Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Het algemene doel van het volgende experiment is om RNA-eiwitinteracties uit celextracten te analyseren met behulp van een elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest. Dit wordt bereikt door eerst een eiwitextract van cellen of weefsels in een aparte stap te bereiden, een genspecifiek radioactief gelabeld RNA-sonde wordt gesynthetiseerd en gezuiverd. Het eiwitextract wordt vervolgens gemengd met de gelabelde RNA-sonde om de vorming van specifieke RNA-eiwitcomplexen mogelijk te maken.

Ten slotte wordt het reactieproduct geladen op een niet-denaturerende polyacrylamidegel en geanalyseerd door elektroforese. Vrije RNA-sonde wordt gescheiden van de RNA-eiwitcomplexen door zijn snellere mobiliteit. De elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest wordt veel gebruikt om RNA-eiwitinteracties te analyseren. We konden de binding van ijzerregulerende eiwitten, IRP één en IRP twee naar hun doel-RNA-element analyseren.

Maar de methode kan ook worden toegepast voor de studie van andere RNA-bindende eiwitten. Deze procedure wordt aangetoond door Dr. Kain, een Filippijnse onderzoeksmedewerker in mijn laboratorium, en door Dr. Nicole Wilkinson, een postdoctoraal onderzoeker Voor aderente cellen die in schotels worden gekweekt. Was de cellen twee keer met ijskoud PBS, voeg dan een milliliter ijskoud PBS toe en oogst de cellen met een plastic celschraper. Breng de losse celsuspensie over in een nieuwe centrifugeerbuis van 1,5 milliliter.

Plaats de buis in een voorgekoelde microcentrifuge van vier graden Celsius. Draai op lage snelheid vijf minuten en zuig het supernatant af. De cellen zullen verschijnen als een wit pellet op de bodem van de buis.

Voor elke 10 miljoen geoogste cellen, voeg 100 microliter ijskoud cytoplasmatisch lysisbuffer toe. Maak het cellenpellet los door meerdere keren op en neer te pipetteren en incubeer vervolgens de suspensie gedurende 20 minuten op ijs. Dit zal het cellulaire membraan solubiliseren en alle cytosolische inhoud in de buffer vrijgeven.

Om de gesolubiliseerde cytosolische fractie te isoleren, centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op volle snelheid in een centrifuge van vier graden Celsius, breng de verdunde supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter op ijs en gooi het pellet weg. Bepaal vervolgens de totale eiwitconcentratie van het resulterende cytoplasmatische extract met behulp van de Bradford-assay. Verdeel het resulterende cytoplasmatische extract in kleinere buisjes en bewaar het bij minus 80 graden Celsius tot gebruik voor het produceren van cytoplasmatische extracten uit vers weefsel.

Begin met het oogsten van het proces door het geëuthaniseerde dier op een schone onderlaag over een dissectieplank te leggen. Open de buik met een schaar. Verwijder de lever en de milt met behulp van schaar en pincet.

Spoel elk weefsel in ongeveer 50 milliliter ijskoud PBS om weefseldegradatie te voorkomen. Snijd de weefsels onmiddellijk in kleine stukjes van ongeveer één tot twee kubieke millimeter met een scalpel zonder vertraging. Plaats de weefsels in een verse cryobuis en sluit deze.

Vries een monster in vloeibare stikstof. Bewaar de bevroren weefsels bij minus 80 graden Celsius tot ze nodig zijn. Begin met het maken van het cytoplasmatische extract door de eerder bevroren weefselmonster over te brengen in een buis van twee milliliter met een platte bodem die 250 tot 500 microliter ijskoud lysisbuffer bevat.

Plaats een weefselhomogenisatortip in de buis en zet het apparaat op gemiddeld vermogen. Plaats de buis na 10 seconden homogenisatie onmiddellijk 20 minuten op ijs om eiwitidenaturering te voorkomen. Om de cytosolische fractie te isoleren, centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op volle snelheid in een centrifuge van vier graden Celsius, breng de verdunde supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter op ijs en gooi het pellet weg.

Bepaal de totale eiwitconcentratie van het resulterende cytoplasmatische extract met behulp van de Bradford-assay. Verdeel het resulterende cytoplasmatische extract in kleinere buisjes en bewaar het bij minus 80 graden Celsius tot het nodig is. Voordat u doorgaat met het protocol, stel een stralingsveilige werkbank in, compleet met een plexiglas schild en een Geigerteller.

Doe cytometry-monitortags op laboratoriumjassen en geschikte stralingsspecifieke scherpe en niet-scherpe afvalcontainers. Begin met een gedelineerd DNA-plasmide dat een gekloond ijzerresponselement bevat. Als sjabloon, zet een in vitro RNA-transcriptiereactie van 20 microliter op door de reactiebuffer, gedeeltelijk radioactieve nucleotiden en de RNA-polymerase met een pipet bij kamertemperatuur te mengen.

Om RNA-synthese te initiëren, incubeer het monster gedurende een uur bij 40 graden Celsius. Beëindig de in vitro transcriptiereactie door een microliter van 0,5 molaire EDTA pH 8,0 toe te voegen. Meng de EDTA door op en neer te pipetteren.

Gebruik nu een standaard alcoholprecipitatieprotocol om het RNA-product te zuiveren. Voeg 10 microliter tRNA en 82,5 microliter 3 molair natriumacetaat bij pH 5,2 toe aan het postsynthesemengsel en vortex. Om het tRNA te mengen, zal het als een precipitatiedrager fungeren en zal het de uiteindelijke RNA-opbrengst verhogen om het RNA te laten bezinken.

Voeg 273 microliter 95 tot 100% ethanol toe en meng door te vortexen. Laat de precipitatiereactie doorgaan door de buis 10 minuten op de werkbank op kamertemperatuur te laten staan om het RNA te isoleren, centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op volle snelheid in een centrifuge op kamertemperatuur. Gooi voorzichtig met een pipet het supernatant weg en verontreinigt het pellet niet.

Het geprecipiteerde RNA kan bestaan als een klein wit pellet nabij de bodem van de buis of het kan onzichtbaar zijn voor het blote oog. Was het pellet door 100 tot 500 microliter 70% ethanol toe te voegen. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op volle snelheid bij kamertemperatuur en decanteer vervolgens de supernatant met de deksel erop.

Laat het RNA-pellet drogen door de buis 10 tot 15 minuten open op de werkbank te laten staan. Reconstitueer het vaste radioactief gelabelde RNA door 100