled kolven met 1 L LB media en incuberen bij 37 ° C in de incubator onder voortdurend schudden totdat de kweek bereikes een bepaalde optische dichtheid bij 600 nm. Opmerking: deze kan worden geoptimaliseerd voor elk eiwit, we routinematig induceren bij een OD 600 nm van ongeveer 0,8. De inductie temperatuur moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit individueel, sommige eiwitten vertonen een goede expressie 22 ° C en sommige bij hogere temperaturen. </li><li> Schakel de cellen om de inductie temperatuur gedurende 15 minuten, vervolgens induceren met 1 mM isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranoside en laat de kweek groeien gedurende 10-12 uur bij inductietemperatuur. </li><li> Daarna oogsten van de cellen door centrifugatie bij 5000 xg gedurende 15 min en tenslotte de pellet te wassen met 30 ml STE buffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl en 0,1 mM EDTA) en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Ontdooi de celpellet en resuspendeer in 30 ml sonicatiebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT en 5% glycerol) en verstoren door sonicatie. LET OP: Deze buffer nEEDS worden geoptimaliseerd voor elk eiwit uiteindelijk. </li><li> Centrifugeer het cellysaat bij 22.000 xg gedurende 1 uur en later verzamel de bovenstaande vloeistof en het door een kolom bevattende 600 pi van glutathion Sepharose 4B-hars. </li><li> Was de kolom met 50 ml sonicatiebuffer en vervolgens met 100 ml buffer met hoog zoutgehalte (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT en 5% glycerol) om aspecifiek gebonden eiwitten te verwijderen. Elueer de gebonden eiwit met 5 ml buffer met hoog zoutgehalte die 40 mM glutathion. </li><li> Dialyseer het geëlueerde eiwit in 2 L dialysebuffer met lage glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT en 10% glycerol) gedurende 2 uur en later in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT en 70% glycerol voor 8 uur of &#39;s nachts. Controleer de zuivering buffers bij 4 ° C en voer de eiwitzuivering in de koude kamer eiwitdenaturatie te voorkomen. </li></ol></li></ol> 3. Peptide Array methylatie <ol><li> Pre-INCUbation van Peptide Arrays <ol><li> Voer peptide matrix methylering hetzij in een doos van geschikte grootte of in een plastic zak om de verspilling van enzym en dure radioactief gelabeld AdoMet voorkomen. Pre-incubeer het peptide-array membraan in afgesloten plastic zak met de respectieve methylatie buffer zonder enzym en gelabeld [methyl-3H] -AdoMet gedurende 10 min. Het volume buffer afhankelijk van de grootte van de matrix gebruiken, bijvoorbeeld 8 ml methylering buffer voor een volledige specificiteitsprofiel peptide array. Optimaliseren van de hoeveelheid en concentratie van de AdoMet voor elk enzym. </li></ol></li><li> Methylatie van Peptide Arrays <ol><li> Gooi de pre-incubatie buffer en incubeer het membraan 8 ml methylering buffer met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl-3H] -AdoMet 1 tot 2 uur. OPMERKING: De hoeveelheid enzym nodig is voor een methylatie reactie hangt af van de activiteit van specifieke PKMT initiëren we onze screening experimenten typisch met 50 nM enzym final concentratie. </li></ol></li><li> Wassen van Peptide Arrays <ol><li> Daarna de methylering buffer in een radioactief afval container weggooien en was de peptide arrays bij 5 maal met 20 ml buffer die 100 mM ammonium bicarbonaat en 1% SDS gedurende 5 min naar het gebonden eiwit te verwijderen. Gooi het wassen buffer in een radioactief afval container. </li></ol></li><li> Detectie van de Radioactieve Signal <ol><li> Na de wassingen incubeer het membraan gedurende 5 min in 10 ml oplossing Amplify (NAMP100V). </li><li> Dan gooi de Amplify oplossing in het radioactief afval container voor organische oplosmiddelen, verzegeling van de peptide array in een plastic zak en zet het in een autoradiografie cassette. </li><li> Plaats de autoradiografie film op de peptide array in de donkere kamer. Sluit de cassette zorgvuldig en bloot bij -80 ° C voor de nodige tijd. Vervolgens ontwikkelen de film om de resultaten te analyseren. Leg het beeld paar keer met verschillende exposition keer tot verzadiging van sterk gemethyleerd peptide substraten voorkomen. </li></ol></li></ol> 4. Data Processing and Analysis <ol><li> Densitometrische Analyse van Spot intensiteiten <ol><li> Scan de film in een conventionele scanner en geanalyseerd plaatse intensiteiten met densitometrie. Doe dit met behulp van ImageJ (dat is freeware) of een commercieel programma. NOTA BENE: Wij gebruiken Phoretix software voor deze taak. </li></ol></li><li> Normalisatie en middeling van resultaten van verschillende Membranen <ol><li> Het gedrag van de peptide-array methylatie experimenten ten minste in drievoud. Normaliseren van de gescande intensiteiten voor elk experiment door achtergrond aftrekken en het instellen van de activiteit op een referentie-substraat als 1.0. Het gemiddelde van de gegevens voor de individuele plekken en meldt deze als gemiddelde waarden en standaarddeviaties. </li></ol></li><li> Data Analyse en Display <ol><li> Plot van de gegevens in 2D met behulp van een grijswaarden of kleur regeling om de relatieve activiteit aan te geven. Doe dit with Excel of Sigmaplot zoals hier getoond. Ook stelt een grafiek van de verdeling van de standaarddeviaties van de herhaalde experimenten om de kwaliteit van de gegevens te analyseren. </li><li> Vergelijken en de nauwkeurigheid van de herkenning van elke rest in het substraat peptide weer kwantitatief bereken de relatieve voorkeur van de PKMT voor elk aminozuur op positie i x door discriminerende factor D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Waar v i is de snelheid van methylatie van de peptidevariant uitvoeren aminozuur ik op positie x en &lt;v j ≠ i&gt; is de gemiddelde snelheid van de methylatie van alle 19 peptiden met een ander aminozuur j ≠ i op positie x (met inbegrip van de wildtypesequentie). OPMERKING: De discriminatie factor omschreven dit afhangt van de achtergrondniveau. Als slechts één rest wordt aanvaard in een bepaalde positie met een achtergrond van 3%, een discriminatiefactor 32.3 wordt verkregen. Geen voorkeur op een positie leidt tot een discriminatie factor van 0. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li>
<li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep%3A+thinking+outside+the+histone+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li>
<li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li>
<li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhosphoSite%3A+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li>
<li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li>
<li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li>
<li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li>
<li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li>
<li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+arrays+on+cellulose+support%3A+SPOT+synthesis%2C+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li>
<li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li>
<li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li>
<li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li>
<li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+application+of+peptide+arrays%3A+quo+vadis+SPOT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+EuropeanJournal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li>
<li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).</li>
<li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li>
<li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7%2F9+protein+lysine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).</li>
<li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistr.%2C+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).</li>
<li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scansite+2.0%3A+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li>
<li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+%28CDR%29%3A+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li>
<li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+synthesis%3A+observations+and+optimizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pept.+Res%22%5BJournal%5D)">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li>
<li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li>
<li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li>
<li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

SPOT synthese zoals hier beschreven is een krachtige methode om eiwit-eiwit interactie plaatsen in kaart en onderzoekt de substraatherkenning van peptide modificerende enzymen. Echter, SPOT-synthese nog steeds bepaalde nadelen, want hoewel de peptiden gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze worden gerapporteerd aan meer dan 90% zuiverheid 21 hebben dit moeilijk te bevestigen telkens. Derhalve resultaten te worden overgenomen door andere werkwijzen bijvoorbeeld gebruik eiwitdomeinen of gezuiverde peptiden gesyn...

In de laatste twee decennia, verschillende rapporten het belang aangetoond van post-translationele modificaties (PTM) in cellulaire ontwikkeling en verschillende ziekten zoals kanker, maar onlangs eiwit lysine methylatie heeft ontpopt als een ander vitaal PTM. Terwijl aanvankelijk histon lysine methylering bleek een essentiële chromatine merk zijn latere werk toonde ook lysine methylatie van verschillende non-histon-eiwitten 1-4. De sequentiële overdracht van methylgroepen van S-adenosyl-L-methionine de ε-aminogroep van lysineresten wordt gekatalyseerd door een familie van enzymen genaamd Protein Lysine methyltransferase (PKMTs) dat meer dan 60 eiwitten in het menselijk genoom. PKMTs werden oorspronkelijk ontdekt als histon-modificerende enzymen die specifiek lysine residuen methyleren maar later rapporten aangetoond dat zij ook kunnen methyleren niet-histon-eiwitten 5. Tot nu werden ongeveer 5000 lysine methylatie locaties die op verschillende proteïnen 6 </sup&gt;, maar de enzymen verantwoordelijk voor deze wijziging zelden beschouwd. Een reden hiervoor is dat de specificiteit van meest PKMTs niet uitgebreid onderzocht. Daarom is het herhaaldelijk gebeurt dat nieuwe substraten van PKMTs worden ontdekt. Het ontbreken van een gedetailleerde kennis van het substraat specificiteit van PKMTs belemmert begrip van hun biologische functie en rol. Om de specificiteit van een PKMT in detail te onderzoeken, moet de methylering percentages vele peptidesubstraten die verschillen in één of enkele aminozuren worden gemeten en vergeleken, die idealiter geschiedt middels peptide arrays. Op basis van de verkregen specifieke profielen, kunnen mogelijke substraten van PKMTs worden geïdentificeerd die verder kunnen worden onderzocht. Peptide arrays worden veel gebruikt hulpmiddelen voor biochemische analyse van antilichamen, peptide modificerende enzymen en in kaart brengen van eiwit-eiwit interactie plaatsen (antilichaam-antigeen, receptor-ligand) 7-9. Enkele honderden peptiden zijn nodig voor such toepassingen. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor peptidesynthese, waaronder peptidesynthese op hars wordt zeer algemeen gebruikt, maar heeft beperkingen op doorvoer en is relatief duur. Deze problemen werden opgelost met de introductie van de SPOT-synthesewerkwijze van Frank en collega 10. Werkwijze SPOT synthese laat synthese van honderden peptiden in parallel en gemiddeld is goedkoop in vergelijking met hars synthese. De peptiden gesynthetiseerd op cellulose membraan kan direct worden gebruikt voor diverse toepassingen of peptiden kunnen worden afgesplitst van het membraan en gebruikt als vrije peptiden in oplossing assays of peptide microarrays 10-13 bereiden. SPOT-synthese is een variant van de vaste fase peptidesynthese, die een cellulose membraan als een vaste drager gebruikt en gebruikt de standaard Fmoc-chemie 10-13. Vandaar de synthese van peptideketens begint bij het C-terminale uiteinde en verloopt naarhet N-terminale uiteinde in tegenstelling tot de biologische synthese van ribosomen. Cellulose membranen worden gefunctionaliseerd voor bevestiging van de eerste geactiveerde aminozuren (Fig. 1). De SPOT methode is gebaseerd op de sequentiële afgifte van geactiveerde aminozuren in een druppel oplosmiddel gedefinieerde vlekken op het membraan met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem. De druppel vloeistof wordt afgegeven aan het poreuze membraan vormt daar een cirkelvormige natte plek, die later fungeert als een open reactor voor chemische reacties in peptidesynthese. De vlekgrootte wordt bepaald door het gedoseerde volume en de absorptiecapaciteit van het membraan, wordt een veelvoud van dergelijke plaatsen gerangschikt als arrays. De schaal van de synthese correleert met de spotgrootte en de belastbaarheid van het membraan. De afstand tussen de spots en de dichtheid arrays worden beheerd door het variëren van de vlekgroottes. Cellulose membraan heeft verscheidene voordelen zoals vaste fase peptidesynthese, is goedkoop, tolerant voor de chemieALS in peptidesynthese stabiel in waterige oplossingen en gemakkelijk te hanteren. Daarnaast zijn hydrofiele aard maakt het voor verscheidene biologische testsystemen. SPOT synthese kan handmatig worden uitgevoerd of geautomatiseerd (voor 1000 van peptiden) afhankelijk van het vereiste aantal peptiden. Een volledig geautomatiseerde SPOT synthesizer van Intavis (Köln, Duitsland) wordt gebruikt voor onze toepassingen. Het maakt de synthese van peptiden in verschillende hoeveelheden en verschillende lengte. Lineaire peptiden regelmatig gesynthetiseerd met 15 tot 20 aminozuren lang, bovendien peptiden van maximaal 42 aminozuren kunnen ook worden bereid door stapsgewijze synthese 14,15. Echter, het verhogen van het aantal aminozuren leidt tot een vermindering van de totale koppelingsopbrengsten, die de kwaliteit van de peptiden beïnvloedt. Vanwege de kleine hoeveelheid peptiden per vlek, de producten zijn vaak moeilijk te zuiveren en de kwaliteit van de afzonderlijke peptiden niet gemakkelijk worden beoordeeld. Daarom zijn de resultaten verkregen uit SPOT Peptide arrays worden bevestigd hetzij peptiden gesynthetiseerd door standaard werkwijzen in grotere schaal, die kan worden gezuiverd en volgens de normen peptidesynthese of door het synthetiseren van de eiwitten die het gewenste peptide sequenties geanalyseerd. Toch vonden we de SPOT synthese zeer betrouwbaar te zijn en leidt doorgaans reproduceerbaar te zijn. SPOT synthese niet beperkt tot aminozuren, diverse commercieel verkrijgbare gemodificeerde aminozuren kan ook worden gebruikt voor synthese proteïnogene, waardoor peptiden te modificeren vóór en na de uiteindelijke splitsing van de zij keten beschermingsgroep en bovendien het laat ook incorporatie van gefosforyleerd, gemethyleerd of geacetyleerd aminozuren 11. Geïmmobiliseerde peptidebibliotheken gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze kan direct worden gebruikt voor vele biologische en biochemische assays. We gebruikten peptide arrays omvattende 300-400 peptiden aan de substraatspecificiteit van PKMTs onderzoeken. Voor enzymatische wijzikation, worden de peptide arrays geïncubeerd met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl- 3H] -AdoMet in een geschikte buffer. De methylering van de desbetreffende substraat wordt geanalyseerd door de enzymatische overdracht van het radioactief gemerkte methylgroepen van AdoMet het peptidesubstraat door autoradiografie (Fig. 3). Door deze procedure het peptide arrays mogelijk de studie van methylering van verschillende peptide- substraten tegelijk. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat alle peptiden gemethyleerd in competitie, zodanig dat gedurende de lineaire fase van de methylering kinetiek, de relatieve methylering van elk peptide is evenredig met de katalytische snelheidsconstante gedeeld door de dissociatie constante (k cat / K D) van het enzym voor de betreffende peptidesubstraat. Daarom wordt de hoeveelheid radioactiviteit opgenomen in elke plek direct gecorreleerd met de enzymatische activiteit voor de specifieke peptide. DeResultaten van een peptide-array methylering experiment, kan het specifieke profiel van de PKMT worden bepaald en op basis van deze nieuwe substraten kan worden gegrond. Peptide arrays kan de snelle en kostenefficiënte validatie van de methylering van nieuwe substraten op de peptide-niveau. Hiervoor worden arrays voorbereid dat de voorspelde roman substraten samen met gewijzigde peptiden met een Ala in plaats van Lys op het doel bezienswaardigheden, evenals de positieve en negatieve controle peptiden bevatten. Tenslotte kunnen de nieuwe substraten worden bereid eiwitten met mutanten, waarbij het doel Lys veranderd naar Ala en de methylering kan worden bevestigd op het eiwitniveau. Afhankelijk van de resultaten, dit wordt gevolgd door biologische onderzoeken naar mogelijke rol van de methylering van de nieuw beschreven eiwitsubstraten.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide Peptide Synthese</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Ontvlambaar, Toxisch</td></tr><tr><td>Piperidine &ge;99% voor peptidesynthese</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Ontvlambaar, Toxisch, corrosief</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetaat )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N,N&rsquo;-Diisopropylcarbodiimide purum &ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Ontvlambaar, Toxisch, corrosief</td></tr><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Ontvlambaar, Toxisch, corrosief</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Ontvlambaar, Toxisch</td></tr><tr><td>Dichloormethaan &ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidon</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Gederivatiseerde cellulosemembraan</td><td>Intavis AG Keulen</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxisch, corrosief</td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumwaterstofcarbonaat</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaatpellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxisch, Ontvlambaar</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG Keulen</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM hoge prestatiefilm</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix-software</td><td>TotalLab</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases met behulp van spot peptide arrays

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylering is een nieuwe post-translatie modificatie en is geïdentificeerd verschillende histon en niet histon eiwitten, waar het speelt cruciale rol in celontwikkeling en vele ziekten. Circa 5000 lysine methylatie sites werden geïdentificeerd op verschillende eiwitten, die door enkele tientallen eiwit lysine methyltransferases zijn ingesteld. Dit suggereert dat elke PKMT methyleert meerdere eiwitten echter tot nu toe slechts één of twee substraten geïdentificeerd voor verscheidene van deze enzymen. Om dit probleem aan te pakken, hebben we geïntroduceerd peptide array gebaseerde substraat specificiteit analyses van PKMTs. Peptide arrays zijn krachtige instrumenten om de specificiteit van PKMTs karakteriseren omdat methylatie van diverse ondergronden met verschillende sequenties kunnen worden getest op een array. We gesynthetiseerd peptide arrays op cellulosemembraan met behulp van een Intavis SPOT synthesizer en de specificiteit van de verschillende PKMTs geanalyseerd. Op basis van de resultaten voor een aantal van deze enzymen, nieuwe substrates konden worden geïdentificeerd. Bijvoorbeeld voor NSD1 door gebruik peptide arrays hebben we aangetoond dat het methyleert K44 van H4 plaats van de gerapporteerde H4K20 en bovendien H1.5K168 is het substraat sterk de voorkeur boven de eerder bekende H3K36. Vandaar peptide arrays zijn krachtige tools om biochemisch karakteriseren de PKMTs.

Peptide arrays werden met succes gebruikt om biochemisch karakteriseren de specificiteit van PKMTs, en verschillende nieuwe histon en niet-histon substraten van PKMT werden geïdentificeerd door deze aanpak 5,16-19. Het definiëren van de juiste substraat spectrum van een PKMT (of een enzym) is een essentiële stap op weg naar begrip van de moleculaire mechanisme en cellulaire functies. Als voorbeeld van de toepassing van het peptide SPOT matrix methylering methode worden de resultat...

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de substraatspecificiteit van eiwit-lysinemethyltransferases of PK mt's te onderzoeken. Dit wordt bereikt door identificatie van een initieel substraat en bereiding van peptidearrays met verschillende varianten van dit substraat die enkele aminozuuruitwisselingen op verschillende posities bevatten. Als tweede stap wordt de peptidearray geïncubeerd met de PKMT in aanwezigheid van een radioactieve methylgroepdonor, wat detectie van peptidemethylering mogelijk maakt door overdracht van radioactiviteit naar de overeenkomstige peptidespot.Vervolgens wordt de array blootgesteld aan een röntgenfilm en kwalitatief geanalyseerd om de methyleringsactiviteit bij elk van de peptiden te bepalen. En om het specificiteitsprofiel van de PKMT te definiëren, tonen de resultaten welke aminozuren in het substraatpeptide cruciaal zijn voor zijn methylering door de PKMT. Het grote voordeel van deze techniek of bestaande methoden zoals methylering van individuele peptiden is dat een aantal verschillende peptiden in één experiment op een kosteneffectieve manier kan worden getest.Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in het eiwitlysmethyleringsveld te beantwoorden, zoals specificatie van voorheen onbekende nieuwe substraten van PK mtss. Dus deze methode kan inzicht geven in de specificiteit van PK mts. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals eiwitkinasen, andere eiwitmethode, transferasen of add to transferasen.Ik kreeg het idee voor deze methode toen ik bekend raakte met de mogelijkheid om grote aangepaste peptidearrays tegen redelijke kosten te bereiden met behulp van peptidespotsynthese. Om deze procedure te beginnen, ontwerp peptidesequenties voor de synthese met behulp van de multi pep spotter-software. Voer de peptidesequenties in als een lettercode met elke letter die het specifieke aminozuur definieert volgens deze pre swell, de amino peg gefunctionaliseerde spotmembraan in end, end dimethylformamide of DMF gedurende 10 minuten. Wanneer u klaar bent, plaatst u de natte membraan op het spotsynthesizerkader zonder luchtbellen of rimpels.Laat de membraan volledig drogen gedurende ten minste 10 minuten voordat u het syntheseprogramma start. Was de membraan drie keer met 100% ethanol om de amidebinding te genereren met de vrije aminogroep op de membraan. Activeer de carboxygroep van het binnenkomende aminozuur door DIC en ethylhydroxyaminosinoacetaat toe te voegen aan de aminozuurderivaat.Na activering, spot de gewenste volumes van geactiveerde aminozuren op de amino peg gefunctionaliseerde membraan met behulp van de programmeerbare robot. Herhaal de vorige stap drie keer om een betere koppeling van het eerste geactiveerde aminozuur te garanderen. Na incubatie van de membraan gedurende 20 minuten, was deze met DMF om ongekoppelde aminozuren te verwijderen na droging en blokkering van de vrije aminogroepen.Was de membraan vier keer met DMF en incubeer vervolgens met 20% piperine in DMF gedurende 20 minuten om de FM-beschermingsgroep te verwijderen. Na het wassen en drogen van de membraan, herhaal de spotting- en F MOC-verwijderingsstappen tot de gewenste peptidelengte is bereikt. Na de laatste F MOC-groep D-bescherming, was de membraan met DMF en 100% ethanol.Behandel vervolgens de membraan met 0,02% broomfenolblauw in DMF gedurende minimaal vijf minuten totdat deze volledig blauw wordt. Na het wassen en drogen van de membraan, verwijdert u deze uit de synthesizer en plaatst u deze in een chemisch resistente doos. Behandel het met 20 tot 25 milliliter van een zijketen D-beschermingsmengsel, bestaande uit 95% trichloroazijnzuur om de zijketenbeschermingsgroepen te spalten en scavengeerreagentia om de aminozuurzijketens te beschermen tegen modificatie.Na ervoor te hebben gezorgd dat het diepe beschermingsmengsel de membraan bedekt, sluit u de doos volledig en incubeert u deze gedurende één tot twee uur met zacht schudden, gevolgd door incubatie. Was de membraan zes keer met 20 tot 25 milliliter dichloromethaan gedurende twee minuten. Na twee keer wassen met 100% ethanol, droogt u de membraan een nacht in een droogkast.Vervolgens pre-incubeert u de peptidearraymembraan in een verzegelde plastic zak met de respectieve methyleringsbuffer zonder enzym en amet met radioactief gelabelde methylgroep gedurende 10 minuten, gooit u de pre-incubatiebuffer weg en incubeert u de membraan in acht milliliter methyleringsbuffer die de respectieve PKMT bevat gedurende één tot twee uur. Gooi vervolgens de methyleringsbuffer in een radioactief afvalcontainer en was de peptidearrays vijf keer met 20 milliliter buffer die 100 millimolar ammoniumbicarbonaat en 1% STS bevat gedurende vijf minuten om het gebonden eiwit te verwijderen. Na het weggegooien van de laatste wasbuffer in de radioactieve afvalcontainer, incubeert u de membraan gedurende vijf minuten in 10 milliliter versterkingsoplossing.Gooi vervolgens de versterkingsoplossing in de radioactieve afvalcontainer voor organische oplosmiddelen. Sluit de peptidearray af in een plastic zak en plaats deze in een auto radiografiecassette. Plaats de auto radiografiefilm op het peptide in een donkere kamer.Sluit vervolgens de cassette voorzichtig. Na het belichten van de film bij min 80 graden Celsius, ontwikkelt u deze om de resultaten te analyseren. Vang tenslotte het beeld een paar keer met verschillende belichtingstijden om verzadiging van sterk gemethyleerde peptidesubstraten te voorkomen.Een voorbeeld van een methyleringsreactie van een peptidearray met NSD een wordt hier getoond. De horizontale as vertegenwoordigt de sequentie van het peptide en in de verticale richting. Het gewijzigde aminozuur wordt aangegeven met methylering met nsd, één toont aan dat het specifiek werkt op H drie K 36 en herkent drie tot vier aminozuurresiduen aan beide zijden van de doel lysine consolidatie van de drie peptidearray-experimenten van NSD een wordt hier getoond.Ongeveer 85%van de peptiden vertoont standaardafwijkingen kleiner dan plus of minuut 20%en meer dan 97%van de peptiden vertoont standaardafwijkingen kleiner dan plus of minuut 30%De berekende discriminatiefactorgegevens toont aan dat NSD een aromatische residuen prefereert op de minuut t

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Capture Verbindingen zijn trifunctionele kleine moleculen om de complexiteit van het proteoom te verminderen door functionele omkeerbare klein molecuul-eiwit interacties, gevolgd door foto-crosslinking en zuivering. Hier gebruiken we een Capture Compound...

Profilering van methyl-en andere S-Adenosyl- L-Homocysteine-bindende eiwitten door Capture Compound-massaspectrometrie (CCMS)

We presenteren een methode voor het gebruik van MALDI massaspectrometrie en reductieve methylatie chemie op veranderingen in de lysine-methylatie te kwantificeren.

Toepassing van MassSQUIRM voor kwantitatieve metingen van Lysine demethylase activiteit

This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody's specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Dit manuscript beschrijft methodes voor het toepassen van peptide microarray technologie op specificiteit profilering van antilichamen die histonen herkennen en hun post-translationele modificaties.

Analyse van Histone Antilichaam Specificiteit Met Peptide Microarrays

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Dit artikel beschrijft een monstervoorbereidingsmethode op basis van warmte-inactivatie om endogene peptiden te behouden die post-mortem degradatie voorkomen, gevolgd door relatieve kwantificering met behulp van isotopische etikettering plus LC-MS.

Monstervoorbereiding en relatieve kwantificering met behulp van reductieve methylering van amines voor peptidomics-studies

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Leer de SPOT-methode voor peptide-arrays om de substraatspecificiteit van eiwit-lysine-methyltransferases te analyseren. Deze techniek identificeert kritieke aminozuren en helpt bij het begrijpen van biologische functies.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Meer video's verkennen