Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Het doel van deze procedure is om biomoleculen zoals DNA of eiwitten gelabeld met organische Fluor te internaliseren en visualiseren in levende micro-organismen met behulp van een methode gebaseerd op elektroporatie. Dit wordt bereikt door eerst elektrocompetente cellen te incuberen met fluorescerend gelabelde biomoleculen voordat ze worden overgebracht naar een elektroporatie vete. Door een hoge spanning aan te leggen over de vete, zullen tijdelijke porieformaties op zowel de celwand als het celmembraan biomoleculaire diffusie in de cellen mogelijk maken.

Vervolgens worden de cellen in een rijk medium geïncubeerd om ze te laten herstellen voordat de overtollige niet-geïnternaliseerde biomoleculen worden verwijderd. Uiteindelijk worden de cellen overgebracht naar een lage fluorescentie minimale voedingsbodem en vervolgens wordt een glazen dekglas overgelegd om een glazen agro-sandwich te vormen. Uiteindelijk wordt essentie microscopie gebruikt om de locatie, diffusie patroon en dynamische eigenschappen van de gelabelde biomoleculen in de levende cellen te analyseren.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de beperkingen van live cel beeldvorming realiseerden. Vanwege de snelle flikkering van fotofluorescente eiwitten zoals GFP, redeneerden we dat door levende cellen te laden met biomoleculen gelabeld met organische fluorokracht, we transplantaties in levende micro-organismen zouden maken. De belangrijkste voordelen van deze kracht zijn helderheid, fotostabiliteit en kleine omvang.

Vervolgens hopen we de lokalisatie en diffusie van DNA of eiwitten in hun native omgevingen op veel langere tijdschalen te kunnen volgen, wat zou overeenkomen met veel belangrijke biologische processen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden, zoals micro-injectie, is dat het ook kan worden toegepast op micro-organismen die kleiner zijn dan de diameter van typische micro-injectienaalden. Een extra voordeel van elektroporatie is dat een groot aantal cellen tegelijkertijd kan worden geladen met fluorescerende biomoleculen en parallel kan worden gevisualiseerd, waardoor elektroporatie een bijzonder eye-throughputtechniek wordt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de diffusie- en dynamische gedragingen van fluorescerend gelabelde biomoleculen in vivo, kan het ook worden toegepast in andere contexten, zoals op elektrode biomoleculen die niet gelabeld zijn, maar het kan bijvoorbeeld een fysiologische respons uitlokken wanneer het wordt geïnternaliseerd door de cel. Om aros pads voor bacteriën of schimmels voor fluorescentiemicroscopie te construeren, begint u met het bereiden van een twee x lage fluorescentie media, smelt vervolgens een oplossing van 2% aros in gedistilleerd water met een lab-microgolfapparaat. Voeg een overeenkomstig volume van de hete HA-roos toe aan het medium en pipetteer het mengsel voorzichtig op en neer. Vermijd het ontstaan van bubbels en pipetteer onmiddellijk ongeveer 200 microliters van het arosmengsel op een standaard microscoopdekglas.

Laat het dekglas een minuut op de werkbank liggen bij kamertemperatuur totdat de gel is gestold of plaats tijdelijk een tweede schoongemaakt dekglas over de verse pad en oefen voorzichtig druk uit vanaf de bovenkant om de eierroos te laten zakken, beginnend met een voorraad van fluorescerende biomoleculen bereid in een buffer met lage ionensterkte. Breng maximaal vijf microliters van de biomoleculen over in een 20 microliter aliquot van competente bacteriën of 50 microliters van competente schimmelcellen. De hoeveelheid fluorescerende biomoleculen die met de cellen wordt geïncubeerd, correleert rechtstreeks met de hoeveelheid biomoleculen die per cel wordt geïnternaliseerd.

Na elektroporatie, incubeer het mengsel maximaal 10 minuten op ijs. Selecteer tegelijkertijd een elektroporatie vete met de juiste elektrodeafstand en koel op ijs. Breng het celmengsel over in de voorgekoelde vete.

Tik voorzichtig een paar keer op de vete om eventuele luchtbellen uit de oplossing te verwijderen. Verwijder eventueel vocht van de vete met een papieren handdoek en plaats de vete in de electro ator. Pas een hoge spanningspuls toe op de cellen net na dit proces.

Controleer of de tijdconstante die op de electro ator wordt weergegeven tussen de vier en zes milliseconden ligt. Lagere tijdconstanten zijn vaak te wijten aan de aanwezigheid van overtollig zout of luchtbellen in de qve, en het kan de opname van biomoleculen in de cellen verminderen of volledig remmen. Hogere spanningspulsen verbeteren de celbelasting, maar kunnen de cellevensvatbaarheid onmiddellijk na elektroporatie ook beïnvloeden.

Voeg 500 microliters rijk medium toe en breng de cellen over in een verse 1,5 milliliter buis. Laat het celmembraan herstellen door de bacteriën bij 37 graden Celsius of gisten bij 29 graden Celsius gedurende twee tot 10 minuten te incuberen. Na opname van biomoleculen en herstel van de groei, centrifugeer de cellen gedurende een minuut in een voorgekoelde centrifuge bij vier graden Celsius en gooi de supine-agent Reese weg.

Suspensieer het pellet in 500 microliters buffer en herhaal de centrifugatie en verwijdering en bufferresuspenderingsprocessen. Drie keer meer. Deze wasstappen verwijderen alle sporen van niet-geïnternaliseerde biomoleculen uit de celsuspensie.

In het geval van gelabelde eiwitinternalisatie wordt een extra zuiveringsstap uitgevoerd door de celsuspensie te pipetteren in een 1,5 milliliter buis voorzien van een 0,22 micron membraanfilter bovenop. Scheid de cellen van de buffer door centrifugatie terwijl u ervoor zorgt dat er voldoende vloeistof boven het filter achterblijft om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en gooi de doorstromende fractie weg. Voeg onder het filter 500 microliters vers PBS toe over de cellen en herhaal de combinatie van een centrifugatie gevolgd door vers PBS-additie.

Twee keer meer. Voer een laatste centrifugatie uit bij 3.300 G gedurende een minuut. Om de vorige PBS-was te verwijderen, resuspendeer de cellen met 150 microliters PBS.

Verwijder tenslotte het bovenste dekglas van de eerder gemaakte aros pad. Laad de cellen op de pad door 10 microliters van de celsuspensie druppelsgewijs te pipetteren. Na het plaatsen van een nieuw schoongemaakt dekglas bovenop de aros pad, zijn de sandwich cellen nu klaar voor fluorescentiemicroscopie.</