Detectie en analyse van DNA-schade in Muis Skeletal Muscle In Situ Met behulp van de TUNEL Methode
16 december 2014
Deze video beschrijft dissectie, weefselverwerking, sectioenering en op fluorescentie gebaseerde TUNEL-labeling van muis skeletspier. Het beschrijft ook een methode voor semi-geautomatiseerde analyse van TUNEL-labeling.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA-breuken en celdood in C twee te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst de weefselsecties permeabel te maken om tunnelreagentia toegang te geven tot de celkern. Vervolgens wordt TDT-enzym gebruikt om DTP's covalent te hechten aan de drie prime-uiteinden van DNA-breuken in deze cellen.
Vervolgens wordt de DUTP getagd met een fluorescente sonde. Uiteindelijk wordt het tunnel-positieve signaal gekwantificeerd in weefselsecties die de relatieve frequentie van DNA-breuken in de cellen weerspiegelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals Southern blotting of immunohistochemie, is dat het relatief snel specifiek is en een manier biedt om ruis en autofluorescentie te elimineren.
Begin met het fixeren van geïsoleerde achterpoten in 4% Para formaldehyde in PBS in een buisje van 15 milliliter. Laat de fixatie vier tot maximaal 24 uur bij vier graden Celsius doorgaan. Slechts twee uur is nodig als het weefsel embryonaal is. Na de fixatie, vervang de oplossing echter met 10% sucrose om het weefsel te cryo-beschermen en incubeer het een nacht bij vier graden Celsius.
De volgende dag, verander de oplossing in steriel gefilterde 30% sucrose en zet de incubatie door tot de achterpoten op de bodem van de buis zinken. Bij het inbedden is het belangrijk dat de achterpoten volledig onderdompelen in het inbeddingsmedium. De inbeddingsvormen kunnen direct op droog ijs of in isopentaan op droog ijs worden geplaatst om het medium te bevriezen.
Bij cryosectio. De blokken worden gesneden en secties worden overgebracht die 10 micron dik of dunner zijn, dikkere secties zullen niet worden doorboord door de tunnelmarkeringsreagentia. Verzamel deze dunne secties op gelatine of vectorbond gecoate glazen plaatjes bij kamertemperatuur.
Zeer snel, breng de plaatjes over naar droog ijs voor opslag. Ontdooi eerst een plaatje van bevroren weefselsectie tot kamertemperatuur en laat het 16 tot 64 uur drogen. Zodra het plaatje op kamertemperatuur is, rehydrateer de sectie in een koppelpot gevuld met PBS gedurende 10 minuten.
Herhaal deze rehydratatiestap eenmaal, droog vervolgens het plaatje voorzichtig af met een labdoekje zonder het weefselsectie te verstoren om de sectie te permeabiliseren, plaats het plaatje in een vochtigheidskamer en pipetteer 50 microliter niet-proteolytisch sappinen basis commerciële reagentia op de sectie. Pipetteer niet direct op de secties, omdat dit los kan komen of beschadigd kan raken. Plaats vervolgens een klein stukje parafilm over de sectie om het reagens te verspreiden.
Als er zich bellen vormen, breng dan de parafilm opnieuw aan. Laat het plaatje een uur incuberen na een uur. Verwijder de reagentia met twee vijf minuten wasbeurten in PBS en dep het voorzichtig droog.
Vervolgens om DNA-breuken door TDT te labelen, gebruik een commercieel verkrijgbaar kit. Maak eerst de ene XTDT buffer en pipetteer deze over de sectie. Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten in de vochtigheidskamer.
Ten tweede, maak een TDT-labelingsmix volgens de instructies van de kit of een positieve controleplaat. Voeg DNA toe aan de TDT-labelingsmix. Voor een negatieve controleplaat, laat het TDT-enzym weg uit de mix.
Gebruik nu een doek om zoveel mogelijk buffer van het plaatje te verwijderen en pipetteer het op de labelingsmix. 50 microliter zou voldoende moeten zijn. Verspreid de oplossing weer met paraform zonder bellen te maken.
Laat het plaatje nu een uur in de kamer incuberen bij 37 graden Celsius. Ten derde, maak de ene x stop buffer volgens de instructies van de kit. Nadat het labelingsmix is verwijderd met het labdoekje, voeg tussen de twee en 300 microliter van de stopmix toe om de sectie volledig te bedekken.
Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten in de kamer. Er wordt in deze stap geen parafilm gebruikt. Om de stopbuffer te verwijderen, gebruik twee twee minuten wasbeurten in PBS.
Pipetteer nu 50 microliter vers bereide fluoresceïne labeloplossing. Breng perfil op het plaatje aan en bewaar het 20 minuten in de kamer, maar nu in het donker. Verwijder de labeloplossing met een enkele twee minuten wasbeurt in PBS terwijl u enkele haken verdunt.
3 3, 2, 5 8 tot één microgram per milliliter in PBS. Na de wasbeurten, bedek de secties in een tot 200 microliter van de verdunde hakenoplossing. Bewaar vervolgens het plaatje vijf minuten, beschut voor licht om de haken te verwijderen om te kleuren, gebruik drie vijf minuten wasbeurten in PBS.
Droog vervolgens voorzichtig het plaatje af met een labdoekje en breng een dekglas aan voor beeldvorming. Beeld de sectie af met dpi, fitzy en Texas red filters om de hakenkleur, tunnelkleur en autofluorescentie signalen in drie valse kleurenkanalen in een enkele afbeelding te scheiden. Standaardiseren en handhaven van dezelfde beeldinstellingen tussen alle plaatjes zodat ze gemakkelijk kunnen worden vergeleken.
Gebruik geen automatische belichting of versterkingsinstellingen voor anatomische referentie. Gebruik een heldere lichtveldafbeelding van een aangrenzende achterpootsectie gekleurd met h en e in de beeldanalysesoftware. Schakel het tunnelkanaal uit.
Traceer vervolgens handmatig de omtrek van het spiergebied dat moet worden gekwantificeerd met behulp van de andere kanalen. Zet het getraceerde gebied om in een masker. Zet vervolgens het tunnelkanaal weer aan en pas de minimale intensiteitsdrempel aan om het autofluorescente signaal uit te sluiten.
Gebruik dezelfde drempellimiet op alle secties die in de studie zijn geanalyseerd. Vervolgens, converteer de drempelpixels in een masker. Combineer in elke afbeelding het spiergebiedmasker en het drempeltunnelmasker.
Dit maakt een weergave van het tunnel signaal binnen het getraceerde spiergebied. Kwantificeer nu het gecombineerde masker om het aantal tunnel-positieve objecten en het totale pixeloppervlak van het tunnel signaal binnen de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video beschrijft een methode voor het detecteren van DNA-breuken en celsterfte in skeletspieren van muizen via TUNEL-labeling. Er wordt uitgebreid ingegaan op de dissectie, weefselverwerking en de semi-geautomatiseerde analyse die bij deze techniek komen kijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Histologie
Achtergrond
- Het begrijpen van DNA-breuken is cruciaal voor het bestuderen van celdood.
- TUNEL-labeling is een specifieke methode voor het detecteren van deze breuken.
- Traditionele methoden kunnen trager en minder specifiek zijn.
- Deze techniek heeft tot doel de snelheid en nauwkeurigheid van de detectie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het kwantificeren van DNA-breuken in weefselcoupes.
- Om het begrip van mechanismen van celdood te verbeteren.
- Om een sneller alternatief te bieden voor bestaande methoden.
Gebruikte methoden
- Dissectie van skeletspieren van muizen.
- Weefselverwerking om monsters voor analyse voor te bereiden.
- Fluorescentiegebaseerde TUNEL-labeling voor het detecteren van DNA-breuken.
- Semi-automatische analyse voor het kwantificeren van TUNEL-positieve signalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van DNA-breuken in spierweefsel.
- Kwantificering van TUNEL-positieve signalen die wijzen op celdood.
- Demonstratie van de snelheid en specificiteit van de methode.
- Vergelijking met traditionele methoden waarbij de voordelen worden benadrukt.
Conclusies
- De TUNEL-labelingsmethode is effectief voor het bestuderen van celdood.
- Deze aanpak kan het onderzoek naar spierbiologie verbeteren.
- Het biedt een waardevol instrument voor toekomstige studies naar DNA-schade.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het detecteren van DNA-schade in skeletspieren biedt mechanistisch inzicht in celdoodpaden die relevant zijn voor neuromusculaire ziektemodellen en de beoordeling van therapeutische effectiviteit. De TUNEL-methode maakt kwantitatieve, reproduceerbare meting van apoptose in weefselsneden mogelijk, wat doelwitvalidatie en lead-identificatie in preklinisch onderzoek ondersteunt. Door het echte signaal te scheiden van autofluorescentie via digitale kanaalsubtractie, verbetert de assay het voorspellende vertrouwen bij de bevestiging van pathologische mechanismen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door DNA-schade te bevestigen als pathologisch mechanisme in ziektestuudies.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe meting van celsterfte in relevante weefsels.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de apoptose-effectiviteit van therapeutische interventies in vivo te kwantificeren.
Screening en assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve metingen van TUNEL-positieve signalen voor screeningcampagnes van verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: Semi-geautomatiseerde kwantificering waarborgt een consistente signaaldetectie over verschillende secties en experimentele groepen.
- Ruisreductie: Digitale kanaalsubtractie sluit autofluorescentie uit, waardoor de sensitiviteit en betrouwbaarheid van de assay verbeteren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Toegepast in SMA-muismodellen om celdood in skeletspiercellen te beoordelen, waarmee het translationele nut wordt aangetoond.
- Mechanische risicoreductie: Bevestigt de betrokkenheid van apoptose bij celdood, waardoor ambiguïteit in de analyse van signaalpaden wordt verminderd.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door doelwitmodulatie te koppelen aan fenotypische uitkomsten.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische effectiviteitstests, waarbij kwantitatieve apoptose-metingen worden verstrekt die dienen als basis voor go/no-go-beslissingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten door DNA-breuken te detecteren en mechanismen van celsterfte in skeletspieren te verduidelijken.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten voor het evalueren van compound-effecten op apoptose op weefselniveau.
- Analytics: Genereert drempelwaarde-gebaseerde signaalmaskers en objecttellingen die statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie via ziekte-relevante apoptose-modellering in muisspieren.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar fluorescentie-gebaseerd platform voor apoptosedetectie in meerdere weefseltypen en ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit rond celstervingsroutes te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door vaste beeldinstellingen en semi-geautomatiseerde kwantificering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege, datagestuurde go/no-go-beslissingen mogelijk te maken op basis van de effectiviteit van apoptose.
- Impact op portfolio: Faciliteert risicogebaseerde prioritering door de therapeutische impact op DNA-schade en celsterfte te kwantificeren.
Overwegingen bij implementatie
- Vereist expertise in histologie, weefselcoupes en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van een cryostaat, fluorescentiemicroscoop en beeldanalyse-software met mogelijkheden voor kanaalscheiding.
- Vereist standaardisatie van fixatie-, inbeddings- en coupesprotocollen tussen teams.
- Moet rekening houden met weefselspecifieke autofluorescentie van bronnen zoals RBC's, bot en endotheelcellen.
- Beperkt door artefacten door weefselverwerking die de efficiëntie van het TdT-enzym en de signaal-ruisverhouding kunnen beïnvloeden.
