Name: Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer de TUNEL-methode voor detectie van DNA-schade en celdood in muis skeletspierweefsel. Deze techniek biedt snelle, specifieke kwantificering met semi-geautomatiseerde analyse voor betrouwbare resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-NINDS-subsidie RO1-NS065895 en NIH-NINDS-subsidie 5-F31-NS076250-02. 
We danken de JHU SOM-microscoopfaciliteit voor het gebruik van de cryostaat.

OPMERKING: Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health 26 uitgevoerd. Het protocol (MO13M391) werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite. 1. Neonatale Mouse Sacrifice, Dissection en Fixatie <ol><li> Offeren een neonatale muis door CO 2 inademing. </li><li> Onmiddellijk afgesneden van de achterbeen boven de knie. Tot ongeveer postnatale dag 7, de botten zijn zacht genoeg om door te snijden met een groot laboratorium schaar of een scherp mes en om vervolgens deel aan een cryostaat. </li><li> Plaats het achterbeen in 10 ml ijskoude 4% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 15 ml buis. </li><li> Onderdompeling fix het achterbeen in paraformaldehyde voor 4-24 uur bij 4 ° C. Embryonaal weefsel vereist slechts een aantal uurs van fixatie. <ol><li> Vermijd fixatie langer dan 24 uur, omdat dit TUNEL assay efficiëntie kan verminderen. </li></ol></li><li> Cryoprotect het achterbeen door onderdompeling in sucrose-oplossing. <ol><li> Paraformaldehyde tot 10% sucrose in PBS wijzigen op dezelfde 15 ml buis, incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Wijziging 30% sucrose in PBS, incubeer overnacht bij 4 ° C of totdat de achterpoot zinkt naar de bodem van de buis. Weefsel kan worden achtergelaten in 30% sucrose gedurende een langere periode, mits de sucrose steriel gefiltreerd is. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Embedding <ol><li> Vul een gelabelde inbedding mal helft met inbeddingsmedium. </li><li> Plaats achterbeen bovenop het inbeddingmedium met de snijkant zo dicht mogelijk bij één wand van de matrijs. Markeer de oriëntatie van het achterbeen aan de buitenzijde van de matrijs. <ol><li> Meerdere achterpoten insluiten en snijd in hetzelfde blok. Het is echter belangrijk dat alle hindlimbs in het blok evenwijdig aan elkaar secties krijgen op overeenkomen niveaus langs de as van de ledemaat. </li></ol></li><li> Bedek achterpoten met inbeddingsmedium. Als achterpoten verschuiven tijdens het gieten het medium, heroriënteren ze met stompe getipt tang of een tandenstoker. </li><li> Laat inbeddingmedium de weefsels infiltreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min. </li><li> Plaats mallen direct op droog ijs of in isopentaan op droog ijs te bevriezen inbedmedium. Zorg ervoor dat de mallen niveau te allen tijde te houden en het verschuiven van de ingebed weefsel te voorkomen. </li><li> Bewaar bevroren schimmels bij -80 ° C tot klaar te snijden, tot enkele maanden. </li></ol> 3. cryosectioning Embedded Ledematen <ol><li> Stel cryostaatkamer temperatuur tot -20 ° C, object temperatuur tot -18 ° C; passen temperatuur object af als dat nodig is. </li><li> Evenwicht het weefsel blok in de cryostaatkamer gedurende ten minste 30 min. Juiste blok temperature is van cruciaal belang voor de afdeling kwaliteit. </li><li> Snijd dwarsdoorsneden bij een dikte van 10 urn of minder. Dikkere secties zullen niet volledig worden gepenetreerd door TUNEL reagentia. Gebruik de anti-roll plaat, messen, en bladhoek (typisch 5 °) aanbevolen voor de cryostaat. </li><li> Verzamel secties op gelatine of vectabond beklede glasplaatjes bij kamertemperatuur. Direct te plaatsen in een dia doos op droog ijs. Bewaar de doos dia in een aparte bak met droog ijs geplaatst in de buurt van de cryostaat binnen handbereik. <ol><li> Snijd dwars seriecoupes door de lange as van de ledematen, sla 100-200 urn. Vang minimaal 3 aangrenzende secties bij elke seriële niveau. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Assay op achterbeen Secties Met behulp van een los verkrijgbare kit (alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld) <ol><li> Ontdooien dia&#39;s met secties tot kamertemperatuur en droog &#39;s nachts of in het weekend. </li><li> Rehydrateren secties door immersing objectglaasjes in PBS gedurende 2 x 10 min in een Coplin jar. Droog met een lab te vegen, het verwijderen van zoveel vloeistof rond de sectie mogelijk. </li><li> Permeabilize secties <ol><li> Gebruik een niet-proteolytisch, saponine gebaseerde commerciële reagens of 0,5% Tween 20 en 0,05% Triton X100 in PBS. </li><li> Plaats de dia in een vochtige kamer. Een eenvoudige vochtige kamer een lege pipet tip doos met een strakke deksel, met net genoeg water toegevoegd aan de bodem van de doos bedekken. </li><li> Pipet genoeg reagens op de dia ter dekking van de sectie (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Niet direct pipet op de afdeling, zoals herhaalde agitatie de sectie kan veroorzaken op te heffen van de dia. </li><li> Met behulp van stompe getipt tang, plaats een kleine rechthoek van parafilm op de top van de sectie te spreiden de druppel reagens en volledig bedekken de sectie. Eventuele luchtbellen te vormen onder de parafilm, til het uit, droog, en opnieuw toe te passen. </li><li> Incubeer dia&#39;s met permeabilisatie reagens gedurende 1 uur in een overdekte vochtige kamer. Indien delen beginnen opstijgen van de glijbaan kan permeabilisatie worden teruggebracht tot 30 minuten. </li><li> Was de dia&#39;s in PBS in een Coplin pot 2 x 5 min. De parafilm rechthoeken zullen zweven naar de top en kan dan worden verwijderd en weggegooid. </li><li> Met behulp van een lab doekje, droog zoveel vloeistof rond de secties mogelijk. </li></ol></li><li> TdT-gemedieerde DNA-etikettering break <ol><li> Volg de instructies van de kit om 1x TdT- etikettering buffer, pipet genoeg etikettering buffer te maken op de dia om weefselcoupe dekken (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Als alternatief, dompel de dia in TdT etikettering buffer in een Coplin pot. </li><li> Volg kit instructies om TdT- etikettering mix te maken. De kit bevat kobalt, magnesium en mangaan kationen; het mangaankation werkt goed op een verscheidenheid van weefsels, zoals skeletspier, zenuwstelsel tissUE, lever, huid en botten. </li><li> Voor een positieve controle, voeg DNase (gemerkt &#39;nuclease &quot;in de kit) aan de TdT labeling mix. Alternatief vooraf reinigen positieve controle gedeelte met DNase in nuclease buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C, volgens de kit instructies. Houd DNase oplossing en DNase behandeld secties uit de buurt van andere experimentele secties om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Voor een negatieve controle, weglaten TdT enzym uit de etikettering mix. </li><li> Gebruik een lab doekje om zoveel TdT- etikettering buffer van de glijbaan mogelijk te verwijderen. Pipetteer TdT labeling mix op de schuif (50 ul per groep), bedekken met een nieuwe rechthoek parafilm en incubeer in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Volg de instructies van de kit om 1x stop buffer te maken. Gebruik een lab doekje om TdT labeling mix van de glijbaan verwijderen en voeg 200-300 pi stopbuffer de weefselsectie bedekken en incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Al<html> ternatively, dompel de dia in stop buffer in een Coplin pot. </li><li> Was de dia 2 x 2 min in PBS. Gebruik een lab doekje om zo veel PBS te verwijderen uit de dia mogelijk. </li></ol></li><li> Fluorescentielabelling <ol><li> Volg kit instructies om fluoresceïne etikettering oplossing voor te bereiden om dNTPs etiketteren DNA-breuken. Pipet oplossing op de glijbaan (50 ul per sectie), dek af met een nieuwe rechthoek van parafilm en incubeer in de vochtige kamer gedurende 20 minuten. </li><li> Wash glijbaan voor 2 min in PBS in een Coplin pot. Gebruik een lab doekje om zoveel PBS verwijderen mogelijk van de glijbaan. </li><li> Verdun Hoechst 33258 nucleaire vlek 1 ug / ml in PBS en pipet op de slede (100-200 gl voldoende punt dekken). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. </li><li> Was 3x gedurende 5 minuten in PBS. </li><li> Dekglaasje met antifade fluorescentie montage media en verzegelen randen met nagellak. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Digital Image Acquisition <ol><li> Acquire beelden met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop met DAPI, FITC en Texas Red filters (of gelijkwaardig). Gebruik een hogere doelstelling vergroting (20X of 40X) om te controleren of de etikettering was succesvol en kernen (intact of gefragmenteerd) werden bestempeld. Een 10X objectief is voldoende voor kwantificering van TUNEL-positieve puncta. </li><li> Verzamel beelden van de Hoechst kleuring, TUNEL kleuring, en autofluorescente signaal als drie afzonderlijke valse kleuren kanalen gecombineerd in één afbeelding. Als de TUNEL fluorofoor label is groen, afbeelding autofluorescente signaal in de rode filter, en vise versa. <ol><li> Houd alle beeldvormende instellingen gelijkwaardig tussen dia&#39;s voor volgende drempeling en kwantificering. Voor elk filter, preset en blootstelling opnemen tijden, winst, en binning (geen binning is het beste); denk automatische belichting of gain-instellingen niet gebruiken. </li><li> Gebruik trial-and-error om de blootstelling en de gain-instellingen die het beste het bereik van inten zal vangen vindensiteiten in alle gekleurde coupes. Zorg ervoor dat er geen verzadigde pixels in de verkregen beelden, omdat dit vooroordeel kwantificatie. </li></ol></li><li> Neem foto&#39;s van het hele spiergroep van belang. Dit kan meerdere afbeeldingen moeten worden &quot;gestikt&quot; samen. </li></ol> 6. beeldanalyse <ol><li> Gebruik in de handel verkrijgbaar beeldanalyse programma om digitale beelden van TUNEL kleuring te analyseren. Analyse met behulp van commerciële software is hier te zien. Als alternatief kan de gratis software ImageJ van NIH worden gebruikt om TUNEL kleuring te analyseren. </li><li> Stain een deel grenst aan het-TUNEL gekleurd gedeelte met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en neem een ​​digitale afbeelding op ware gedeelte met een conventionele helderveld microscoop. Met dit beeld H &amp; E in combinatie met een anatomische atlas 5,18,19 om de anatomische structuren te kwantificeren sporen. </li><li> Met de TUNEL kanaal uitgeschakeld, handmatig de omtrek van het gebied op te sporen moeten worden gekwantificeerd, met behulpHoechst en autofluorescence kanalen voor begeleiding. Zetten de getraceerd gebied in een masker (een set van geselecteerde pixelcoördinaten te analyseren). </li><li> Zet de TUNEL kanaal. Met behulp van de intensiteit drempelen functie in de beeldanalyse programma, zet de lagere drempel om alle autofluorescence signaal uit te sluiten. </li><li> Pas dezelfde drempel instelling voor alle beelden in de studie set. Omzetten thresholded selecties in maskers. </li><li> Voor elk beeld, combineer de spier gebied masker en de TUNEL masker. De nieuwe combinatie masker zal TUNEL signaal binnen de getraceerd spieren enige gebied te vertegenwoordigen. </li><li> Voeren masker kwantificatie van de combinatie masker om aantal objecten te bepalen en object oppervlakte van de TUNEL signaal binnen de getraceerd spier gebied. Voer deze met behulp van de Particle Analyzer functie in ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een methode voor het opsporen en kwantitatief analyseren van DNA-schade die apoptose in muis skeletspieren wordt beschreven. De procedure omvat weefsel oogsten, TUNEL kleuring, digitaal beeld acquisitie, en beeldanalyse. Gemeenschappelijke histologische leveringen en gereedschappen nodig, en een bijzondere economische TUNEL kit noodzakelijk. De essentiële grote apparatuur items die nodig zijn een cryostaat, epifluorescerende microscoop met digitaal beeld vermogen, en een computer systeem voor beeldanalyse. <p class=...

Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) is het proces van het gebruik van de TdT enzym om dUTP tot 3 hechten &#39;einden van de dubbele en enkelstrengs DNA breekt 12,23. De TUNEL methode voor de detectie van apoptose en DNA schade werd voor het eerst 20 jaar geleden door Gavrieli et al. 1,12,24. Het is sindsdien geëvalueerd en geoptimaliseerd in verschillende weefselpreparaten 7,23,27,40. TUNEL is gebruikt om ischemie geïnduceerde celdood van neuronen 6,14,29 en 43,44 cardiomyocyten, excitotoxische neuronale celdood 30,31 bestuderen, en als biomarker in artritisbehandeling 39. Er is ook gebruikt als een prognostische factor en tumorcel marker in verschillende menselijke kankers 2,3,15,32,37,38,42. Alternatieve methoden bestaan ​​voor DNA schade en celdood detectie, maar ze hebben technische uitdagingen en restricties. Southern blotting kan worden gebruikt quantify DNA schade in zijn geheel weefsel lysaten 7,9-11, maar deze methode biedt geen cellulair niveau resolutie en is moeilijk te kwantificeren. De komeettest is een alternatief cel-gebaseerde methode die vereist extraheren bewaarde kernen van cellen 4,20,28,36. Hoewel de comet assay werkt goed op gekweekte geïsoleerde cellen, is het veel moeilijker om intacte kernen bereiden van skeletspierweefsel 8,21. Zoals met Southern blot, ofwel de comet assay niet celtype-specifieke informatie van een hele spierweefsel homogenaat verschaffen. Een ander alternatief voor de TUNEL methode immunohistochemie met antilichamen tegen enkelstrengs DNA 25,33,41 of tegen eiwitten die deelnemen DNA schade respons en celdood routes (bijvoorbeeld p53, H2AX en caspasen) 13,17,22,40. Dergelijke antilichaam gebaseerde methoden vereisen grondige karakterisatie van antilichamen en uitstekende antilichaamspecificiteit een hoge signaal-achtergrond verhouding oplevert. Zelfs wanneer specific antilichamen bestaan, kunnen zij denatureren van het doeleiwit door antigen retrieval procedure 34,35 vereisen. Zoals we hier bespreken, antigen retrieval in spierweefsel leidt tot onaanvaardbaar hoge autofluorescence. In tegenstelling tot de alternatieve methoden, TUNEL behaalt DNA-schade detectie met een hoge signaal en lage achtergrond, uitstekende specificiteit die getest kunnen worden met eenvoudige positieve en negatieve controles, goede weefselpenetratie dat antigen retrieval niet vereist, en cellulair niveau resolutie. Bovendien neemt de TUNEL methode ongeveer 4 uur in beslag, terwijl alternatieve overnacht incubatie vereisen meestal. We bestuderen skeletspier celdood in een muismodel van spinale musculaire atrofie (SMA) 10 die is gegenereerd door Hsieh-Li en collega 16. Apoptotische cellen te kwantificeren in de spier, hebben wij een werkwijze weefselpreparaat, kleuring en kwantificering die robuust werkt in verschillende skele ontwikkeldTal spiergroepen op verschillende ontwikkelingsstoornissen tijdstippen bij muizen. We maken gebruik van een in de handel verkrijgbaar TUNEL-labeling kit en in de handel verkrijgbare software voor beeldanalyse. We hebben ook met succes gebruikt de TUNEL assay in combinatie met immunofluorescente kleuring in het ruggenmerg 10. De hier beschreven methoden zijn nuttig voor onderzoekers die willen weefselpathologie mechanismen van ziekten, mechanismen van veroudering en ontwikkelingsstoornissen (pre- en postnatale) celdood in de skeletspier. De TUNEL-techniek is bijzonder nuttig voor studies van DNA schade en herstel en celdood in modelsystemen waar slechts een subset van cellen beïnvloed en celniveau resolutie noodzakelijk. Deze video beschrijft dissectie, weefsel verwerking, snijden, en fluorescentie gebaseerde TUNEL etikettering van de muis skeletspieren. Het beschrijft ook een werkwijze voor semi-automatische TUNEL signaal kwantificering.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19202</td><td>Voor hier beschreven procedures werd 4% oplossing vers bereid uit poeder. Paraformaldehyde van elke leverancier mag worden gebruikt. Bereide formaldehyde-oplossing moet worden bewaard bij 4 °C en mag niet worden gebruikt na de vervaldatum (tot enkele maanden). Paraformaldehyde is een carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van paraformaldehyde.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Gebruikt voor het cryobeschermen van weefsel voor het invriezen. Sucrose van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>O.C.T. compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Inbeddingsmedium voor cryosectio.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Een Leica CM3050S cryostat werd gebruikt voor de hier beschreven preparaten. Elke cryostat die in staat is om secties van 10 µm te snijden, mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Glazen plaatjes, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Plaatjes van elke leverancier mogen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatine wordt gebruikt om de adhesie van weefselsecties op glazen plaatjes te bevorderen. Om glazen plaatjes met gelatine te coaten, lost u 2,75 g gelatine en 0,275 g chroomaluin op in 500 ml gedistilleerd water, verwarmt tot 60 °C, doopt de plaatjes enkele seconden en laat drogen. Gelatine van elke leverancier mag worden gebruikt. Als alternatief kunnen gelatine-voorgecoate plaatjes worden gekocht.</td></tr><tr><td>Chroom(III) kaliumsulfaat dodecahydraat (chroomaluin)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chroomaluin wordt toegevoegd aan gelatine-oplossing om de weefsel adhesie op glazen plaatjes te bevorderen. Het is een mogelijk carcinogeen en een toxine bij inademing en huidcontact. Volg de in het MSDS gespecificeerde voorzorgsmaatregelen bij het hanteren van chroomaluin.</td></tr><tr><td>Vectabond weefsel adhesie reagens</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optioneel substraat voor betere weefsel adhesie op glazen plaatjes; gelatine-gecoate plaatjes kunnen ook worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Tween20 van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Een detergent gebruikt om weefsel permeabel te maken. Triton X100 van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptose detectiekit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Commerciële kit voor fluorescens-gebaseerde TUNEL-labeling.</td></tr><tr><td>DNase/nuclease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(meegeleverd met kit)</td></tr><tr><td>DNase/nuclease buffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(meegeleverd met kit)</td></tr><tr><td>10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Maak 1x PBS voor wasbeurten en verdunning. PBS van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>DNase-vrij water</td><td>Quality Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Water van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Kernkleur. Elke blauwe fluorescente nucleaire kleurstof mag worden gebruikt. Als DNA-bindende kleurstof is Hoechst een vermoedelijke carcinogeen en moet met beschermende uitrusting worden gehanteerd om huidcontact te minimaliseren.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>meerdere</td><td>807</td><td>Elke andere hydrofobe film of dekglas mag worden gebruikt. Beschikbaar bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop met digitale camera</td><td>&nbsp;--</td><td>&nbsp;--</td><td>Elke fluorescentiemicroscoop die in staat is om rood, groen en blauw fluorescens in afzonderlijke kanalen digitaal vast te leggen, mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Vectashield antifade media</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade media van elke leverancier mag worden gebruikt.</td></tr><tr><td>glasdekglazen, dikte No.1</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Dekglazen van elke leverancier mogen worden gebruikt. De kleinste maat van 22 x 22 mm is voldoende voor neonatale muisbeensecties.</td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Gebruikt om dekglazen af te sluiten. Nagellak van elke leverancier (inclusief reguliere retailers) mag worden gebruikt. Vermijd het gebruik van nagellak met kleur of additieven die licht kunnen reflecteren tijdens fluorescentiebeeldvorming.</td></tr></tbody></table>

detectie en analyse van dna-schade in muis skeletal muscle in situ met behulp van de tunel methode

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridinetrifosfaat (dUTP) nick-end labeling (TUNEL) is de methode om het TdT-enzym te gebruiken om covalent een gemerkte vorm van dUTP te hechten aan 3’-uiteinden van dubbel- en enkelstrengs DNA-breuken in cellen. Het is een betrouwbare en nuttige methode om DNA-schade en celdood in situ te detecteren. Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectiëring en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muisskeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-automatische TUNEL-signaalkwantificering. Inherente normale weefselkenmerken en weefselverwerkingscondities beïnvloeden de mogelijkheid van het TdT-enzym om DNA efficiënt te labelen. Weefselverwerking kan ook ongewenste autofluorescentie toevoegen die de detectie van TUNEL-signalen zal verstoren. Daarom is het belangrijk om empirisch weefselverwerkings- en TUNEL-labelingmethoden te bepalen die het optimale signaal-ruisverhouding zullen opleveren voor daaropvolgende kwantificering. De hier beschreven fluorescentiegebaseerde assay biedt een manier om autofluorescente signalen uit te sluiten door digitale kanaalsubtraksie. De TUNEL-assay, gebruikt met geschikte weefselverwerkingstechnieken en controles, is een relatief snelle, reproduceerbare, kwantitatieve methode voor het detecteren van apoptose in weefsel. Het kan worden gebruikt om DNA-schade en apoptose te bevestigen als pathologische mechanismen, om aangetaste celtypen te identificeren en om de werkzaamheid van therapeutische behandelingen in vivo te beoordelen.

Met succesvolle kleuring, moet TUNEL-positief signaal helder genoeg om te isoleren van autofluorescentie door het instellen van de intensiteit drempels zijn. TUNEL-positieve objecten bij een lage vergroting kan verschijnen als lichte onregelmatige fragmenten in de skeletspier (Figuur 1A). Bij hogere vergroting, sommige TUNEL-positieve objecten met klassieke apoptotische morfologie worden waargenomen als het type celdood betrokken is apoptose (Figuur 1B). De positieve controle (DNase toe...

Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectioenering en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muis skeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-geautomatiseerde analyse van TUNEL-labeling.

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA-breuken en celdood in C twee te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst de weefselsecties permeabel te maken om tunnelreagentia toegang te geven tot de celkern. Vervolgens wordt TDT-enzym gebruikt om DTP's covalent te hechten aan de drie prime-uiteinden van DNA-breuken in deze cellen.Vervolgens wordt de DUTP getagd met een fluorescente sonde. Uiteindelijk wordt het tunnel-positieve signaal gekwantificeerd in weefselsecties die de relatieve frequentie van DNA-breuken in de cellen weerspiegelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals Southern blotting of immunohistochemie, is dat het relatief snel specifiek is en een manier biedt om ruis en autofluorescentie te elimineren.Begin met het fixeren van geïsoleerde achterpoten in 4% Para formaldehyde in PBS in een buisje van 15 milliliter. Laat de fixatie vier tot maximaal 24 uur bij vier graden Celsius doorgaan. Slechts twee uur is nodig als het weefsel embryonaal is. Na de fixatie, vervang de oplossing echter met 10% sucrose om het weefsel te cryo-beschermen en incubeer het een nacht bij vier graden Celsius.De volgende dag, verander de oplossing in steriel gefilterde 30% sucrose en zet de incubatie door tot de achterpoten op de bodem van de buis zinken. Bij het inbedden is het belangrijk dat de achterpoten volledig onderdompelen in het inbeddingsmedium. De inbeddingsvormen kunnen direct op droog ijs of in isopentaan op droog ijs worden geplaatst om het medium te bevriezen.Bij cryosectio. De blokken worden gesneden en secties worden overgebracht die 10 micron dik of dunner zijn, dikkere secties zullen niet worden doorboord door de tunnelmarkeringsreagentia. Verzamel deze dunne secties op gelatine of vectorbond gecoate glazen plaatjes bij kamertemperatuur.Zeer snel, breng de plaatjes over naar droog ijs voor opslag. Ontdooi eerst een plaatje van bevroren weefselsectie tot kamertemperatuur en laat het 16 tot 64 uur drogen. Zodra het plaatje op kamertemperatuur is, rehydrateer de sectie in een koppelpot gevuld met PBS gedurende 10 minuten.Herhaal deze rehydratatiestap eenmaal, droog vervolgens het plaatje voorzichtig af met een labdoekje zonder het weefselsectie te verstoren om de sectie te permeabiliseren, plaats het plaatje in een vochtigheidskamer en pipetteer 50 microliter niet-proteolytisch sappinen basis commerciële reagentia op de sectie. Pipetteer niet direct op de secties, omdat dit los kan komen of beschadigd kan raken. Plaats vervolgens een klein stukje parafilm over de sectie om het reagens te verspreiden.Als er zich bellen vormen, breng dan de parafilm opnieuw aan. Laat het plaatje een uur incuberen na een uur. Verwijder de reagentia met twee vijf minuten wasbeurten in PBS en dep het voorzichtig droog.Vervolgens om DNA-breuken door TDT te labelen, gebruik een commercieel verkrijgbaar kit. Maak eerst de ene XTDT buffer en pipetteer deze over de sectie. Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten in de vochtigheidskamer.Ten tweede, maak een TDT-labelingsmix volgens de instructies van de kit of een positieve controleplaat. Voeg DNA toe aan de TDT-labelingsmix. Voor een negatieve controleplaat, laat het TDT-enzym weg uit de mix.Gebruik nu een doek om zoveel mogelijk buffer van het plaatje te verwijderen en pipetteer het op de labelingsmix. 50 microliter zou voldoende moeten zijn. Verspreid de oplossing weer met paraform zonder bellen te maken.Laat het plaatje nu een uur in de kamer incuberen bij 37 graden Celsius. Ten derde, maak de ene x stop buffer volgens de instructies van de kit. Nadat het labelingsmix is verwijderd met het labdoekje, voeg tussen de twee en 300 microliter van de stopmix toe om de sectie volledig te bedekken.Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten in de kamer. Er wordt in deze stap geen parafilm gebruikt. Om de stopbuffer te verwijderen, gebruik twee twee minuten wasbeurten in PBS.Pipetteer nu 50 microliter vers bereide fluoresceïne labeloplossing. Breng perfil op het plaatje aan en bewaar het 20 minuten in de kamer, maar nu in het donker. Verwijder de labeloplossing met een enkele twee minuten wasbeurt in PBS terwijl u enkele haken verdunt.3 3, 2, 5 8 tot één microgram per milliliter in PBS. Na de wasbeurten, bedek de secties in een tot 200 microliter van de verdunde hakenoplossing. Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten, beschut voor licht om de haken te verwijderen om te kleuren, gebruik drie vijf minuten wasbeurten in PBS.Droog vervolgens voorzichtig het plaatje af met een labdoekje en breng een dekglas aan voor beeldvorming. Beeld de sectie af met dpi, fitzy en Texas red filters om de hakenkleur, tunnelkleur en autofluorescentie signalen in drie valse kleurenkanalen in een enkele afbeelding te scheiden. Standaardiseren en handhaven van dezelfde beeldinstellingen tussen alle plaatjes zodat ze gemakkelijk kunnen worden vergeleken.Gebruik geen automatische belichting of versterkingsinstellingen voor anatomische referentie. Gebruik een heldere lichtveldafbeelding van een aangrenzende achterpootsectie gekleurd met h en e in de beeldanalysesoftware. Schakel het tunnelkanaal uit.Traceer vervolgens handmatig de omtrek van het spiergebied dat moet worden gekwantificeerd met behulp van de andere kanalen. Zet het getraceerde gebied om in een masker. Zet vervolgens het tunnelkanaal weer aan en pas de minimale intensiteitsdrempel aan om het autofluorescente signaal uit te sluiten.Gebruik dezelfde drempellimiet op alle secties die in de studie zijn geanalyseerd. Vervolgens, converteer de drempelpixels in een masker. Combineer in elke afbeelding het spiergebiedmasker en het drempeltunnelmasker.Dit maakt een weergave van het tunnel signaal binnen het getraceerde spiergebied. Kwantificeer nu het gecombineerde masker om het aantal tunnel-positieve objecten en het totale pixeloppervlak van het tunnel signaal binnen de

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.

Visualisatie van MG53-gemedieerde celmembraan Reparatie gebruik In vivo En In vitro Systemen

In this video, the TUNEL assay is performed to detect the presence of apoptotic cells in a sample. The study involves using a special DNA polymerase - terminal deoxynucleotidyl transferase - that catalyzes the addition of labeled dUTPs to the 3' terminus of fragmented DNA, which can be observed and identified under a fluorescence microscope.

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling&#8212;TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in Apoptotic Cells

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.

Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.

Detectie van DNA-dubbelstrengsbreuken in eicellen van muizen

Het hier gepresenteerde protocol maakt de identificatie en hoogdimensionale analyse van spierstam- en voorlopercellen mogelijk door middel van eencellige massacytometrie en hun zuivering door FACS voor diepgaande studies van hun functie. Deze benadering kan worden toegepast om de regeneratiedynamiek in ziektemodellen te bestuderen en de werkzaamheid van farmacologische interventies te testen.

Identificatie en analyse van myogene voorlopercellen in vivo tijdens acuut skeletspierletsel door hoogdimensionale eencellige massacytometrie

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Leer de TUNEL-methode voor detectie van DNA-schade en celdood in muis skeletspierweefsel. Deze techniek biedt snelle, specifieke kwantificering met semi-geautomatiseerde analyse voor betrouwbare resultaten.

Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode

Meer video's verkennen