Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Het algemene doel van het volgende experiment is om de substraatspecificiteit van eiwit-lysinemethyltransferases of PK mt's te onderzoeken. Dit wordt bereikt door identificatie van een initieel substraat en bereiding van peptidearrays met verschillende varianten van dit substraat die enkele aminozuuruitwisselingen op verschillende posities bevatten. Als tweede stap wordt de peptidearray geïncubeerd met de PKMT in aanwezigheid van een radioactieve methylgroepdonor, wat detectie van peptidemethylering mogelijk maakt door overdracht van radioactiviteit naar de overeenkomstige peptidespot.

Vervolgens wordt de array blootgesteld aan een röntgenfilm en kwalitatief geanalyseerd om de methyleringsactiviteit bij elk van de peptiden te bepalen. En om het specificiteitsprofiel van de PKMT te definiëren, tonen de resultaten welke aminozuren in het substraatpeptide cruciaal zijn voor zijn methylering door de PKMT. Het grote voordeel van deze techniek of bestaande methoden zoals methylering van individuele peptiden is dat een aantal verschillende peptiden in één experiment op een kosteneffectieve manier kan worden getest.

Deze methode kan helpen om een sleutelvraag in het eiwitlysmethyleringsveld te beantwoorden, zoals specificatie van voorheen onbekende nieuwe substraten van PK mtss. Dus deze methode kan inzicht geven in de specificiteit van PK mts. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals eiwitkinasen, andere eiwitmethode, transferasen of add to transferasen.

Ik kreeg het idee voor deze methode toen ik bekend raakte met de mogelijkheid om grote aangepaste peptidearrays tegen redelijke kosten te bereiden met behulp van peptidespotsynthese. Om deze procedure te beginnen, ontwerp peptidesequenties voor de synthese met behulp van de multi pep spotter-software. Voer de peptidesequenties in als een lettercode met elke letter die het specifieke aminozuur definieert volgens deze pre swell, de amino peg gefunctionaliseerde spotmembraan in end, end dimethylformamide of DMF gedurende 10 minuten. Wanneer u klaar bent, plaatst u de natte membraan op het spotsynthesizerkader zonder luchtbellen of rimpels.

Laat de membraan volledig drogen gedurende ten minste 10 minuten voordat u het syntheseprogramma start. Was de membraan drie keer met 100% ethanol om de amidebinding te genereren met de vrije aminogroep op de membraan. Activeer de carboxygroep van het binnenkomende aminozuur door DIC en ethylhydroxyaminosinoacetaat toe te voegen aan de aminozuurderivaat.

Na activering, spot de gewenste volumes van geactiveerde aminozuren op de amino peg gefunctionaliseerde membraan met behulp van de programmeerbare robot. Herhaal de vorige stap drie keer om een betere koppeling van het eerste geactiveerde aminozuur te garanderen. Na incubatie van de membraan gedurende 20 minuten, was deze met DMF om ongekoppelde aminozuren te verwijderen na droging en blokkering van de vrije aminogroepen.

Was de membraan vier keer met DMF en incubeer vervolgens met 20% piperine in DMF gedurende 20 minuten om de FM-beschermingsgroep te verwijderen. Na het wassen en drogen van de membraan, herhaal de spotting- en F MOC-verwijderingsstappen tot de gewenste peptidelengte is bereikt. Na de laatste F MOC-groep D-bescherming, was de membraan met DMF en 100% ethanol.

Behandel vervolgens de membraan met 0,02% broomfenolblauw in DMF gedurende minimaal vijf minuten totdat deze volledig blauw wordt. Na het wassen en drogen van de membraan, verwijdert u deze uit de synthesizer en plaatst u deze in een chemisch resistente doos. Behandel het met 20 tot 25 milliliter van een zijketen D-beschermingsmengsel, bestaande uit 95% trichloroazijnzuur om de zijketenbeschermingsgroepen te spalten en scavengeerreagentia om de aminozuurzijketens te beschermen tegen modificatie.

Na ervoor te hebben gezorgd dat het diepe beschermingsmengsel de membraan bedekt, sluit u de doos volledig en incubeert u deze gedurende één tot twee uur met zacht schudden, gevolgd door incubatie. Was de membraan zes keer met 20 tot 25 milliliter dichloromethaan gedurende twee minuten. Na twee keer wassen met 100% ethanol, droogt u de membraan een nacht in een droogkast.

Vervolgens pre-incubeert u de peptidearraymembraan in een verzegelde plastic zak met de respectieve methyleringsbuffer zonder enzym en amet met radioactief gelabelde methylgroep gedurende 10 minuten, gooit u de pre-incubatiebuffer weg en incubeert u de membraan in acht milliliter methyleringsbuffer die de respectieve PKMT bevat gedurende één tot twee uur. Gooi vervolgens de methyleringsbuffer in een radioactief afvalcontainer en was de peptidearrays vijf keer met 20 milliliter buffer die 100 millimolar ammoniumbicarbonaat en 1% STS bevat gedurende vijf minuten om het gebonden eiwit te verwijderen. Na het weggegooien van de laatste wasbuffer in de radioactieve afvalcontainer, incubeert u de membraan gedurende vijf minuten in 10 milliliter versterkingsoplossing.

Gooi vervolgens de versterkingsoplossing in de radioactieve afvalcontainer voor organische oplosmiddelen. Sluit de peptidearray af in een plastic zak en plaats deze in een auto radiografiecassette. Plaats de auto radiografiefilm op het peptide in een donkere kamer.

Sluit vervolgens de cassette voorzichtig. Na het belichten van de film bij min 80 graden Celsius, ontwikkelt u deze om de resultaten te analyseren. Vang tenslotte het beeld een paar keer met verschillende belichtingstijden om verzadiging van sterk gemethyleerde peptidesubstraten te voorkomen.

Een voorbeeld van een methyleringsreactie van een peptidearray met NSD een wordt hier getoond. De horizontale as vertegenwoordigt de sequentie van het peptide en in de verticale richting. Het gewijzigde aminozuur wordt aangegeven met methylering met nsd, één toont aan dat het specifiek werkt op H drie K 36 en herkent drie tot vier aminozuurresiduen aan beide zijden van de doel lysine consolidatie van de drie peptidearray-experimenten van NSD een wordt hier getoond.

Ongeveer 85%van de peptiden vertoont standaardafwijkingen kleiner dan plus of minuut 20%en meer dan 97%van de peptiden vertoont standaardafwijkingen kleiner dan plus of minuut 30%De berekende discriminatiefactorgegevens toont aan dat NSD een aromatische residuen prefereert op de minuut t