Name: Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer een efficiënte methode voor het afleiden van retinale pigment epitheelcellen uit pluripotente stamcellen met gedefinieerde factoren. Dit protocol versnelt differentiatie en verhoogt de opbrengst voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen de volgende personen bedanken: Drs. Tim Krohne en Eyal Banin (samen met Dr. Mandy Lehmann en David Friedlander) voor hun genereuze hulp bij het ontwikkelen van de differentiatieprotocollen. Dr. Felicitas Bucher verleende hulp bij het differentiëren van de RPE-cellen die in dit onderzoek zijn gebruikt. We danken ook het National Eye Institute (NEI-subsidies EY11254 en EY021416), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM-subsidie TR1-01219) en het Lowy Medical Research Institute (LMRI) voor de zeer genereuze financiering voor dit project.

1. Geregisseerd Differentiatie van stamcellen afgeleide RPE Opmerking: Alle incubatie stappen worden uitgevoerd bij 37 ° C in 5% CO2 <ol style="margin-left: 40px;"><li> Handhaving van de HES of heupen lijnen (dagelijks voeden) in onderhoud media (MM; tabel 1). Zodra de lijnen voldoende kwaliteits- controle bereikt, houden ze op een laag van muis embryonale voedingscellen (MEF) geënt bij een dichtheid van 250.000 / putje van een zes puts plaat. Xeno-vrij kweken kunnen ook worden gegenereerd na het bij Tucker et al. 40 protocol. </li><li> Laat de stamcellen kolonies tot samenvloeiing bereiken. </li><li> Schakelen naar differentiatie media met Nicotinezuuramide (DM / NIC; tabel 1); dagelijks voeden. </li><li> Na drie weken in de cultuur, over te schakelen naar differentiatie media met nicotinamide en ofwel Activin-A of IDE-1 (DM / NIC / AA of DM / NIC / IDE1; tabel 1) tot RPE differentiatie te verbeteren. </li&gt; <li> Na vijf weken in de cultuur, schakel terug naar DM / NIC. Dagelijkse voedingen niet langer nodig wanneer de pH indicatoren in de media stop geel worden de dag na de voeding. </li><li> Wacht op eilandjes van gepigmenteerde cellen te verschijnen die groot genoeg zijn om te worden gesneden en verwijderd (zie figuur 2D-F en 3A). </li></ol> 2. Isoleren Gepigmenteerde Eilandjes <ol style="margin-left: 40px;"><li> Smeer de putjes van een 24-wells plaat met een matrix die de natuurlijke cel milieu (xeno-vrije voorkeur) nabootst. OPMERKING: Cornea messen en scherpe, fijne punt tang zijn zeer nuttig voor het plukken. Het hele vel van gedifferentieerde cellen kunnen los terwijl het oppakken. Dit voorkomen door zorgvuldig werken en aanvankelijk plukken kolonies in het midden van de schaal. </li><li> Vul zoveel putjes van de 24-well plaat met differentiatie medium (DM; tabel 1) nodig. Deze beslissing is afhankelijk van het aantal gepigmenteerde koloniesverzameld. </li><li> In een celkweek kap met een dissectie scope, handmatig uitgesneden gepigmenteerde eilandjes. Hak elk eilandje aan de onderkant van de originele plaat met behulp van een scalpel in ongeveer 2-6 stukken en pak de gepigmenteerde delen met scherpe tang. </li><li> Transfer 1-2 gepigmenteerde stukjes in elke 24-put. </li><li> Laat de media niet veranderen voor 3-5 dagen tot cellen hechten, dan beginnen veranderende media drie keer per week. (Als ze niet houden na deze tijd, de kans is groot dat ze nooit doen). </li><li> Expand cellen voor 3-4 weken differentiatie medium (DM; Tabel 1) - Een beeld van een typische kweek wordt getoond in figuur 3B. Cellen kunnen nog steeds niet vullen het gehele goed maar langer wachten lijkt niet te helpen. Voeden cellen drie keer per week. </li><li> Na ongeveer 3 weken, handmatig clusters van witte cellen te verwijderen in groepjes, indien nodig met scherpe tang. Voer deze stap niet tenzij dit noodzakelijk is - het is gemakkelijk om verontreinigingen te voeren. Het is ideaal omproberen om een ​​zo zuiver populaties van RPE in stap 1.6 te verkrijgen van de oorspronkelijke gepigmenteerde kolonies. </li></ol> 3. Passage stamcellen afgeleide RPE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Trek de cellen met 200 ul van een cel dissociatie oplossing (bij voorkeur geen trypsine-een reagens die kan worden geïnactiveerd door verdunning voorkeur) 5-8 minuten bij 37 ° C en inactiveren door verdunning met DM. Gebruik een 200 ul pipet te wassen alle cellen en hen opnieuw in suspensie (Als het goed gekozen bevat slechts een paar cellen, overweeg dan het bundelen van de cellen van twee 24-wells). </li><li> Centrifuge (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 3 ml DM media. </li><li> Opnieuw plate cellen van één (of twee) 24-wells in een matrix beklede 6-well in 3 ml DM per putje (1: 5 expansie). </li><li> Openen voor 1-2 weken tot de cellen zijn ~ 90% samenvloeiing; een afbeelding van volledig gedifferentieerde zuivere kweek wordt getoond in figuur 3C. </li><li> Los cellen met 1 ml cel dissociation oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C, inactiveren door verdunning met DM Gebruik 1000 ul pipet te wassen alle cellen en resuspendeer hen. </li><li> Spin down (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 18 ml DM media. </li><li> Opnieuw plate cellen van een 6-wells elk in zes matrix beklede 6-putjes in 3 ml DM per putje (1: 6 expansie) of een beklede 75cm 2 fles (1: 7.5 expansie). </li><li> Herhaal stap 3,4-3,8 nodig totdat voldoende cellen zijn verkregen. OPMERKING: Probeer zo veel kolonies mogelijk te maken voor uitbreiding te verzamelen in plaats van plan om de culturen te versterken via passage omdat elke passage induceert RPE dedifferentiation. </li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Congdon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+prevalence+of+visual+impairment+among+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).</li>
<li>Friedman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+age-related+macular+degeneration+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of age-related macular degeneration in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).</li>
<li>Resnikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year.</a> Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).</li>
<li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%22%5BJournal%5D)">Progress In Retinal And Eye Research.</a> Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+transplantation+and+its+role+in+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">RPE transplantation and its role in retinal disease.</a> Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+%28Cambridge%2C+Mass%29%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Cruz, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+receptor+tyrosine+kinase+gene+Mertk+in+the+retinal+dystrophic+RCS+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat.</a> Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol Vis. 15, 283-295 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+of+RPE+allografts+in+non-immunosuppressed+patients+with+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD.</a> Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+and+immune+response+in+the+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).</li>
<li>Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinal+degenerative+diseases+with+human+iPS-derived+cells%3A+current+status+and+future+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications.</a> Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).</li>
<li>Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell+modeling+of+Best+disease%3A+insights+into+the+pathophysiology+of+an+inherited+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration.</a> Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).</li>
<li>Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTucker%2C+BA+%22Stem+Cells+Transl+Med%22">Stem Cells Transl Med</a>. 2 (1), 16-24 (2013).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+retinal+pigment+epithelium-like+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Protei.%2C+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors.</a> Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft commerciële onthullingen te melden.

In dit manuscript schetsen we de stappen om efficiënt genereren van grote aantallen pure iPS-RPE culturen. We hebben eerder aangegeven met dit gericht differentiatie protocol met Activin A dat we iPS-RPE die sterk lijken hRPE op basis van transcriptomics, proteomics, metabolomics en functionaliteit kan genereren, en dat ze vertragen retinale degeneratie wanneer geïmplanteerd in RCS ratten 12,31,32 . Het maken van iPS-RPE is tijdrovend, maar niet bewerkelijk (figuur 1). Zodra de iPS kweken con...

De verschillende celtypen die de retina bezetten, zijn georganiseerd in een functionele architectuur. De fotoreceptoren aan de achterkant van de retina zijn verantwoordelijk voor het omzetten van licht in elektrische impulsen door middel van fototransductie. Fototransductie kan echter niet plaatsvinden zonder de gecoördineerde inspanningen van andere aangrenzende celtypen, inclusief Mueller-glia en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. Een monolaag RPE-cellen scheidt de sensorische retina van de choriocapillaris, de primaire bloedtoevoer voor fotoreceptoren, en is ideaal gelegen om meerdere functies te controleren die belangrijk zijn voor de homeostase van fotoreceptoren. In feite zijn de RPE en fotoreceptoren zo onderling afhankelijk dat ze algemeen worden beschouwd als één functioneel geheel. (Voor een overzicht van alle diverse functies van de RPE, zie Strauss, 20051.) Dood of disfunctie van retinale pigmentepitheelcellen kan leidt tot leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van permanent verlies van gezichtsvermogen in geïndustrialiseerde landen2-4.
AMD is een multifactoriële ziekte van RPE, fotoreceptoren en de choroïdale vaatwand; risicofactoren zijn divers en omvatten combinaties van omgevings- en genetische invloeden5,6. Behandelingen voor AMD zijn zeer beperkt, maar een veelbelovende potentiële therapie is RPE-celvervanging7,8. Hoewel de resultaten wisselend zijn, heeft de transplantatie van RPE-cellen bij AMD-patiënten (en bij andere patiënten met retinale degeneratie) en ook bij knaagdiermodellen van retinale degeneratie, het potentieel om significante fotoreceptoratrofie tijdelijk te voorkomen9-23. (Het diermodel dat vaak wordt gebruikt voor deze studies zijn Royal College of Surgeons (RCS) ratten, die een mutatie in het MerTK-gen hebben. Deze mutatie maakt RPE-cellen niet in staat om fotoreceptoruitersten te fagocyteren en bevordert retinale degeneratie24.) Hoewel de gerapporteerde overlevingspercentages van geïmplanteerde RPE in de subretinale ruimte van RCS ratten en muizen sterk variëren, is er potentieel voor het overleven van enkele maanden tot jaren9,10,12,20.
RPE-cellen kunnen in voldoende aantallen worden verkregen voor transplantatie door ze te verkrijgen uit pluripotente stamcellen9-14,25-28. Verschillende onafhankelijke groepen hebben aangetoond dat deze cellen op soortgelijke wijze functioneren als hun somatische tegenhangers, en langetermijnstudies suggereren dat ze veilig zijn bij implantatie in rat- en muisziektemodellen9,10,12,14,19,20,25,29-32. Het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen in plaats van embryonale stamcellen kan voordelig zijn, aangezien ethische kwesties en immunologische uitdagingen geassocieerd met allogene RPE kunnen worden vermeden33,34. Een andere spannende toepassing voor iPS-technologie is ziektemodellering35. Het vermogen om grote aantallen RPE-cellen afkomstig van patiënten met RPE-ziekten te ondervragen, zou onschatbaar zijn voor het begrijpen van hun moleculaire basis. Dit type studie is onlangs uitgevoerd met RPE van patiënten met de ziekte van Best en zou de weg kunnen wijzen voor soortgelijke studies van erfelijke maculopathieën36.
De afkomst van RPE uit stamcellen is een relatief eenvoudig proces en kan volledig worden uitgevoerd onder xeno-vrije omstandigheden. De eenvoudigste strategie is om monolagen van RPE-cellen spontaan te verkrijgen, maar het rendement kan aanzienlijk worden verbeterd met behulp van gerichte differentiatietechnieken. Maar deze technieken omvatten het gebruik van exogene eiwitfactoren die duur kunnen zijn en vaak worden gegenereerd in bacteriën of andere niet-menselijke bronnen10,12,37. In onze studies volgden we een gevestigd protocol10 dat nicotinamide en Activin A gebruikt, een signaalfactor waarvan is aangetoond dat het voldoende is voor RPE-specificatie38. Hier zullen we aantonen dat het kleine molecuul IDE-1 Activin A adequaat kan vervangen, waardoor de kosten worden verlaagd en zorgen over het gebruik van recombinante eiwitten worden weggenomen39. Bovendien gebruiken we xeno-vrije serumvervanging en kweken we de differentiërende RPE-cellen op een synthetisch xeno-vrij substraat. RPE-cellen zijn eerder aangetoond dat ze zeer effectief differentiëren met behulp van deze aanpak40.
Wanneer gedifferentieerd als een monolaag, visualiseren we gepigmenteerde kolonies met RPE-cellen al na vijf weken12. Zodra ze voldoende groot zijn, kunnen ze handmatig worden uitgesneden en overgebracht naar een ander schaaltje voor expansie. RPE-cellen staan bekend om het dedifferentiëren met elke passage, en het gebruik van iets ouder dan vijf passages moet worden vermeden (we constateren dat voldoende aantallen cellen voor karakterisering en transplantatie in diermodellen gemakkelijk kunnen worden gegenereerd na twee of drie passages). Zodra ze volledig zijn gedifferentieerd, gebruiken we meerdere technieken om de cellen anatomisch en functioneel te karakteriseren om ervoor te zorgen dat ze dienen als adequate vervanging voor zieke RPE. De beschrijving van deze technieken en het protocol voor het implanteren van de iPS-RPE in de subretinale ruimte van knaagdieren, vallen buiten het bestek van dit methodenartikel en zijn eerder gepubliceerd12,32,41.
Hoewel het ontwikkelen van gestandaardiseerde protocollen voor effectieve afleiding van iPS-RPE duidelijk belangrijk is voor de klinieken, is er ook significant preklinisch werk dat nog moet worden gedaan in diermodellen. Er zijn zorgen over de immunogeniciteit van iPS-afgeleide cellen en er worden meerdere verschillende implantatietechnieken onderzocht, inclusief het implanteren van cellen op kunstmatige substraten42,43. Om deze redenen zijn we van mening dat de publicatie van gestandaardiseerde protocollen nuttig is om zowel klinische als preklinische studies te vergemakkelijken. Vooral als directe vergelijkingen worden gemaakt van iPS-RPE-cellen die in verschillende laboratoria door verschillende onderzoeks

<table><tbody><tr><td>Corneal knife&nbsp;</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>mes x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca of Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>100 &micro;g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>Recombinant Human/Murine/Rat Activin A&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 &micro;g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T Surface 6 Well Plates</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Case(12) x 1</td></tr><tr><td>TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1&micro;m pore, 500ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431475</td><td>Case(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

efficiënte afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Er is geen genezing ontdekt voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van zichtverlies bij mensen ouder dan 55 jaar. AMD is een complexe multifactoriële ziekte met een onbekende etiologie, hoewel men grotendeels denkt dat het optreedt als gevolg van de dood of disfunctie van het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag van cellen die onder de retina ligt en kritische ondersteuning biedt voor fotoreceptoren. RPE-celvervangende strategieën kunnen veelbelovend zijn voor het bieden van therapeutische verlichting voor een groot deel van AMD-patiënten, en RPE-cellen die sterk lijken op primaire menselijke cellen (hRPE) zijn in meerdere onafhankelijke laboratoria gegenereerd, inclusief de onze. Bovendien zijn de toepassingen voor iPS-RPE niet beperkt tot cel-gebaseerde therapieën, maar zijn ook gebruikt om RPE-ziekten te modelleren. Deze soorten studies kunnen niet alleen de moleculaire basis van de ziekten verduidelijken, maar ook dienen als onschatbare hulpmiddelen voor het ontwikkelen en testen van nieuwe medicijnen. We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol voor gerichte differentiatie van RPE uit stamcellen. Het toevoegen van nicotinamide en ofwel Activin A of IDE-1, een klein molecuul dat de effecten ervan nabootst, op specifieke tijdstippen, verbetert de opbrengst van RPE-cellen aanzienlijk. Met deze techniek kunnen we in slechts drie maanden grote aantallen RPE met lage passage verkrijgen.

De stappen in dit manuscript, zoals in figuur 1, kan worden gebruikt om gemakkelijk genereren RPE uit stamcellen zoals eerder gemeld 10,12. Na handhaven van de iPS lijnen enkele weken gepigmenteerde kolonies beginnen te verschijnen in de kolonies na 5-7 weken (7 weken oude kweken zijn weergegeven in Figuur 2A-C). Deze kolonies kunnen blijven groeien weken als de culturen blijven. Zodra bereiken voldoende afmetingen, zie figuur 2D-F (8 weken oude culturen), ku...

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Het algemene doel van deze procedure is om op reproduceerbare wijze hoogwaardig retinapigmentepitheel, of RPE, af te leiden van stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst inductieve pluripotente stamcellen te laten groeien tot co fluentie. In de tweede stap wordt het medium veranderd om de cellen in RPE-fates te leiden.Vervolgens worden de RPE-cellen geïsoleerd van de andere gedifferentieerde cellen in de schaal, en vervolgens worden de culturen uitgebreid totdat er voldoende aantal cellen is verkregen. Uiteindelijk kunnen de donkere pigmentatie en mozaïek-morfologieën van de culturen worden gebruikt om te bevestigen dat de RPE-cellen terminale differentiatie bereiken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals spontane differentiatie, is dat het toevoegen van gedefinieerde factoren de differentiatie versnelt, de tijd verkort en de RPE-opbrengst verhoogt.Tot nu toe zijn duizenden knaagdieren genezen met behulp van RPE-cellen, afgeleid van IPSA-variëteit van retinale degeneratieve ziekten. Echter, als we dit efficiënt en effectief willen vertalen naar de behandeling van mensen in de klinieken met deze ziekten, is het absoluut noodzakelijk da

efficient-derivation-retinal-pigment-epithelium-cells-from-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

De microRNA (miRNA) profielen van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen, retinale pigment epitheel (RPE) afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen (iPS-RPE), en foetale RPE, werden vergeleken.

MicroRNA expressie profielen van de Mens iPS cellen, retinale pigment epitheel Derived From iPS en Foetale retinale pigment epitheel

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Het doel van dit rapport is om de protocollen beschrijven aan de netvliespigmentepitheel (RPE) van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van verschillende maten van embryoid lichamen af ​​te leiden.

Afleiden van retinale pigment epitheel (RPE) van induced pluripotent stem (iPS) cellen door verschillende maten van embryoiden Bodies

Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd retinale organoïde inductiesysteem, dat geschikt is voor verschillende menselijke pluripotente stamcellijnen om retinale weefsels met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie te genereren.

Retinale organoïde inductiesysteem voor afleiding van 3D retinale weefsels van menselijke pluripotente stamcellen

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de efficiënte cryopreservatie van van menselijke stamcellen afgeleide retinale pigmentepitheelcellen.

cryopreservatie van menselijke embryonale stamcel-afgeleide retinale pigmentepitheelcellen in het optimale stadium

Retinaal pigmentepitheel (RPE) fungeert als een cruciale barrière tussen het vaatvlies en het netvlies en bevordert de gezondheid en functie van retinale celtypen, zoals fotoreceptoren. Hierin beschrijven we een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren en kweken van RPE van volwassen muizen.

Een vereenvoudigde methode voor isolatie en kweek van retinale pigmentepitheelcellen van volwassen muizen

Leer een efficiënte methode voor het afleiden van retinale pigment epitheelcellen uit pluripotente stamcellen met gedefinieerde factoren. Dit protocol versnelt differentiatie en verhoogt de opbrengst voor toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Meer video's verkennen