Name: Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Leer fluorescerende biomoleculen te internaliseren in levende micro-organismen via elektroporatie voor in vivo visualisatie. Deze methode maakt real-time analyse van diffusiepatronen en dynamiek mogelijk in bacteriën en gist.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Stephan Uphoff voor de discussies. 
R.C. werd ondersteund door Linacre College, Oxford University. A.P. werd ondersteund door de German Academic Exchange Service (DAAD), de German National Academic Foundation en EPSRC. M.S. werd ondersteund door de Wellcome Trust. A.N.K. werd ondersteund door een UK BBSRC-subsidie (BB/H01795X/1) en een European Research Council Starter-subsidie (261227).

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li>
<li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+coming+of+age%3A+from+concepts+to+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li>
<li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHT-ChIP-seq%3A+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124(2013).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li>
<li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+syringe%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li>
<li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li>
<li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001(2010).</li>
<li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li>
<li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li>
<li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veel parameters kunnen worden gevarieerd tijdens cell elektroporatie en data acquisitie afhankelijk van het biologisch systeem van belang en de precieze aard van het experiment (celniveau of single-molecule analyse). Wanneer bijvoorbeeld electroporating DNA in bacteriën, 0,25-5 pmol gelabelde dsDNA fragmenten leidt tot een lage internalisatie efficiëntie, die rechtstreeks werkende moleculen detectie (bijv., Zonder fotobleken vooraf). Boven 5 pmol dsDNA, cellen hebben de neiging om zwaar worden geladen, een regime beter geschikt voor single-cell analyse. Alle gelabelde DNAs ook eerder gel gezuiverd om elk spoor van vrije kleurstof te verwijderen (niet-gereageerde fluorofoor) vanaf het DNA voorraadoplossing. Trouwens, mogelijke problemen met DNA degradatie, met name voor smFRET experimenten, kunnen worden aangepakt met behulp van DNA&#39;s met onnatuurlijke nucleïnezuren, of motieven die exonuclease-toegankelijke termini te beschermen, zoals haarspeld lussen. Een andere adjustable parameter elektroporatie is de veldsterkte toegepast tijdens elektroporatie. Lage veldsterkte (~ 1 kV / cm) leidt tot een lage beladingsgraad geschikt voor single-molecule studies. Hogere sterktes veld (tot 1,8 kV / cm) zal het laden efficiëntie te verhogen; echter, er een omgekeerde correlatie tussen veldsterkte en levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie (zie figuur 4). Ter referentie, een normale veldsterkte voor bacteriën en gist elektroporatie is -1,5 kV / cm. De tijdconstante vertegenwoordigt de lengte van het verval, is een handige parameter te volgen, omdat de tijdconstante daalt zodra er vonken verschijnsel optreedt in de cuvette. Onder normale instellingen, moet de tijdconstante van meer dan 4 ms; lagere waarden zal leiden tot een lage beladingsgraad of zelfs niet-geladen beschadigde cellen. De meeste electroporators bieden andere vrijheidsgraden (zoals &quot;pulse truncatie&quot; of &quot;pulsvorm&quot;), die kan worden aangepast om af te stemmen beidecel laden en levensvatbaarheid. We pasten deze methode zowel bacteriën en gisten, maar soortgelijke procedures ook de internalisatie van gelabelde biomoleculen in zoogdiercellen mogelijk met geschikte electroporator instellingen omdat hun membraan eigenlijk minder complex (enkele lipide dubbellaag) en aangezien elektroporatie is al gebruikt met dergelijke cellen 21. Wanneer internaliserend gemerkte eiwitten, heeft al vrij kleurstof uit het gemerkte eiwit stock oplossing vóór elektroporatie worden verwijderd. Vrije kleurstofmoleculen, vanwege hun kleinere afmetingen, kunnen worden geïnternaliseerd voorkeur de eiwitten van belang en zijn moeilijk te onderscheiden tijdens de data-analyse (ondanks hun verwachte snellere diffusie). Als richtlijn voor een monster van biologisch gelabeld eiwit geschikt voor elektroporatie, moet de hoeveelheid resterende vrije kleurstof minder dan 2% (gedetecteerd met fluorescentie scanning van een SDS-PAGE) 22. Dit proces is bijzonder belangrijk,zoals sommige moleculen kunnen kleven aan de buitenste membranen van geëlektroporeerd bacteriën of gist. In dit verband moet het negatieve controlemonster fluorescentie-intensiteit per cel duidelijk onder geëlektroporeerde cellen, idealiter zo laag als de autofluorescentie niveau van lege cellen (cellen die niet zijn geïncubeerd met elk fluorescent gelabelde biomoleculen of elektroporatie, figuur 2) weergegeven. Zoals met dsDNA, wordt de internalisatie efficiëntie van gelabelde eiwitten gekoppeld aan de hoogte van biomoleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand aan elektroporatie. Echter, andere parameters, zoals de grootte en lading, een rol spelen in internalisatie. Kleine eiwitten vertonen een hoge internalisatie efficiëntie, terwijl grotere eiwitten (tot 98 kDa) kunnen vervolgens worden geïnternaliseerd, maar met een lagere efficiëntie (figuur 5) 26. De isolelectric punt van het proteïne, potentiële interacties met de celmembraan en andere fysico-chemische parameters ookinvloed cel laden tijdens elektroporatie. Dientengevolge moeten gebruikers experimenten optimaliseren hun eigen systeem wetenschap dat een hoge beginconcentratie van gemerkt eiwit (&gt; 50 uM) de beste kans op succes geladen geven. Elektroporatie biedt ook een nieuwe tool te verstoren en te analyseren cellulaire functie door de invoering van eiwitten en andere biomoleculen in cellen (ofwel gemerkte of niet-gemerkte). De T7 RNA polymerase experimenten (Figuur 5C) aanwezig zo&#39;n voorbeeld van een experiment waarbij we een biomolecule die genexpressie veranderen in vivo middels elektroporatie kunnen introduceren. Bij het uitvoeren van enkel-molecuul fluorescentie experimenten wordt TIR belichting meestal de voorkeur boven andere verlichtingsmodi omdat daarmee de beste signaal-ruisverhouding prikkelen slechts fluoroforen binnen een dunne gedeelte boven het dekglaasje oppervlak (~ 100 nm). Maar beeldvorming gelabelde biomoleculen te diffunderen in levende micro-organismen kunnen rekatern dieper verlichting (tot 0,8 micrometer voor E. coli). Dieper verlichting wordt bereikt HILO modus toch een hoge signaal-ruisverhouding. Anderzijds, breed beeldveld is bijzonder belangrijk voor stapsgewijs fotobleken analyse, waarbij de gebruiker het schatten van het aantal geïnternaliseerde moleculen door fotobleken een volledig geladen cel met hoog laservermogen en de initiële cel fluorescentie-intensiteit te delen door het unitaire intensiteit geproduceerd door een enkel molecuul (één fotobleken stap, figuur 3). Widefield beeldvorming is ook vereist voor langdurige molecuul volgen om de diffunderende moleculen van interesse lokaliseren zelfs als de trajecten de gehele cell volume. In dit protocol presenteren we hoe elektroporatie, een standaardtechniek voor biologen en biochemici voor het afleveren van nucleïnezuren in cellen, is een eenvoudige werkwijze voor het afleveren fluorescerende biomoleculen in verschillende celtypen. This nieuw, high-throughput techniek biedt een unieke tool om gelabelde moleculen te observeren in hun eigen omgeving. Bovendien biomoleculen gemerkt met fluoroforen die een breed golflengtegebied, elektroporatie kunnen moleculen gemodificeerd met vele chemische groepen, zoals onnatuurlijke nucleotiden en aminozuren, metaal chelatoren, crosslinkers en kooien groepen leveren. Als het biologische systeem van belang is niet essentieel voor de celontwikkeling, kan het gen dat codeert voor het doeleiwit worden verwijderd (of aangereden), zodat de waargenomen na internalisatie eiwitten vertegenwoordigen alle (of de meeste) van het intracellulaire eiwit- . In wezen kan elektroporatie &quot;transplantatie&quot; de flexibiliteit van in vitro biologische conjugaten in levende cellen ten voordele inspanningen synthetische biologie, systeembiologie en in vivo single-molecule detectie.

De meeste studies fluorescentie binnen levende cellen afhankelijk proteïne fusies met fluorescente proteïnen (FP), zoals GFP 1. Deze fluorescerende labels laten onderzoeken van het aantal kopieën, diffusie patroon of lokalisatie van eiwitten die betrokken zijn bij processen zoals genexpressie of membraan transport 2-7. KP&#39;s bieden een hoge etikettering specificiteit, eenvoudige implementatie, en zijn verkrijgbaar in een grote voorraad van varianten met verschillende fotofysische en chemische eigenschappen 1. Echter, organische fluoroforen blijven de eerste keuze voor in vitro experimenten vanwege hun grotere photostability (tot 100 maal stabieler dan KP) 8,9, klein formaat (tot 100 maal kleiner volume dan FP) en gemak van intramoleculaire labeling (hoofdzakelijk door middel van cysteïneresten). Al deze factoren zijn met name belangrijk voor enkel-molecuul fluorescentie en FRET bestudeert 10. Verschillende internalisatie methoden combining de voordelen van biologische etikettering en in vivo detectie geïntroduceerd in het afgelopen decennium; Dergelijke werkwijzen hebben ofwel relatief grote polypeptiden markeringen (bijvoorbeeld TMP, halogeen of 20 kDa SNAP markeringen) 11-14, vereisen het gebruik van niet-natuurlijke aminozuren 15 of beperkt tot een enkele, grote membraan eukaryotische cellen (bijv. , schraap laden, spuit laden, micro-injectie) 16-19. Dit protocol beschrijft een nieuwe, eenvoudige en high-throughput internalisatie methode die koppels de voordelen van biologische fluoroforen met in vivo observatie. Om deze techniek te ontwikkelen wij elektroporatieprocedure vaak gebruikt om cellen te transformeren met plasmide DNA 20,21 om micro-organismen, zoals E. laden aangepast coli of S. cerevisiae met organisch label biomoleculen. Het protocol bestaat uit 4 stappen: incubatie van cellen met gelabelde biomoleculen,elektroporatie, cel herstel, en cel wassen om niet-geïnternaliseerde biomoleculen te verwijderen. Hier presenteren we deze elektroporatie protocol, alsook de cell imaging en gegevensanalyse processen celgebaseerde en enkel-molecuul fluorescentie bestuderen en FRET-signalen. Elektroporatie vertrouwt op het ontladen van een hoog voltage elektrische veld over een lage ionsterkte celsuspensie voorbijgaande membraan poriën waardoor biomoleculen cellen kan komen (figuur 1) 20,21 vormen. Net als bij transformatie van bacteriën of gist met plasmide-DNA, cellen voorafgaand aan elektroporatie hun electrocompetency waarborgen worden voorbereid. Deze procedure bestaat uit verscheidene wasstappen met water, verhoogt het membraan permeabiliteit en verlaagt de ionische sterkte van de celoplossing boogvorming in de elektroporatie cuvette te voorkomen. In dit protocol kunnen cellen worden bereid zoals hieronder beschreven (zie PROTOCOL: 1,1) of gekocht van commerciële aanbieders. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> Figuur 1: Schematische weergave van de internalisatie protocol Van links naar rechts:. Voeg enkele microliters van gelabelde biomoleculen aan het monster van elektrocompetente cellen (dubbel-gemerkte DNA-fragmenten en bacteriën in dit voorbeeld); Incubeer 1 tot 10 minuten op ijs en naar een vooraf gekoelde elektroporatie cuvette; electroporate en voeg dan 0,5-1 ml rijk medium aan de cellen onmiddellijk na; incuberen bij 37 ° C (of de door het organisme temperatuur, bijvoorbeeld 29 ° C voor gist) laten de cellen te herstellen; voeren 5 wassen stappen om het overtollige niet-geïnternaliseerde gelabelde moleculen te verwijderen; resuspendeer de laatste pellet in 100-200 pi PBS-buffer en pipet 10 pi op een agarose pad; bedekken het pad met een gereinigd dekglaasje en beeld op een fluorescentie microscoop (in brede veld modus of HILO-modus). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Elektrocompetente cellen worden geïncubeerd met de gelabelde biomoleculen net voor elektroporatie, dat kan worden uitgevoerd met standaard electroporators in de meeste biochemische laboratoria. Onmiddellijk na elektroporatie worden cellen geïncubeerd in een rijk medium waardoor hun herstel voor het wassen (figuur 1). De overmaat van niet-geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen wordt eerst verwijderd door wassen in een buffer die een relatief hoge concentratie van zout en wat afwasmiddel (zie PROTOCOL: 3.3). De aanwezigheid van zout verstoort aspecifieke elektrostatische interacties gevormd door niet-geïnternaliseerde gemerkte biomoleculen die anders kunnen plakken op het buitenmembraan. Ook de aanwezigheid van detergens in de wasbuffer verstoort niet-specifieke hydrofobe interacties. Terwijl DNA internalisatie is eenvoudig (figuur 2), moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen bij het ​​internaliseren van gelabelde eiwitten met behulp van elektroporatie. Ten eerste, zou de voorraad monster van organisch gemerkt eiwit bevatten nog steeds een klein percentage van de vrije kleurstof. Gratis dye moleculen zijn veel kleiner dan eiwitten en kan daarom bij voorkeur te worden geïnternaliseerd. Om de overgrote meerderheid van de waargenomen geïnternaliseerde fluorescerende moleculen overeen met het eiwit van interesse, moet de initiële eiwitmonster minder dan ~ 2% bevatten vrije kleurstof (Figuur 5) 22. De overmaat van niet-geïnternaliseerde gelabelde eiwitten kunnen ook vasthouden aan de buitenste celmembraan na elektroporatie; Dit fenomeen eiwit specifiek en moet worden gecontroleerd bij elke nieuwe eiwit. Wij stellen verschillende opties die de verwijdering van niet-geïnternaliseerde eiwitten van de geladen celmonster mogelijk maakt (zie PROTOCOL: 3.3.3). Tenslotte worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een klein volume fosfaatbuffer en gepipetteerd op een agarose pad, zodat de weergave op een fluorescentie microscoop. Immobilisatie op agarose pads is een simple en efficiënte manier van beeldvorming van cellen op een dekglaasje zonder nadelige gevolgen voor hun integriteit. Het pad moet een low-fluorescentie kweekmedium bevatten. Cell imaging kan worden uitgevoerd in groothoek, totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of met behulp van HILO (hoogst geneigde en gelamineerd Optical Blad) microscopie. In de HILO configuratie, de laserstraal dringt dieper in het monster dan in TIRF, maar niet het gehele monster voor groothoek verlichten, waardoor een grotere signaal-ruisverhouding 23. Afhankelijk van het laservermogen en tijdsresolutie gebruikt, kan geïnternaliseerd biomoleculen worden geteld (met behulp van stapsgewijze fotobleken analyse, figuur 3), gelokaliseerde of bijgehouden 24-28. Internalisatie van dubbel gemerkte constructen met een FRET paar fluoroforen maakt de kwantificering van FRET zowel eencellige of single-molecule niveaus (Figuur 6). Verschillende parameters kunnen worden gevarieerdafhankelijk van de gewenste uitvoer en het biologische systeem bestudeerd. Ten eerste kan de hoeveelheid materiaal per cel geïnternaliseerd worden afgestemd door veranderen van de concentratie van gemerkte biomoleculen aan de cellen toegevoegd vóór elektroporatie (figuur 2). Elektroporatie veldsterkte zal ook zowel het laden efficiency en levensvatbaarheid van de cellen te beïnvloeden; zoals verwacht, terwijl de beladingsgraad toeneemt met toenemende veldsterkte, de levensvatbaarheid van geëlektroporeerde cellen afneemt (figuur 4A). Beide parameters kunnen worden gekwantificeerd door het opnemen van het percentage van geladen en delende cellen na elektroporatie. Dit levensvatbaarheid test in combinatie met fluorescentie beeldvorming controleert ook de waarneming van geïnternaliseerde biomoleculen in levende cellen en laten continue observatie over meerdere generaties (Figuur 4B). Kortom, dit protocol maakt de internalisering van fluorescent gelabelde DNA en eiwitmoleculen inE. coli of S. Cerevisiae 26. Individuele moleculen gelabeld met organische fluoforen kan worden gevolgd met een hoge tijdruimtelijk resolutie voor tijdschalen een orde van grootte meer dan KP&#39;s. Tenslotte is deze werkwijze geschikt groothoek, TIRF en confocale detectie en gepulste excitatie&#39;s, zoals ALEX (afwisselende laser excitatie 28,29).

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>of een andere commerciële of laboratorium electrocompetente bacteriën of gist.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>media met lage fluorescentie en rijke voedingsstoffen</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporation Apparatus&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>of een klassieke elektroporator voor transformatie van micro-organismen</td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology agarose</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>agarose met lage fluorescentie voor agarose pad</td></tr><tr><td>Microscope coverslips No 1.5 dikte</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>verwijder achtergronddeeltjes door de dia's 1 uur lang in een oven op 500 &deg;C te verwarmen</td></tr><tr><td>Single-molecule fluorescentiemicroscoop</td><td>Zelfgebouwd</td><td></td><td>beschreven in REFs</td></tr><tr><td>Lokalisatiesoftware</td><td>Op maat gemaakt, online beschikbaar</td><td></td><td>MATLAB en C++ softwarepakket dat kan worden aangepast voor lokalisatie-analyse.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trackingsoftware</td><td>Online beschikbaar</td><td></td><td>MATLAB implementatie door Blair en Dufresne.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

internalisatie en observatie van tl biomoleculen in levende micro-organismen via electroporatie

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

De mogelijkheid om biomoleculen in vivo te bestuderen is cruciaal voor het begrijpen van hun functie in een biologische context. Een krachtige aanpak omvat het fuseren van moleculen van belang met fluorescente eiwitten zoals GFP om hun expressie, lokalisatie en functie te bestuderen. GFP en zijn derivaten zijn echter aanzienlijk groter en minder fotostabiel dan organische fluoroforen die over het algemeen worden gebruikt voor in vitro experimenten, en dit kan het onderzoeksgebied beperken.
We hebben onlangs een eenvoudige, veelzijdige en hoog-doorvoer methode geïntroduceerd op basis van elektroporatie, die de internalisatie van biomoleculen gelabeld met organische fluoroforen in levende micro-organismen mogelijk maakt. Hier beschrijven we hoe elektroporatie te gebruiken om gelabelde DNA-fragmenten of eiwitten te internaliseren in Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae, hoe de hoeveelheid geïnternaliseerde moleculen te kwantificeren met behulp van fluorescentiemicroscopie, en hoe de levensvatbaarheid van geëlektroporeerde cellen te kwantificeren. Gegevens kunnen worden verzameld op het niveau van enkele cellen of enkele moleculen met behulp van fluorescentie of FRET. De mogelijkheid om niet-gelabelde moleculen te internaliseren die een fysiologisch waarneembaar antwoord in vivo uitlokken, wordt ook gepresenteerd. Ten slotte worden strategieën voor optimalisatie van het protocol voor specifieke biologische systemen besproken.

Monstervoorbereiding De verschillende stappen van het protocol worden als schema in figuur 1. Als voorbeeld vertegenwoordigen de belading van bacteriën dubbel gelabeld (donor en acceptor kleurstoffen) DNA-fragmenten. Representatieve resultaten voor DNA internalisering worden getoond in Figuur 2. Voor elke geëlektroporeerde monster werden gegevens voor lege cellen en niet-geëlektroporeerde cellen ook opgenomen (figuur 2). &quot;Lege cellen&quot; komen overeen met cellen noch geïncubeerd met fluorescerende biomoleculen noch geëlectroporeerd electrocompetente; de intensiteit van de fluorescentie kanaal weerspiegelt de autofluorescentie niveau onder identieke experimentele condities (laservermogen, tijdsresolutie, temperatuur, etc.). &quot;Non-geëlektroporeerde cellen&quot; (ook genoemd -EP, dwz minus EP) corresponderen met een negatieve controle waarin electrocompetente cellen werden geïncubeerd met fluorescerende biomolecules maar niet geëlectroporeerd. Deze niet-geëlektroporeerde cellen moet fluorescentie niveau gelijk aan de autofluorescentie van de lege cellen en significant lager dan de fluorescentie-intensiteit weergegeven loaded geëlektroporeerde cellen vertonen. Dit bevestigt de verwijdering van alle niet-geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen die zouden hebben gehandeld op grond van de buitenste celmembraan. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg" /> Figuur 2: Representatieve resultaten voor de internalisering van dsDNA gelabeld met verschillende fluoroforen in verschillende concentraties in bacteriën (AE) en gist (F) Van links naar rechts:. Wit-licht, fluorescentie en overlay afbeeldingen. - / + EP geeft incubatie met / zonder elektroporatie. Schaalbalken: 3 micrometer. A. Cy3B dsDNA, 10 pmol, E. coli. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol, E. coli. C. Alexa647 dsDNA, 5 pmol, E. coli. D. Cy3B dsDNA, 100 pmol, E. coli. E. ATTO647N dsDNA, 100 pmol, E. coli. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol, gist. Dit cijfer is aangepast uit referentie 26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Tellen van het aantal geïnternaliseerde biomoleculen per cel De procedure voor het schatten van het aantal geïnternaliseerde gelabelde biomoleculen per cel met fotobleken analyse wordt getoond in Figuur 3 en aanvullende film 2, samen met representatieve resultaten verkregen met verschillende concentraties gelabeld DNA. Cel laden efficiency toeneemt met het oorspronkelijke bedrag van bebroede gemerkt DNA, waardoor de gebruiker af te stemmen het aantal gelabelde moleculen per cel van een &quot;single-molecule&quot; niveau (&lt;10, Aanvullende Movie 2B) tot een &quot;ensemble&quot; niveau (&gt; 10 , Aanvullende Movie 2A). Een robuuste manier van het schatten van het percentage van de beladen cellen is to tel het aantal geëlektroporeerde cellen die een cel intensiteit boven de gemiddelde cel intensiteit van niet geëlektroporeerde cellen plus 3 maal de standaardafwijking (dwz Av (I-EP) + 3 * StdDev (I-EP) waarin Av = gemiddeld I = intensiteit per pixel, Std. Dev. = standaardafwijking en -EP = niet geëlektroporeerd) zoals getoond in figuur 3. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg" /> Figuur 3:. Het tellen van het aantal geïnternaliseerde moleculen met behulp van photobleaching analyse (A) Single-cell fotobleking analyse. Voorbeelden van fluorescentie-intensiteit TimeTraces (blauw: de ruwe gegevens; rood: fit;-openingen: WL en fluorescentie beelden van E. coli geladen met-ATTO647N gelabeld dsDNA voor en na het bleken). Top: single-step bleken evenement. Midden: cel met ± 3 moleculen tonen blekenen het knipperen. Onder: cel met&gt; 10 stappen met ten minste 10 moleculen (B) Histogram van éénfasige hoogte intensiteiten vanuit een geautomatiseerde stappen fitting algoritme van 57 cellen met minder dan 6 onderscheiden stappen.. Single-Gauss fit is gecentreerd op 11 ± 3 au, wat overeenkomt met een unitaire fluorfoor intensiteit van 8100 fotonen per seconde. Het sterretje geeft de bak verzamelen van alle stappen hoogten boven of gelijk 50 au (C) Histogram geïnternaliseerde moleculen per cel geëlektroporeerd met verschillende hoeveelheden ATTO647N dsDNA, berekend na de eerste fluorescentie-intensiteit te delen door het unitaire fluorofoor intensiteit. Van boven naar beneden: lege cellen (dat wil zeggen, niet geïncubeerd met fluorescerende moleculen en niet geëlectroporeerd), niet-geëlektroporeerde (maar geïncubeerd met fluorescerende moleculen, genaamd -EP), en geëlectroporeerd cellen geïncubeerd met 10 en 100 pmol dsDNA (naam + EP). Lege en niet-geëlektroporeerde cellen overeenkomenom autofluorescentie, terwijl geëlectroporeerd cellen vertonen een brede spreiding van geïnternaliseerde moleculen, met een hoger aandeel van zeer beladen cellen op 100 pmol (≥ 4 moleculen, zie-sterretje gemarkeerde bin). Internalisatie efficiëntie (fractie van cellen met Int.&gt; Betekenen + 3x Std. Dev. Van niet -EP monster) voor de 10 en 100 pmol monsters was 94% en 90%, respectievelijk. Gemiddeld aantal geïnternaliseerd moleculen per cel: 121 ± 106 moleculen voor 10 pmol dsDNA, en 176 ± 187 moleculen voor 100 pmol dsDNA. Instellingen: 100 ms belichting, groothoek verlichting. Schaalbalken: 1 urn. Dit cijfer is aangepast uit referentie 26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Cel laden en levensvatbaarheid Naast het veranderen van de hoeveelheid gemerkte biomoleculen aan de cellen toegevoegd voorafgaand aan elektroporatie, degebruiker kan afstemmen van de hoeveelheid geïnternaliseerd moleculen door te kiezen voor verschillende veldsterktes tijdens elektroporatie (Figuur 4, Aanvullende Film 1). Hogere sterktes veld leiden tot een grotere internalisatie efficiëntie, maar leiden tot een lichte daling van de levensvatbaarheid van de cellen. Voor eiwit internalisatie, kan het gebruik van een filtratie stap helpen bij het verwijderen van niet-geïnternaliseerde gelabelde eiwitten (zie 3.3.3.1.1). In dergelijke gevallen cel filtratie zorgt waargenomen fluorescente proteïnen inderdaad geïnternaliseerd in het bacteriële cytoplasma; We merken echter op dat de filtratie heeft ook een negatief effect op de levensvatbaarheid van de cellen (voor meer details, zie ref 22). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg" /> Figuur 4: Invloed van elektroporatie spanning op cel laden en levensvatbaarheid (A) Bar grafiek vertegenwoordigen van het effect van elektroporatie veldsterkte op laden effic.iency (rode balken) en de levensvatbaarheid van de cellen (groene balken). 84 ± 8% van de niet-geëlektroporeerde cellen (0 kV / cm) delen na 1 uur op een agarose pad bij 37 ° C. Onder dezelfde omstandigheden, 78 ± 3% en 49 ± 3% van de cellen geëlektroporeerd bij 0,9 kV / cm en 1,8 kV / cm respectievelijk delen na 1 uur. Voor beladingsrendement, 73 ± 8% van de cellen zijn geplaatst 0,9 kV / cm, terwijl 92 ± 6% van de cellen bij 1,8 kV / cm geladen. De fout balken geven de standaard afwijking van drie onafhankelijke metingen; meer dan 200 cellen werden geanalyseerd voor elk monster en elke herhaling. Gemiddelde beladingsrendement toeneemt met elektroporatie spanning aan de lichte koste van cellevensvatbaarheid. (B) celgebaseerde fluorescentiemetingen over meerdere generaties blijkt dat de totale fluorescentie-intensiteit evenredig is verdeelt tussen beide dochtercellen. Cell 1 en 2 verwijst naar het aantal cellen in het witte licht (links) en het fluorescentie bij t = 0. Scalebar: 1 micrometer). Dit cijfer is aangepast uit referentie 26. Eiwit internalisatie Representatieve resultaten voor eiwit internalisatie zijn in de figuren 5A &amp; B. Het is bijzonder belangrijk om zoveel mogelijk van de resterende vrije (niet omgezette) kleurstof uit het eiwit monster net vóór elektroporatie. In de voorbeelden in figuren 5A en B, de Cy3b gemerkte Klenow Fragment monster (Cy3b-KF, waarbij KF is het Klenow fragment van E. coli DNA polymerase I, 66 kDa) bevat 1% vrije verven; dergelijke kleurstof bijdrage aan de totale celbelasting verwaarloosbaar. Vergelijkingen van de geëlektroporeerde monster van belang met zowel de niet-geëlektroporeerde cellen (geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid gemerkt eiwit) alsook cellen geëlektroporeerd met de equivalente hoeveelheid vrije kleurstof vormen twee vereiste controles om te zorgen dat de waargenomen fluorescente moleculeninderdaad geïnternaliseerd gelabelde eiwitten. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg" /> Figuur 5: Eiwit internalisatie in levende bacteriën (A) Vertegenwoordiger fluorescentie overlay gebied van uitzicht.. Cellen geëlektroporeerd bij 1,4 kV voltage met 50 pmol RNAP ω subeenheid van een eiwit voorraadoplossing dat slechts 1% vrij Cy3b kleurstof bevatte. Niet-geëlektroporeerde (niet -EP) en lege cellen worden gedefinieerd als voorheen. Vrije kleurstof werd geïnternaliseerd in dezelfde concentratie als in de RNAP ω geëlektroporeerd monster. Imaging in breed modus, 532-nm excitatie bij 1 mW, 50 ms belichting. (B) Verspreiding van gecorrigeerde cellen gemiddelde intensiteiten monsters (A), gezien in verhouding tot de totale celtelling. Meer dan 400 cellen per monster werden gesegmenteerd. Dit cijfer is aangepast uit referentie 22. (C) internalisering van unlaBeled T7 RNA polymerase (T7 RNAP, 98 kDa) in elektrocompetente DH5a die de pRSET-EmGFP plasmide coderend Emerald GFP (EmGFP) onder controle van een T7 promoter. Links: Schematische assay. Midden: fluorescentie overlay. Rechts: histogrammen van cel-gebaseerde fluorescentie-intensiteiten voor de niet-geëlektroporeerde monster (boven) en cellen geïncubeerd en geëlectroporeerd met T7 RNAP (bodem); ongeveer 11% van de geëlektroporeerde cellen vertonen een hoge fluorescentie-intensiteit (fractie van cellen met Int.&gt; betekenen + 3x Std. Dev. van niet -EP monster) aangeeft uitdrukking van EmGFP. De sterretjes geven bakken verzamelen van alle intensiteiten boven of gelijk 1.100 au Schaalbalk: 3 micrometer. Dit cijfer is aangepast uit referentie 26. Figuur 5C toont een andere toepassing van eiwit elektroporatie. Hier, de geëlektroporeerde eiwit ongelabeld, maar zijn internalisatie veroorzaakt een waarneembare fluorescent respons. Dit experiment bevestigt de presence en functionaliteit van geëlektroporeerd eiwitten in het cytoplasma. Ongelabeld T7 RNA polymerase (98 kDa) werd geïnternaliseerd in E. coli stam DH5a met een plasmide dat codeert voor fluorescerend eiwit EmGFP onder de controle van een T7 promoter 26. Als het gen voor T7 RNA polymerase ontbreekt in DH5a, EmGFP expressie in onze experimenten vereist dat functionele T7 RNA polymerase in de cellen geïntroduceerd door elektroporatie (Figuur 5C). Na elektroporatie met 1 pmol T7 RNAP,&gt; 11% van de cellen (blauwe balk figuur 5C) vertoonde fluorescentie hoger dan de negatieve controle (geïncubeerd met dezelfde hoeveelheid T7 RNAP, maar niet geëlektroporeerd). Dit resultaat wordt dat een deel van het T7 RNAP moleculen geïnternaliseerd door elektroporatie behouden hun integriteit in vivo en hun beoogde functies in de cel cytoplasma. In vivo FRET op de single-moleculeen single-cell niveau Tenslotte wordt de opname en analyse van dubbel gemerkte moleculen in levende bacteriën getoond in Figuur 6 en aanvullende Film 3. fluorescent eiwit fusies zijn niet ideaal voor in vivo smFRET studies, de mogelijkheid om dubbel gelabelde biomoleculen leveren in levende cellen via elektroporatie is een van de grote troeven van deze methode. Figuur 6A presenteert eencellige FRET analyse van bacteriën geladen met verschillende FRET DNA-normen (met behulp van Cy3B en Atto647N fluoroforen als donor-acceptor FRET paar). De cellen worden geëlektroporeerd met 20 pmol van drie korte dubbel gelabelde dsDNA FRET normen schijnbare FRET efficiënties (E *) van 0.17, 0.48 en 0.86 in vitro (vooraf bepaalde 26). Alle DNA in cellen kan efficiënt (Figuur 6A, links) en de belangrijkste piek van elke single-cell E * distributie komt goed overeen met de in vitro resultaten (Figuur 6A, Rechts). In de tussen- en hoge FRET monsters celpopulaties met lagere E * dan verwacht worden waargenomen, waarschijnlijk door een combinatie van acceptor bleken en fotofysische inactiviteit variabele celbelading (dus variabel signaal-ruisverhouding) en DNA degradatie . <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg" /> Figuur 6:.. Representatieve resultaten eencellige en single-molecule FRET observatie in levende bacteriën Ensemble en smFRET studies in enkele bacteriën (A) Analyse van cellen geladen met 20 pmol elk van de drie DNA FRET normen vertonen laag (~ 0,17) tussenproduct (~ 0,48), en een hoog (~ 0,86) FRET (zoals gemeten met behulp van in vitro enkel-molecuul metingen; zie REF 26). Links: wit licht en groen / rood (FRET) fluorescentie overlay-beelden (Schaal bar: 3 micrometer). Voorbeelden van FRET waarden uit verschillende cellen worden aangegeven (wit). Tuig<html> ht (boven naar beneden):. ongecorrigeerde cel-gebaseerde FRET (E *) histogrammen voor donor alleen (donkergroen), laag (lichtgroen), tussenproduct (geel), en hoog (rood) FRET DNA-normen (B-D) In vivo smFRET. Cellen worden geladen met 0,25 pmol intermediaire FRET DNA (paneel B), 0,25 pmol high-FRET DNA (paneel C) en 5 pmol dubbel-gemerkte KF (paneel D). Linker kolom: groen / rode fluorescentie overlay van één frame voor en na de acceptor fotobleking. Middenkolom: tijd sporen overeenkomen met de molecule in de gele cirkel. FRET efficiëntie, donor emissie-intensiteiten, en acceptor emissie-intensiteiten zijn weergegeven in blauw, groen en rood, respectievelijk. Rechter kolom: FRET histogrammen van de donor alleen moleculen (groen) en donor-acceptor-moleculen (geel, rood en grijs) van 20 keer de sporen voor elk monster. Schaalbalken: 3 urn voor A, 1 urn voor B-D. Dit cijfer is aangepast uit referentie 26.208fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Om smFRET observeren in vivo voor DNA of eiwit monsters, kleine hoeveelheden (0,25 pmol) van intermediaire en hoge FRET DNA-normen (figuur 6B, C) ​​of 5 pmol van dubbel-gelabeld KF (Alexa647 / Cy3B fluoforen als FRET paar, figuur 6D) worden geëlektroporeerd in E. coli. Dergelijke concentraties tot vele cellen opgeladen met weinig (n = 1-10) gemerkte moleculen, die rechtstreeks lokalisatie, tracking en FRET controleren op afzonderlijke moleculen. Sommige diffunderen vrij, terwijl anderen immobiel verschijnen of verspreiden langzaam (Aanvullende Movie 3). TimeTraces van geïmmobiliseerde dubbel-gemerkte biomoleculen (figuur 6, midden) duren 1 tot 30 s en tonen de kenmerken van smFRET: anticorrelated veranderingen in de donor en acceptor fluorescentie bleken bij acceptor (bijvoorbeeld, t ~ 16 sec Figuur 6B middle ), gevolgd door enkelvoudigetweestaps donor bleken (bijvoorbeeld t ~, 19 sec Figuur 6B). FRET distributies gegenereerd uit dergelijke TimeTraces (Figuur 6, rechts) resulteren in een gemiddelde waarde, dat is in uitstekende overeenkomst met gepubliceerd in vitro studies 26,31,32. Deze resultaten vast te stellen de mogelijkheden voor kwantitatieve smFRET studies over geïnternaliseerde DNA en eiwitten, en suggereren dat eiwitten behouden hun integriteit en de structuur van elektroporatie en internalisatie (zoals ondersteund door de T7 RNAP internalisatie experimenten). Aanvullende Film 1:. Cellevensvatbaarheid Links: Wit licht beelden. Rechts: fluorescentie beelden. Geanimeerde GIF animatiefilm waarin de divisie na elektroporatie (1,8 kV / cm) van bacteriën geladen met 10 pmol Atto647 gelabelde DNA. Het totale schijnbare afname van fluorescentie door verdunning van gemerkt DNA op celdeling en ook gedeeltelijk het fotobleken die tijdens elkemeting. Aanvullende Movie 2: Cel-gebaseerde fotobleking studies A.. Representatief voorbeeld van een zwaar beladen cel (die&gt; 100 Atto647N gelabelde DNA moleculen). Wit licht beeld van de cel van belang (rode rechthoek) linksboven. Rechtsboven, film van de beladen cellen waaruit hun fluorescentievervaltijd gedurende enkele minuten. Bottom, tijd spoor van de totale fluorescentie-intensiteit verval van de cel van belang. Organische fluoroforen kunnen vertonen photobleaching levens 2 ordes van grootte hoger dan KP&#39;s (hier, ~ 41 sec voor Atto647N). B. Representatieve voorbeeld van een cel geladen met minder dan 10 gemerkte moleculen (3 in dit geval). Top, hetzelfde als het paneel A. Bottom, tijd spoor van de totale fluorescentie-intensiteit van de cel van belang tonen van enkele stap bleken en / of knipperende overeenkomt met enkele organische fluoroforen. De gemiddelde hoogte van deze stappen komt overeen met de single-molecule unitaire intensiteit (hier ~12 au) gebruikt voor het schatten van het oorspronkelijke aantal geïnternaliseerd moleculen per cel. Films onder continue rode laser excitatie bij 300 uW vermogen en 100 msec per frame. Aanvullende Movie 3: I n vivo single-molecule FRET Top:. Cellen geladen met 0,25 pmol high-FRET DNA (zoals in figuur 6C) voortdurend gecontroleerd op 50 ms per frame onder nTIRF verlichting met behulp van 1 mW groen (532 nm) laser. Elk frame is een groen / rood (FRET) fluorescentie overlay van elk kanaal. Verspreiding en immobiele rood (intact) en groene (enkelvoudig actief label) DNA-moleculen kunnen worden waargenomen. Onder: Tijd trace correspondeert met het molecuul in de gele cirkel. FRET efficiëntie, donor emissie-intensiteiten, en acceptor emissie-intensiteiten zijn weergegeven in blauw, groen en rood, respectievelijk. Anti-gecorreleerde acceptor bleken evenement (rood-voor-groen overgangen) komt overeen met de handtekening van de single-molecule FRET.

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Het doel van deze procedure is om biomoleculen zoals DNA of eiwitten gelabeld met organische Fluor te internaliseren en visualiseren in levende micro-organismen met behulp van een methode gebaseerd op elektroporatie. Dit wordt bereikt door eerst elektrocompetente cellen te incuberen met fluorescerend gelabelde biomoleculen voordat ze worden overgebracht naar een elektroporatie vete. Door een hoge spanning aan te leggen over de vete, zullen tijdelijke porieformaties op zowel de celwand als het celmembraan biomoleculaire diffusie in de cellen mogelijk maken.Vervolgens worden de cellen in een rijk medium geïncubeerd om ze te laten herstellen voordat de overtollige niet-geïnternaliseerde biomoleculen worden verwijderd. Uiteindelijk worden de cellen overgebracht naar een lage fluorescentie minimale voedingsbodem en vervolgens wordt een glazen dekglas overgelegd om een glazen agro-sandwich te vormen. Uiteindelijk wordt essentie microscopie gebruikt om de locatie, diffusie patroon en dynamische eigenschappen van de gelabelde biomoleculen in de levende cellen te analyseren.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we de beperkingen van live cel beeldvorming realiseerden. Vanwege de snelle flikkering van fotofluorescente eiwitten zoals GFP, redeneerden we dat door levende cellen te laden met biomoleculen gelabeld met organische fluorokracht, we transplantaties in levende micro-organismen zouden maken. De belangrijkste voordelen van deze kracht zijn helderheid, fotostabiliteit en kleine omvang.Vervolgens hopen we de lokalisatie en diffusie van DNA of eiwitten in hun native omgevingen op veel langere tijdschalen te kunnen volgen, wat zou overeenkomen met veel belangrijke biologische processen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken boven bestaande methoden, zoals micro-injectie, is dat het ook kan worden toegepast op micro-organismen die kleiner zijn dan de diameter van typische micro-injectienaalden. Een extra voordeel van elektroporatie is dat een groot aantal cellen tegelijkertijd kan worden geladen met fluorescerende biomoleculen en parallel kan worden gevisualiseerd, waardoor elektroporatie een bijzonder eye-throughputtechniek wordt.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de diffusie- en dynamische gedragingen van fluorescerend gelabelde biomoleculen in vivo, kan het ook worden toegepast in andere contexten, zoals op elektrode biomoleculen die niet gelabeld zijn, maar het kan bijvoorbeeld een fysiologische respons uitlokken wanneer het wordt geïnternaliseerd door de cel. Om aros pads voor bacteriën of schimmels voor fluorescentiemicroscopie te construeren, begint u met het bereiden van een twee x lage fluorescentie media, smelt vervolgens een oplossing van 2% aros in gedistilleerd water met een lab-microgolfapparaat. Voeg een overeenkomstig volume van de hete HA-roos toe aan het medium en pipetteer het mengsel voorzichtig op en neer. Vermijd het ontstaan van bubbels en pipetteer onmiddellijk ongeveer 200 microliters van het arosmengsel op een standaard microscoopdekglas.Laat het dekglas een minuut op de werkbank liggen bij kamertemperatuur totdat de gel is gestold of plaats tijdelijk een tweede schoongemaakt dekglas over de verse pad en oefen voorzichtig druk uit vanaf de bovenkant om de eierroos te laten zakken, beginnend met een voorraad van fluorescerende biomoleculen bereid in een buffer met lage ionensterkte. Breng maximaal vijf microliters van de biomoleculen over in een 20 microliter aliquot van competente bacteriën of 50 microliters van competente schimmelcellen. De hoeveelheid fluorescerende biomoleculen die met de cellen wordt geïncubeerd, correleert rechtstreeks met de hoeveelheid biomoleculen die per cel wordt geïnternaliseerd.Na elektroporatie, incubeer het mengsel maximaal 10 minuten op ijs. Selecteer tegelijkertijd een elektroporatie vete met de juiste elektrodeafstand en koel op ijs. Breng het celmengsel over in de voorgekoelde vete.Tik voorzichtig een paar keer op de vete om eventuele luchtbellen uit de oplossing te verwijderen. Verwijder eventueel vocht van de vete met een papieren handdoek en plaats de vete in de electro ator. Pas een hoge spanningspuls toe op de cellen net na dit proces.Controleer of de tijdconstante die op de electro ator wordt weergegeven tussen de vier en zes milliseconden ligt. Lagere tijdconstanten zijn vaak te wijten aan de aanwezigheid van overtollig zout of luchtbellen in de qve, en het kan de opname van biomoleculen in de cellen verminderen of volledig remmen. Hogere spanningspulsen verbeteren de celbelasting, maar kunnen de cellevensvatbaarheid onmiddellijk na elektroporatie ook beïnvloeden.Voeg 500 microliters rijk medium toe en breng de cellen over in een verse 1,5 milliliter buis. Laat het celmembraan herstellen door de bacteriën bij 37 graden Celsius of gisten bij 29 graden Celsius gedurende twee tot 10 minuten te incuberen. Na opname van biomoleculen en herstel van de groei, centrifugeer de cellen gedurende een minuut in een voorgekoelde centrifuge bij vier graden Celsius en gooi de supine-agent Reese weg.Suspensieer het pellet in 500 microliters buffer en herhaal de centrifugatie en verwijdering en bufferresuspenderingsprocessen. Drie keer meer. Deze wasstappen verwijderen alle sporen van niet-geïnternaliseerde biomoleculen uit de celsuspensie.In het geval van gelabelde eiwitinternalisatie wordt een extra zuiveringsstap uitgevoerd door de celsuspensie te pipetteren in een 1,5 milliliter buis voorzien van een 0,22 micron membraanfilter bovenop. Scheid de cellen van de buffer door centrifugatie terwijl u ervoor zorgt dat er voldoende vloeistof boven het filter achterblijft om te voorkomen dat de cellen uitdrogen en gooi de doorstromende fractie weg. Voeg onder het filter 500 microliters vers PBS toe over de cellen en herhaal de combinatie van een centrifugatie gevolgd door vers PBS-additie.Twee keer meer. Voer een laatste centrifugatie uit bij 3.300 G gedurende een minuut. Om de vorige PBS-was te verwijderen, resuspendeer de cellen met 150 microliters PBS.Verwijder tenslotte het bovenste dekglas van de eerder gemaakte aros pad. Laad de cellen op de pad door 10 microliters van de celsuspensie druppelsgewijs te pipetteren. Na het plaatsen van een nieuw schoongemaakt dekglas bovenop de aros pad, zijn de sandwich cellen nu klaar voor fluorescentiemicroscopie.</

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

In deze video laten we zien efficiënte electrofusie van...

Cel Electrofusion gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie

Source: Aigrain, L., et al. Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the delivery of fluorescent biomolecules into electrocompetent microbial cells using electroporation. The process begins with the introduction of fluorophore-tagged DNA or proteins into a chilled cell suspension. A high-voltage pulse is then applied to create temporary membrane pores, enabling biomolecule entry into the...

Electroporation-Based Delivery of Fluorescent Biomolecules into Bacterial Cells

This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Het uitbreiden van de stichting en de toepasbaarheid van fluorescentie door Unbound Opwinding van luminescentie (FUEL) door inventarisatie van de relevante beginselen en demonstreren van de verenigbaarheid ervan met een veelheid aan fluoroforen en antilichaam-gerichte voorwaarden.

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Biolistische transformatie een methode om stabiele integratie van DNA genereren in het genoom van de opportunistische pathogeen Cryptococcus neoformans via homologe recombinatie. We zullen biolistische transformatie van een construct, waarin het gen codeert acetaat kinase gefuseerd met de fluorescerende tag mCherry in C. neoformans is aangetoond.

Biolistische Transformatie van een TL Tagged Gene in de Opportunistische schimmelpathogeen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Elektroporatie is het gebruik van gepulseerde elektrische velden (PEF's) om voorbijgaande poriën in celculturen te creëren om moleculaire lading te introduceren. Deze techniek wordt de laatste tijd veel gebruikt in onderzoeks- en klinische omgevingen. Hier beschrijven we elektroporatietechnieken met behulp van het recent ontwikkelde "Electroporation Cytometry System" voor het uitvoeren van fluorescentiemicroscopie in levende cellen.

Een elektroporatiecytometrieprotocol voor live-cell, fluorescentiemicroscopie met behulp van U2 OS-celcultuur

Leer fluorescerende biomoleculen te internaliseren in levende micro-organismen via elektroporatie voor in vivo visualisatie. Deze methode maakt real-time analyse van diffusiepatronen en dynamiek mogelijk in bacteriën en gist.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Meer video's verkennen