Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury
23 november 2014
Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.
Het algemene doel van deze procedure is om beweging en interactie tussen microglia, monocyten en andere celtypen in het beschadigde ruggenmerg te observeren. Dit wordt bereikt door eerst botmerg chimerische muizen te creëren die ofwel residente microglia of botmerg-afgeleide macrofagen hebben die zijn gelabeld met een fluorescerende marker. De tweede stap is om een dorsale kolom-verpletteringsblessure in het ruggenmerg te produceren.
Vervolgens worden de dieren opnieuw geopend en wordt het ruggenmerg gestabiliseerd. Voor multi-foton beeldvorming is de laatste stap het maken van enkele afbeeldingen of time-lapse films binnen de laesie. Uiteindelijk toont beeldanalyse cellulaire beweging en cellulaire interactie met omringende substraten. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van traditionele technieken, zoals celcultuur en vast weefsel, is dat cellen kunnen worden afgebeeld in hun natuurlijke complexe omgeving in het levende dier.
Voor deze operatie, gebruik chimerische of dubbele transgene dieren. Zie het tekstprotocol over hoe residente of botmerg-afgeleide cellen te labelen na het induceren van anesthesie, houd het vast met één tot 2% ISO fluor voor een ademhalingssnelheid van ongeveer 60 tot 100 ademhalingen per minuut. Breng nu oogzalf aan en bevestig een chirurgische anesthesie met een teenprik.
Bereid je voor op de operatie door eerst het doelgebied van het ruggenmerg te scheren en vervolgens de huid schoon te vegen met povidonjodium en 70% alcohol scrubs, dek het dier af en maak een gat om toegang te krijgen tot de operatieplaats. Leg vervolgens de autoclaafgereedschappen neer op een steriele doek. Dit omvat een nummer vier pincet dat is vastgesteld op één millimeter tussen de tanden en markeringen op één millimeter van de uiteinden.
Nu kunt u de huid op de middenlijn openen met irisschaar, waarbij de musculatuur wordt blootgesteld. Ga verder met de operatie onder een dissectiemicroscoop. Langs de middenlijn snijdt u de rugspieren waar ze zich hechten aan de dorsale ruggenmergprocessen met als doel het ruggenmerg bloot te leggen.
Dit omvat het snijden van de trapezius en ligamenten van de latisimus dorsi. Verwijder vervolgens de rotator spieren tussen de transversale processen en het dorsale proces om de lamina van de specifieke wervel die voor verwijdering is bedoeld, te onthullen. Hier is T 10 blootgesteld.
Ga verder door de RO-jurist tips in de ruimte boven en onder het proces te steken. Til vervolgens lichtjes op om er zeker van te zijn dat de tips stevig op hun plaats zitten en niet te diep zijn. Sluit vervolgens de RO-jurist om de lamina te verwijderen.
Verwijder nu alle kleinere delen van de resterende wervel, waardoor de opening groter wordt. Gebruik een 30-gauge naald om twee gaten te prikken, één millimeter uit elkaar in de dura om een toegangspunt voor de vaste pincetten te maken. Steek vervolgens de vaste pincetten in een hoek van 90 graden door de dura, houd de markeringen op de tanden boven de dura.
Klem de pincetten nu 10 seconden dicht. Doe de tiendures twee keer meer en verwijder de pincetten. Week vervolgens een stukje absorberbare gelatine, gecomprimeerde spons, in zoutoplossing en bedek de verwondingsplaats ermee.
Sluit de spier over de gelatine spons met nummer vier, synthetische niet-nylon draad. Gebruik vervolgens vijf millimeter wondclips om de huid te bevestigen. Voltooi de procedure met een subcutane injectie van 10 microliters bupivacaïne in 490 microliters zoutoplossing voor één milligram per kilogram.
Injecteer vervolgens vijf microliters buprenorfine in de gluteus spier voor 100 microgram per kilogram. Postoperatief. Verwarm het dier en controleer het totdat het bijkomt. Om het dier voor beeldvorming opnieuw te openen, induceert u anesthesie zoals eerder en verwijdert u vervolgens de wondclips volgens de instructies van de fabrikant.
Als dat nodig is, breng dan een haarverwijderingsproduct aan op het gebied rond de incisie. Breng deze keer extra scrubs aan met povidonjodium en 70% alcohol. Open nu de huid langs de vorige incisie.
Verwijder de resterende hechtingen en open de spieren met forceps met behulp van een schaar indien nodig. Gebruik onder de dissectiemicroscoop de schaar om zakken te maken voor de ruggenmergklemmen langs de transversale processen op de wervel, één niveau boven de laminectomie en één niveau onder de laminectomie. Plaats de klemmen van de ruggenmergstabilisator rond elke wervel en draai de klemmen vast.
Pas de klemmen aan zodat het ruggenmerg parallel is aan het beeldvormingsplatform en het weefsel stabiel is. Als er een ademhalingsartefact wordt gezien, pas dan de klemmen aan om de beweging te minimaliseren. Bedek vervolgens de klemmen en paraform.
Verwijder vervolgens voorzichtig het gelfoam met behulp van forceps. Verwijder zoveel mogelijk. Verwijder ook eventueel dik littekenweefsel over de hersenvliezen dat aanwezig kan zijn.
Zodra al het gelfoam is verwijderd, bedek het ruggenmerg met zoutoplossing. Als er bloeding wordt opgemerkt, gebruik dan een gelatine spons om de bloeding te stoppen. Gebruik indien nodig cauteriseren tijdens het cauteriseren.
Zorg ervoor dat u het ruggenmerg niet aanraakt en houd het bedekt met zoutoplossing en gelfoam. Maak nu een kuiltje om de onderdompeling vloeistof te houden, verzegel de huid en weefsels met cyanoacrylaatlijm. Bouw vervolgens een kuiltje van tandheelkundig acryl tussen de twee klemmen op.
Laat de kuiltjes uitharden. Zodra ze zijn uitgehard, vult u de kuiltjes met kunstmatige CSF. Blijf bloedingen controleren tijdens deze stappen.
Optioneel kunt u op dit punt fluorescente vaatjes in de staartader injecteren. Om bloedvaten tijdens beeldvorming te markeren, gebruikt u een fluorescente DExT-streng boven 70 kilodalton quantum dots of fluorescent gelabelde lectines. Houd de muis tijdens de beeldvorming op 37 graden Celsius in een gecontroleerde omgeving. De meest kritische stappen voor een succesvolle voorbereiding zijn ervoor zorgen dat het ruggen
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van tweefoton intravitale beeldvorming om de interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg binnen een levend diermodel te onderzoeken. In het bijzonder richt het zich op de dynamiek van microglia en monocyten in de context van een traumatisch ruggenmergletsel.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- In vivo beeldvorming
Achtergrond
- Tweefoton-imaging maakt real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
- Chimere muizen met beenmergtransplantaties worden gebruikt om onderscheid te maken tussen residente cellen en cellen afkomstig uit het beenmerg.
- Traumatisch ruggenmergletsel biedt een model voor het bestuderen van cellulaire responsen in een complexe omgeving.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele technieken door de natuurlijke weefselarchitectuur te behouden.
Doel van de studie
- Om de beweging en interactie van microglia en monocyten in een beschadigd ruggenmerg te observeren.
- Om het cellulaire gedrag in een levend organisme na letsel te beoordelen.
- Om het inzicht in de cellulaire dynamiek bij neuroinflammatoire reacties te vergroten.
Gebruikte methoden
- Creatie van chimerische muizen met beenmerg en fluorescentielabels in de cellen.
- Inductie van een crush-letsel aan de dorsale kolom in het ruggenmerg.
- Multi-foton imaging om cellulaire interacties en bewegingen vast te leggen.
- Postoperatieve monitoring en imaging onder gecontroleerde omstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle real-time visualisatie van interacties tussen microglia en monocyten.
- Aangetoonde cellulaire beweging binnen de beschadigde plek.
- Benadrukt de voordelen van in vivo imaging ten opzichte van traditionele methoden.
- Inzichten verschaffen in de cellulaire responsen na een ruggenmergletsel.
Conclusies
- Twee-foton成像 is een krachtig instrument voor het bestuderen van cellulaire dynamiek in vivo.
- De studie vergroot het begrip van neuro-inflammatoire processen bij dwarslaesies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische interventies te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze intravitale beeldgevingsbenadering maakt real-time visualisatie van immuunceldynamiek bij traumatisch ruggenmergletsel mogelijk, wat mechanistische inzichten biedt in neuro-inflammatoire processen. Door microglia in vivo te onderscheiden van macrofagen, ondersteunt deze methode de validatie van doelwitten en het verminderen van risico's bij immunomodulerende strategieën in preklinische modellen van centrale zenuwstelselziekten. De techniek vergroot het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door cellulaire interacties vast te leggen binnen een fysiologisch relevante micro-omgeving van de laesie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om infiltratie- en interactiepatronen van microglia en macrofagen te onderzoeken na een crush-letsel van de dorsale kolommen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van chimerische beenmergmodellen om CNS-residente microglia te isoleren van uit het beenmerg afgeleide macrofagen voor specifieke doelgerichte analyse.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door cellulaire responsen in een levend systeem te visualiseren, waardoor de afhankelijkheid van kunstmatige culturesystemen wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, tijdsongeloste gegevens over cellulaire beweging en interactie binnen de letselplaats.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbaar imagingplatform voor longitudinale tracking van immuunceldynamiek na letsel.
- Klaarheid van de assay: Maakt gestandaardiseerde visualisatie van CX3CR1-positieve celpopulaties mogelijk als biomarker voor inflammatoire activatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert de progressie van secundaire beschadiging en de infiltratie van ontstekingscellen die relevant zijn voor pathologie van het menselijk ruggenmerg.
- Operationele waarde: Faciliteert longitudinale beeldvormingssessies om de therapeutische impact op cellulaire dynamiek over dagen tot weken te beoordelen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen target-engagement in de ontdekkingsfase en preklinische evaluatie van de werkzaamheid via consistente fenotypische read-outs.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van de ontdekking van neuro-inflammatie, waarbij vroege targetvalidatie via fenotypische screening wordt ondersteund en mechanistische vervolgstudies in preklinische modellen worden mogelijk gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van de betrokkenheid van immuuncellen bij dwarslaesies via directe observatie van het gedrag van microglia en macrofagen.
- Screening: Levert kwantitatieve imaging-outputs, zoals celvelocity, infiltratiedichtheid en interactiefrequentie, voor het screenen van verbindingen.
- Analytiek: Levert spatiotemporele datasets die statistische vergelijking van cellulaire fenotypes over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarkerstrategieën door de dynamiek van CX3CR1-positieve cellen te volgen als correlaat van de neuroinflammatoire respons.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbare intravitale imaging-capaciteit die toepasbaar is op meerdere CNS-ziektemodellen buiten dwarslaesies.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door mechanische inzichten in neuro-immune interacties in situ te onthullen.
- Operationele waarde: Bevordert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde chirurgische voorbereiding, stabilisatie en imagingprotocollen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid in werkingsmechanismen van immunomodulatoren te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapieën gericht op het centraal zenuwstelsel mogelijk op basis van gevalideerde target-interactie in ziekte-relevante systemen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie, tweefotonmicroscopie en het genereren van beenmergchimeren.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder instelbare lasers, stabilisatoren voor het ruggenmerg en temperatuurgecontroleerde beeldvormingspodia.
- Necessiteert cross-functionele coördinatie tussen chirurgische, beeldvormings- en diverzorgingsteams voor een consistente laesiepreparatie.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij het toepassen van het model op andere contexten van neuronale beschadiging of neurodegeneratie.
- Wordt beperkt door postoperatieve overlevingsvensters en technische uitdagingen bij het handhaven van de stabiliteit van het ruggenmerg tijdens longitudinale beeldvorming.
