Name: Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Leer een ex vivo model van oligodendrocyt-gerichte CD8+ T-cellaanvallen in acute hersenschijven. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar neuronale schade en apoptose mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 naar S.G.M. ME3283/2-1 naar S.G.M.) en door Innovatieve Medische Onderzoek, Münster (I-BI111316, SB en SGM).

Alle experimenten met muizen moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de respectieve institutionele dier zorg en gebruik commissie. 1. Algemene opmerkingen voor Muis Experimenten <ol><li> Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat de toegang tot voedsel en water ad libitum. OPMERKING: Het is belangrijk om voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen gebruiken omdat immunologische patronen kunnen variëren met leeftijd en geslacht. </li></ol> 2. Bereiding en activering van OVA-specifieke CD8 + T-cellen (OT-I) <ol><li> Voer stimulering van OT-I T-cellen zoals hierna 5 dagen eerder beschreven bereiding hersencoupes. OPMERKING: 5 x 10 5 geactiveerde effector CD8 + OT-I-T-cellen (CD8 + T-cellen van transgene muizen herkennen alleen OVA 257-264 peptide in de context van MHC-I-moleculen) nodig per segment De concentratie 5 x 10 5 gekozen experimentally een optimale men een goede cel-cel interacties bevorderen nadat de cellen beginnen te migreren in het segment en, tegelijkertijd, de hoeveelheid cellen niet te hoog om een overreactie waardoor cel tellen 8,18 induceren. </li><li> Bereid het medium voor kweken OT-I T-cellen. Supplement 500 ml DMEM met 5% foetaal kalfsserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 1% niet-essentiële aminozuren en 25 ug / ml gentamicine. Bewaar het bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Verwijder de milt van OT-I transgene muizen als per referentie 16. Zet ze in de voorbereide medium. </li><li> Genereer enkele celsuspensie door stampen milten door een 70 urn zeef en centrifugeer suspensie bij 300 xg gedurende 5 min, 4 ° C. </li><li> Incubeer celsuspensie met 5 ml ammonium- chloride-kalium (ACK) buffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) gedurende 5 minuten om rode bloedcellen te lyseren. </li><li> Stoppen incubatiop 10 ml medium en centrifugeer opnieuw zoals hierboven beschreven. </li><li> Verdunde celsuspensie in middelgrote en bereken nummers. Plate cellen bij een dichtheid van 3 x 10 7 cellen / putje in een 12-well plaat en prime ze door incubatie met OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) en interleukine 2 (IL-2) (500 IE / ml) 5 dagen. </li><li> Na 4 dagen, voeg IL-2 in een concentratie van 500 IE weer / ml. </li><li> Na stimulatie, zuiveren OT-I T-cellen uit celsuspensie door een negatieve selectie gebaseerd muis CD8 + T-cell isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant. Zuivering is gebaseerd op de uitputting van alle niet-CD8 + cellen met een cocktail van antistoffen tegen CD4, CD 11 b, CD 11 c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC klasse II, Ter-119 en TCRγ / δ die vervolgens verwijderd met behulp van magnetische kolommen voor de elutie van het gezuiverde CD8 + T-cellen. OPMERKING: Kritische stappen in deze proceduopnieuw worden aangegeven door de fabrikanten: het is belangrijk dat de reactie omvat slechts enkele cellen vanwege de aanwezigheid van klonten de kolom tijdens de elutiestap kunnen blokkeren; het tellen van de cellen voor het toevoegen van de Byotin cocktail is belangrijk voor de mate van zuiverheid van het monster en de procedure moet worden uitgevoerd op ijs onspecifieke bindingen antilichaam minimaliseren. </li></ol> 3. Voorbereiding van de Acute Brain Slices en co-cultuur met OT-I T-cellen <ol><li> Voor de bereiding van acute hersenschijfjes 19 bereiden placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing met 200 mM sucrose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2PO 4, 10 mM MgSO4, 0,5 CaCl2 en 10 mM dextrose en kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 24 mM NaHCO3, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM dextrose. Stel de pH van elke oplossing om 7.35 door using NaOH. Voor het instellen van de pH van ACSF dient oplossing borrelen met een mengsel van 95% O2 en 5% CO2. </li><li> Pre-koelen oplossingen. </li><li> Verdoven 8-10 weken oude muizen (bijvoorbeeld C57BL / 6 als controle of transgene ODC-OVA muizen 17 met inhalatie met 5,0% isofluraan, 5,0% halothaan of Injecteer 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine via ip Wait anesthesie en gebruik een teen knijpen om het niveau van anesthesie beoordelen en onthoofden ze tegelijk. Euthanaseren de muizen per institutionele Animal Care en gebruik commissie criteria voor euthanasie. </li><li> Zet de muis in het ventrale positie. Desinfecteren en sagittally snijden hoofdhuid. Open het schedelbot saggitaal, snel te verwijderen van de hersenen met behulp van een schep en plaats deze op het bord van een vibratome door het gebruik van lijm. </li><li> Vul het bord met de voorbereide placedine ijskoude fysiologische zoutoplossing. </li><li> Snijd 300 micrometer coronale plakjes met de vibratome. OPMERKING: Deze procedure is wetenn om levensvatbare intact weefsel exemplaren die geschikt is voor functionele cellulaire studies binnen een tijdsinterval van ten minste 8 uur 19-21 opleveren. Immers, na deze periode, al beginnen na 6 uur, het preparaat blijkt verminderde kwaliteit, namelijk de ontwikkeling van het basis- en functionele eigenschappen zoals actiepotentiaal generatie en voortplanting. </li><li> Na het snijden, overdragen één schijfje meteen in elk putje van een 12-wells plaat gevuld met ACSF. </li><li> Voeg zorgvuldig 5 x 10 5 OT-I T-cellen per schijfje. </li><li> Incubeer plakjes tot 8 uur in een incubator (37 ° C, 5% CO2). </li><li> Na de incubatieperiode, oogst plakjes en insluiten ze met behulp van oktober samengestelde weefsel-tek en vries ze in vloeibare stikstof. Bewaar ze bij -20 ° C voor verdere histologische studies om bijvoorbeeld evalueren neuronale structuur (bijvoorbeeld met behulp van anti-MAPII of anti-synaptophysine antilichamen) of apoptose (bijvoorbeeld met anti-caspase-3-antilichamen en anti-anti NeuNorganen) volgens standaard procedures. </li></ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
<li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transected+neurites%2C+apoptotic+neurons%2C+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li>
<li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li>
<li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansions+of+CD8%28%2B%29+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li>
<li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li>
<li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+brain-infiltrating+CD8%2B+T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li>
<li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+multiple+sclerosis%3A+a+new+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li>
<li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+and+neuronal+damage%3A+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li>
<li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li>
<li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%28%2B%29+T+cell+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li>
<li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%2B+T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121(2013).</li>
<li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li>
<li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Verschillende dierlijke modellen zijn beschreven in de afgelopen decennia de pathologische kenmerken van inflammatoire demyeliniserende ziekten als MS pakken. In vivo muis en ratmodellen worden wijd gebruikt om pathofysiologie van de ziekte na te bootsen, namelijk analyse van de gevolgen van demyelinisatie en remyelinisatie processen en vermengde afleveringen van ontstekingen en neurodegeneratie. Toch alleen een ex vivo benadering maakt het mogelijk om de exacte onderliggende mechanismen te ontleden. <...

De dood van oligodendrocyten en vernietiging van de myelineschede, vergezeld van verlies van neuronen en axonen, zijn typische pathologische bevindingen in grijze-stof-laesies bij personen die lijden aan multiple sclerose (MS)1,2. Corticale laesies kunnen tot nu toe worden onderverdeeld in drie verschillende subtypen2: subpiale, intracorticale en leukocorticale laesies. In vergelijking met witte-stof-plaques worden infiltraten gekenmerkt door een overheersing van CD8+ T-cellen, wat wijst op hun mogelijke doorslaggevende rol bij ontstekingen in de grijze stof3. Verder kunnen oligoclonale expansies in bloed, cerebrospinale vloeistof (CSF) en binnen ontstekingslaesies worden gevonden voor CD8+ T-cellen zelf4-6.
In overeenstemming hiermee wordt aangenomen dat CD8+ T-cellen specifiek kunnen zijn voor verschillende myeline-eiwitten7,8. Inderdaad worden CD8+ T-cellen gevonden in de buurt van oligodendrocyten en myelinescheden9,10 die MHC I-expressie vertonen11 en daarom verantwoordelijk kunnen zijn voor het verlies van de myelineschede. Dit proces wordt vaak gezien samen met uitgebreide ‘‘collaterale’’ neuronale en axonale schade in de grijze stof van het centrale zenuwstelsel (CZS)1,2. In feite wordt directe en indirecte dood van oligodendrocyten en neuronen geïnduceerd door CD8+ T-cellen via twee verschillende mechanismen: (i) zwelling en ruptuur van de celmembraan als gevolg van de vorming van cytotoxische granulen na de afgifte van perforines en granzymen en (ii) binding aan de Fas-receptoren of blootstelling van FasL op hun oppervlak8,12,13.
Er zijn verschillende typen diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen van de genoemde processen te bestuderen. In dit opzicht kunnen geprimede CD8+ T-cellen die specifiek zijn voor autoantigenen met geïnduceerde expressie in CZS-gliacellen, zoals oligodendrocyten of astrocyten, adoptief worden overgedragen om vervolgens ‘‘collaterale’’ neuronale en axonale dood in de grijze stof te analyseren14,15. Het uitvoeren van dergelijke in vivo experimenten is een grote hulp om sommige pathofysiologische aspecten van MS na te bootsen, maar deze aanpak is niet geschikt om de onderliggende mechanismen en de kinetiek van axonale schade en neuronale apoptose op te lossen.
Om deze beperkingen te overwinnen, werd een ex vivo aanpak ontwikkeld om de mechanismen en de tijdsverloop van neuronale celdood na een door CD8+ T-cellen veroorzaakte aanval op oligodendrocyten te bestuderen. Omdat alleen oligodendrocyten en dus de productie van myelinescheden door immuuncellen zouden moeten worden aangevallen, worden MHC-klasse-I-beperkte, ovalbumine (OVA)-reactieve OT-I T-cellen gebruikt16. Deze cellen worden vervolgens overgebracht naar herfsneden verkregen van muizen die selectief OVA tot expressie brengen in oligodendrocyten (ODC-OVA muizen)17.

<table><tbody><tr><td>12-Well plate</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutaan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m zeef</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>calciumchloride</td></tr><tr><td>CD8+-isolatiekit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucose</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>warm in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>foetaal kalfsserum</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>kaliumchloride</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>kaliumwaterstofcarbonaat</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>magnesiumsulfaat</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>natriumchloride</td></tr><tr><td>NaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>natriumwaterstoffosfaat</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>natriumwaterstofcarbonaat</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>natriumhydroxide</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>ammoniumchloride</td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuur</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>ovalbumine</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

een ex vivo model van een oligodendrocyte gericht t-cell attack in acute brain slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

De dood van oligodendrocyten, vergezeld door vernietiging van neuronen en axonen, zijn typische histopathologische bevindingen in corticale en subcorticale grijze-stoflesies bij inflammatoire demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS). Bij deze aandoeningen worden voornamelijk CD8+ T-cellen van veronderstelde specificiteit voor myeline- en oligodendrocyte-gerelateerde antigenen aangetroffen, zodat neuronale apoptose in grijze-stoflesies mogelijk een neveneffect van deze cellen is. Er zijn verschillende soorten diermodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen van de genoemde pathofysiologische processen te bestuderen. Echter, hoewel ze sommige aspecten van MS nabootsen, is het onmogelijk om het exacte mechanisme en de tijdsafhankelijkheid van ‘’collaterale’’ neuronale celdood te onderscheiden. Om dit te aanpakken, laten we hier een protocol zien om de mechanismen en tijdsreactie van neuronale schade na een oligodendrocyte-gerichte CD8+ T-cel aanval te bestuderen. Om alleen de myeline-omhulling en de oligodendrocyten te targeten, worden in vitro geactiveerde oligodendrocyte-specifieke CD8+ T-cellen overgebracht naar acuut geïsoleerde hersenslices. Na een gedefinieerde incubatieperiode kan myeline- en neuronale schade worden geanalyseerd in verschillende regio's van belang. Potentiële toepassingen en beperkingen van dit model zullen worden besproken.

Na incubatie van hersencoupes met oligodendrocyten gerichte CD8 + T-cellen, oligodendrocyten en neuronen ondergaan apoptose (figuur 2A en 1C respectievelijk). Histologische tekenen van apoptose (bijvoorbeeld caspase-3, Tunel) worden vroegst waargenomen na 3 uur incubatie. Incubatietijd mag niet langer dan 8 uur zijn om een ​​goede kwaliteit van het preparaat en reproduceerbare resultaten te garanderen. Apoptotische cellen kan worden gevonden over de slice met overwicht in gemyelinise...

Om mechanismen van demyelinisatie en neuronale apoptose in corticale laesies van inflammatoire demyeliniserende aandoeningen aan te pakken, worden verschillende diermodellen gebruikt. We beschrijven hier een ex vivo benadering door gebruik te maken van oligodendrocyten-specifieke CD8+ T-cellen op herfsneden, wat resulteert in oligodendrogliale en neuronale dood. Potentiële toepassingen en beperkingen van het model worden besproken.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Het algemene doel van deze procedure is om een oligodendrocyte-gerichte aanval van CD acht T-cellen ex vivo te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst CD acht T-cellen te isoleren uit de milten van muizen. De tweede stap is het voorbereiden van acute hersensneden.Vervolgens worden de hersneden gedurende maximaal zes uur geïncubeerd met de geactiveerde CD acht T-cellen, gevolgd door cryo-conservatie en histologische studies. Uiteindelijk kan immunofluorescence-microscopie worden gebruikt om de locatie van T-cellen evenals de apoptose van oligodendrocyten te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken zoals experimentele auto-immuun encefalomyelitis, een diermodel van milde sclerose is dat neuronbeschadiging.De gevolgde CD acht-gemedieerde aanval op oligodendrocyten kan in detail worden bestudeerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-immunologie, zoals immuuncel-trafficking in weefsel of degeneratie van neuronen en oligodendrocyten. Het demonstreren van de procedure zal Alexander Hamman zijn, een afstudeerstudent uit mijn lab Vijf dagen voor het bereiden van de hersneden stimuleer de OT een T-cellen om de cellen te activeren.Volg eerst het geziene protocol om de milten van verschillende O OT een transgene muizen te verwijderen. Verzamel de milten in vers bereid, gesupplementeerd medium. Maak vervolgens een enkelcellig suspensie door de milten door een 70 micron zeef te malen en centrifugeer de suspensie gedurende vijf minuten bij 300 Gs op vier graden Celsius.Na de centrifugatie, giet het supernatant af en suspendeer de cellen in vijf milliliter ammoniumchloride-kaliumbuffer. Laat de cellen vijf minuten bij vier graden Celsius in deze buffer incuberen om de rode bloedcellen te lyseren. Beëindig vervolgens de reactie door 10 milliliter gesupplementeerd medium bij vier graden Celsius toe te voegen.Verzamel vervolgens de cellen opnieuw door ze naar beneden te centrifugeren zoals eerder. Verzamel vervolgens de gepelletiseerde cellen, resus, suspendeer ze in medium en tel ze wanneer hun dichtheid bekend is. Breng de cellen over naar een 12-wellplaat met 30 miljoen cellen per putje.Voeg vervolgens medium met OVA en interleukine twee toe en incubeer de cellen gedurende vier dagen. Voeg na vier dagen meer interleukine twee toe met een concentratie van 500 eenheden per milliliter. Incubeer vervolgens de cellen nog een dag.Gebruik nu een CD acht-positieve T-cellisolatiekit om de O OT een T-cellen uit de gekweekte cellen te zuiveren. Kort gezegd. Niet-CD acht-positieve cellen worden afgenomen door gebruik te maken van een cocktail van antilichamen en worden gescheiden met behulp van een magnetische kolom. Zorg ervoor dat het monster op ijs wordt voorbereid en dat de reactie alleen betrekking heeft op enkele cellen, zodat de kolom niet geblokkeerd raakt.Tel vervolgens de cellen. Voor dit experiment. Heb acht tot tien weken oude transgene, O-D-C-O-V-A, muizen en leeftijd en geslacht overeenkomstige C 57 zwarte zes controles.Huis de muizen zoals gebruikelijk in een ziektevrij milieu met vrije toegang tot voedsel en water. Nadat een muis is verdoofd, gebruik een rugvingetje om de mate van verdoving te beoordelen en euthaniseer hem onmiddellijk. Plaats nu een muis ventraal en desinfecteer de hoofdhuid en onthoofd hem.Snij vervolgens snel de hoofdhuid, open de schedel en schep de hersenen eruit. Bevestig de hersenen op hun plaats met lijm en breng ze over naar een vibram-plaat. Vul vervolgens de plaat met ijskoude fysiologische zoutoplossing.Eenmaal voorbereid, snij 300 micron plakjes. Breng de plakjes over naar individuele putjes van een 12- of 24-wellplaat gevuld met A CSF. Voeg vervolgens voorzichtig een half miljoen OT een T-cellen toe aan elke plak.Een half miljoen geactiveerde cellen gepersonaliseerd biedt goede cel-cel interactie. Eenmaal geplaatst, beginnen de cellen te migreren in de plak. Tegelijkertijd is de hoeveelheid cellen niet te hoog om een overreactie te veroorzaken, dus enkelceltelling is haalbaar.Na het laden van alle putjes, incubeer de co-cultuur gedurende maximaal acht uur. Na de incubatie, oogst de plakjes en bedden ze in OCT-verbinding. Vries vervolgens de ingebedde plakjes in vloeibare stikstof en bewaar ze bij min 20 graden Celsius voor verdere histologische studies. Na incubatie van hersneden met oligodendrocyte-gerichte CD acht-positieve T-cellen ondergingen oligodendrocyten apoptose.Ook neuronen ondergingen apoptose. De vroegste tekenen van apoptose werden gezien na drie uur incubatie en waren robuust na acht uur. Apoptose werd meer opgemerkt in O-D-C-O-V-A cellen die aan OT een T-cellen werden blootgesteld dan in enige andere conditie.Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden toegepast om vragen te beantwoorden over het migratiegedrag van T-cellen of de betrokkenheid van ionkanalen in uw eigen lab ptosis. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u acute hersneden kunt bereiden en hoe u deze kunt co-cultiveren met T-cellen.

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an ex vivo technique to induce brain cell death mediated through cytotoxic CD8+ T cells. Upon obtaining brain slices, activated oligodendrocyte-directed CD8+ T cells are transferred onto the slices to target the myelin sheath and oligodendrocytes. Post-incubation, the damage to myelin and neuronal death can be assessed histologically in the regions of interest.

An Ex Vivo Technique to Induce Neuronal Death via Oligodendrocyte-Specific CD8+ T Cells

Source: Kennedy, L. H., et. al. Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the imaging of oligodendrocyte mitochondria in organotypic mouse brain slices. The slice is placed inside a bath chamber with continuous fluid circulation and controlled temperature. After setting up various parameters of the confocal microscope, time-lapse images of mitochondria...

Confocal Imaging of Mitochondrial Movement within Oligodendrocytes in Organotypic Brain Slice Cultures

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Globoïde cellen zijn een typerend pathologisch kenmerk van de ziekte van Krabbe, een leukodystrofie waarvoor momenteel geen effectieve langetermijntherapie bestaat. We hebben een celkweekmodel ontwikkeld om de intrinsieke biologie en het pathogene potentieel van geactiveerde microglia en hun transformatie in globoïde cellen te bestuderen.

Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Organotypic hippocampal segment culturen (OHSC) vormen een in vitro model dat de in vivo situatie heel goed simuleert. Hier beschrijven we een op vibratome gebaseerde verbeterd snijden protocol om te verkrijgen van hoge kwaliteit segmenten voor gebruik bij de beoordeling van het neuroprotectieve potentieel van nieuwe stoffen of het biologisch gedrag van de tumorcellen.

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

Myelinating oligodendrocyten bevorderen snelle actiepotentiaal propagatie en neuronale overleving. Hier beschreven is een protocol voor Oligodendrocyt-specifieke expressie van fluorescente proteïnen in organotypic hersenen segmenten met latere time-lapse beeldvorming. Verder is wordt een eenvoudige procedure voor het visualiseren van onbevlekt myeline gepresenteerd.

Visualisatie en Live beeldvorming van Oligodendrocyte organellen in Organotypic hersenen plakjes met behulp van Adeno-associated Virus en confocale microscopie

Presenteren we een methode die kan nadere inzichten in de vroege gebeurtenissen onderliggende neurodegeneratie en gebaseerd op de gevestigde ex-vivo hersenen techniek, combineren de voordelen van in vivo en in vitro experimenten. Bovendien heeft het een unieke kans voor directe vergelijking van behandelde en onbehandelde groep in hetzelfde anatomische vlak vertegenwoordigt.

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Microglia, de resident immuuncellen van de hersenen, reageren snel met de morfologische veranderingen voor wijzigingen van hun omgeving. Dit protocol wordt beschreven hoe u twee-foton microscopie te bestuderen van de aantrekkingskracht van microglial processen naar serotonine of ATP in acute hersenen plakjes van muizen.

Twee-foton beeldvorming van Microglial processen attractie naar ATP of serotonine in Acute hersenen plakjes

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Leer een ex vivo model van oligodendrocyt-gerichte CD8+ T-cellaanvallen in acute hersenschijven. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar neuronale schade en apoptose mogelijk.

Een Ex vivo Model van een Oligodendrocyte gericht T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Meer video's verkennen