Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is om op reproduceerbare wijze hoogwaardig retinapigmentepitheel, of RPE, af te leiden van stamcellen. Dit wordt bereikt door eerst inductieve pluripotente stamcellen te laten groeien tot co fluentie. In de tweede stap wordt het medium veranderd om de cellen in RPE-fates te leiden.

Vervolgens worden de RPE-cellen geïsoleerd van de andere gedifferentieerde cellen in de schaal, en vervolgens worden de culturen uitgebreid totdat er voldoende aantal cellen is verkregen. Uiteindelijk kunnen de donkere pigmentatie en mozaïek-morfologieën van de culturen worden gebruikt om te bevestigen dat de RPE-cellen terminale differentiatie bereiken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals spontane differentiatie, is dat het toevoegen van gedefinieerde factoren de differentiatie versnelt, de tijd verkort en de RPE-opbrengst verhoogt.

Tot nu toe zijn duizenden knaagdieren genezen met behulp van RPE-cellen, afgeleid van IPSA-variëteit van retinale degeneratieve ziekten. Echter, als we dit efficiënt en effectief willen vertalen naar de behandeling van mensen in de klinieken met deze ziekten, is het absoluut noodzakelijk dat we goed gevestigde, reproduceerbare protocollen ontwikkelen, die ons zullen voorzien van hoogwaardige, hoge aantallen van RPE-verkoop en IPS. Visuele presentatie van deze methode is essentieel, want slechts één persoon kan onder de kap in de microscoop werken op elk gewenst moment, waardoor de isolatiestap moeilijk te visualiseren is. Mitchell Prince, een onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium, zal nu het protocol demonstreren dat geassocieerd is met digitale cultuuraspecten van de procedure. Om de differentiatie van stamcel-afgeleide RPE-cultuur te leiden, wordt de stamceellijn van belang op een laag muis embryonale feedercellen bij twee keer 10 tot de zes cellen per putje van een zes putjesplaat geplaatst, laat de kolonies cof luentie bereiken en schakel vervolgens over naar dagelijkse voedingen met differentiatie.

Medium aangevuld met nicotinamide. Na drie weken begint u actieve in een of IDE een toe te voegen aan de voedingen om RPE-differentiatie te verbeteren. Twee weken later, schakelt u terug naar het differentiatiemedium en nicotinamide alleen, waarbij u de dagelijkse voedingen stopzet.

Zodra de pH-indicatoren in het medium na de dag van voeding ophouden geel te worden, keert u de cultuur dan terug naar de incubator totdat oogjes van de gepigmenteerde cellen verschijnen die groot genoeg zijn om te worden gesneden en verwijderd. Om de gepigmenteerde oogjes te isoleren, bedekt u de putjes van een 24-putjesplaat met een xeno-vrij matrix dat het natuurlijke celmilieu nabootst. Vul vervolgens zoveel putjes van de 24-putjesplaat met differentiatiemedium als nodig is.

En in een celcultuurkap, gebruikt u een dissectiescoop en een scalpel om elk gepigmenteerd oogje aan de onderkant van de oorspronkelijke plaat in twee tot zes stukken te snijden en pakt u de gepigmenteerde delen met scherpe pincetten en brengt u vervolgens een tot twee gepigmenteerde stukken over naar elke 24. Bewaar de plaat gedurende drie tot vijf dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide totdat de cellen hechten. Begin vervolgens het medium drie keer per week te verversen.

Breid de cellen gedurende drie tot vier weken uit in het differentiatiemedium. Blijf de cellen drie keer per week voeden om door te geven. Voeg RPE 200 microliters voorgewarmde niet-trypsine celdissocatie-oplossing toe bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken.

Na vijf tot acht minuten stopt u de reactie met vers differentiatiemedium en resuspendeert u vervolgens de culturen in enkele celsuspensies met een 200 microliter pipet, waarbij de kolonies met weinig cellen worden gepoold. Breng vervolgens de gedissocieerde kolonies over in 15 milliliter buisjes en centrifugeer de cellen. Breng de pellet opnieuw op in drie milliliter differentiatiemedium, breng vervolgens de kolonies over in elk putje van een matrixgecodeerde zes-putjesplaat die drie extra milliliter differentiatiemedium per putje bevat.

Breid vervolgens de cellen uit gedurende één tot twee weken totdat de cellen ongeveer 90% confluënt zijn en los de cellen opnieuw in één milliliter dissociatie-oplossing, zoals zojuist is gedemonstreerd. Gebruik deze keer een 1000 microliter pipet om de cellen op te schalken, breng de enkele cel-oplossing over naar een 50 milliliter conische buis.

En nadat u de cellen opnieuw hebt gecentrifugeerd, schort u de pellet op in 18 milliliter differentiatiemedium. Bewaar tenslotte de cellen in een matrixgecodeerde kweekcontainer om het maximale aantal gewenste cellen te verkrijgen in het minimale aantal passages voor verdere downstream-analyse. Gepigmenteerde kolonies beginnen te verschijnen na vijf tot zeven weken van inductieve pluripotente stamcellijncultuur. Deze kolonies kunnen wekenlang blijven groeien terwijl de culturen worden onderhouden.

Zodra ze een voldoende grootte hebben bereikt, kunnen ze handmatig worden uitgesneden. Zorgvuldige excisie om besmetting met niet-RPE-cellen te voorkomen, vergemakkelijkt de generatie van voldoende zuivere RPE-culturen. Eenmaal onder de knie, kunnen grote aantallen RPE-cellen worden afgeleid in acht tot 12 weken als de techniek correct wordt uitgevoerd.

Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat u voorzichtig moet zijn om de culturen niet te besmetten tijdens het maken van media en het voeden van cellen. Na het bekijken van deze video hopen we dat velen van u in staat zullen zijn om grote aantallen hoogwaardige RPE-cellen uit IPS te produceren. Hopelijk zal dit een snellere vertaling van de werkbank naar het bedzijde vergemakkelijken en cellaangestuurde therapieën bieden aan patiënten die lijden aan momenteel onbehandelbare retinale degeneratieve neovasculaire ziekten.