Name: 3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Leer 3D-beeldvorming van neuronen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii in muizenhersenen. Deze methode toont de ruimtelijke relatie tussen parasiet en gastheerneuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de hele Koshy lab voor nuttige discussies. Wij danken Patty Jansma en de Universiteit van Arizona Neuroscience afdeling voor advies en hulp met beeldvorming. We danken ook de Porreca lab voor het gebruik van hun Vibratome. Dit onderzoek werd gesteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

OPMERKING: De muizen werden gekweekt en onderhouden in een constante temperatuur en vochtigheid kamer met 12 uur teruggedraaid licht / donker cycli met voedsel en water ad libitum beschikbaar aan de Universiteit van Arizona. Experimenten werden uitgevoerd onder de richtsnoeren en de goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. De Cre-reporter muizen op een C57BL / 6 achtergrond 11 en zijn commercieel verkrijgbaar. 1. Mouse Infectie OPMERKING: De werkwijze muis infectie met Toxoplasma gondii hieronder beschreven is gebruikt in studies eerder gepubliceerd 10-12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Groei Toxoplasma stammen in humane voorhuid fibroblasten (HFFS) gekweekt in Dulbecco&#39;s hoog glucosegehalte Modified Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycin, en 2 mM L-glutamine (cDMEM) in een T-25 kolf in een 5% CO2 incubator tot parasieten gevormd parasitophorous grote vacuolen. </li><li> Spuit afgifte parasieten door schrapen cellen van de bodem van de kolf en de gevormde oplossing door een 25 gauge naald verbonden met een injectiespuit 3 ml 2 keer in de kolf vervolgens overbrengen all oplossing een 5 ml injectiespuit geval verbonden met een 27 gauge naald die is ondersteboven in een 15 ml conische buis geplaatst. Sluit de plunjer aan de spuit en laat de parasiet oplossing in de conische buis. </li><li> Centrifugeer het buisje gedurende 10 minuten bij 300 x g. Zuig het supernatant resuspendeer dan de pellet in 4-6 ml steriele USP 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (voorraadoplossing). </li><li> Plaats een hemocytometer met 10 ul van stockoplossing, wacht 5-10 minuten voor de parasieten om vervolgens af te wikkelen tel het aantal parasieten in de vier hoeken en in het midden pleinen van de middelste grote plein. </li><li> Verdunnen paraplaatsen passende inoculum van 100K / 200 pl 1x PBS injecteer dan muizen intraperitoneaal (ip) met een totaal volume van 200 ui. LET OP: Voor deze procedure werden muizen geënt met 100K Type III (CEP) 13 tachyzoiten in 200 ul 1x PBS. Wanneer infecteren muizen met andere stammen van Toxoplasma, moet concentratie entmateriaal worden aangepast om rekening te houden niveau van virulentie. </li></ol> 2. perfusie en Brain Oogsten Opmerking: Dit protocol werd uitgevoerd op 21 dagen na infectie (dpi) aangezien dit het tijdstip waarop piek aantal cysten worden gevonden in muizenhersenen, maar andere tijdstippen worden gebruikt. Grootte, aantal, plaats, en de aanwezigheid of afwezigheid van cysten afhankelijk van vele factoren zoals muizenstam, parasiet stamtype als inoculum 7,14 - 17. Onderzoekers zullen moeten individueel bepalen van de juiste entstof voor de muis en Toxoplasma stam hij / zij gebruikt. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Setup alle chirurgische oogst gereedschap (figuur 1). </li><li> Voor elke muis, voor te bereiden en te houden op het ijs: 20ml spuit gevuld met 0,9% natriumchloride (NaCl) + 10 U / ml Heparine in 1x steriele USP PBS (Heparine / Saline); 20 ml spuit gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA); Scintillatieflesje met 15 ml 4% PFA. Voor meerdere muizen, bereiden een beker gevuld met het volledige bedrag van elke oplossing nodig voor alle muizen dan het opstellen van een nieuwe spuit vol oplossing voor elke perfusie. </li><li> Verdoven de muis ip met 200 gl / 25 g lichaamsgewicht ketamine / xylazine cocktail (24 mg / ml en 4,8 mg / ml) op de dag van belang. Toezien op de muis voor het niveau van de anesthesie door het controleren teen knijpen reflex. Ga verder met het protocol slechts een keer met de muis geeft geen reactie op een stevige teen knijpen. OPMERKING: Andere methoden van anesthesie kan worden gebruikt, voor het passende niveau van anesthesie alvorens wordt bereiktverder te gaan met het protocol. </li><li> Plaats de muis in rugligging op het overdekte schuim platform. Pin alle vier de ledematen uit de voeten dan spuit de borst en de buik met 70% ethanol (EtOH) (Figuur 2A). Toevoeging van verscheidene steriele papieren handdoeken onder de muis kan worden gebruikt om te absorberen overloop van perfusie vloeistoffen. </li><li> Lift huid net onder het borstbeen met een tang en gebruik dan een schaar om een ​​incisie te maken. Trek de huid terug naar de borst (Figuur 2B) bloot. </li><li> Til zwaardvormig proces en maakt een incisie in de buik net onder het middenrif, het blootstellen van de lever, die botweg uit de buurt van het middenrif wordt ontleed. Maak twee insnijdingen, één links en één rechts door het membraan en de onderzijde van de ribben. Verleng de links en rechts incisies ongeveer 1 / 2-2 / 3 weg omhoog de ​​ribbenkast, die vervolgens wordt teruggekaatst naar de borstholte (figuur 2C) te openen. OPMERKING: Zorg ervoor dat alle organen snijden of grote bloedvaten during van deze procedure zo te doen zal de kwaliteit van de perfusie in gevaar brengen. </li><li> Perfuse transcardiaal met 10-20 ml Heparine / Saline, gevolgd door 10-20 ml 4% PFA. OPMERKING: Als de perfusie naar behoren wordt gedaan, zal de lever van rood naar bruinen (figuur 2D). Als dit niet goed gebeurt, zal de bloedvaten zichtbaar (Figuur 2E) zijn. </li><li> Draai de muis op zijn buik, re-pins voeten dan spuit hoofd en hals met 70% EtOH. Til huid van de basis van de nek en een insnijding. Verwijder het vel om de schedel (figuur 2F) bloot. Onthoofden hoofd op het niveau van de schouders. Verwijder de schedel, verwijder voorzichtig de hersenen, en leg het in een scintillatieflesje gevuld met 4% PFA (figuur 2G-H). OPMERKING: Als goed doorbloed, zullen de hersenen wit met geen zichtbare bloedvaten (figuur 2I) verschijnen. Als de hersenen niet goed doorbloed, zullen de bloedvaten zichtbaar (Figuur 2J) zijn. </li><li> Plaats de Scintillatie flacon hersenen in 4% PFA bij 4 ° C overnacht, onder tegen licht. Spoel de hersenen in niet-USP 1x PBS en de overdracht naar een nieuwe scintillatieflesje gevuld met gekoelde 1x PBS. Bewaar de hersenen in 1x PBS bij 4 ° C, afgedekt tegen licht. OPMERKING: Succesvolle clearing en imaging is bereikt met secties opgeslagen in 1x PBS voor maximaal een maand, maar het is het beste om deel van de hersenen binnen een paar dagen als langdurige opslag in PBS zal de PFA fixatie te keren en zou kunnen leiden tot minder dan optimale beelden . Autofluorescentie en toegenomen onscherpte zijn opgemerkt in sommige secties afgebeeld na opslag in 1x PBS gedurende een maand of langer. </li></ol> 3. Brain-Sectie <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder de hersenen van 1x PBS en plaats deze in een brain-matrix (figuur 3A) te zorgen voor meer nauwkeurige en zelfs dwars door de hersenen. Snijd het cerebellum en olfactorische bollen, indien aanwezig, en knip dan de hersenen coronaalwaarts in 2 of 3 delen. <br /&gt; NB: Snijden en snijden van de hersenen kan worden gedaan zonder de hulp van een brein matrix. Aantal secties coronaalwaarts gesneden zal afhangen van de maaiafstand van de Vibratome gebruikte. De hersenen kunnen worden gesegmenteerd in elke richting, hoewel sagittale en coronale secties worden het meest gebruikt voor neuroanatomical identificatie. </li><li> Bevestig elke sectie hersenen op een exemplaar montage blok met cyanoacrylaat. Plak een klein blok van 5% agarosegel achter de sectie hersenen voor ondersteuning (figuur 3B). OPMERKING: Andere ondersteunende mechanismen kunnen worden gebruikt, maar zonder steun kunnen de Vibratome duwen de hersenen veroorzaakt ongelijke snijden. </li><li> Snijd weefsel in 160 urn (werkafstand van de doelstelling voor imaging) dikke secties met Vibratome ingesteld op een snelheid van 4 en amplitude 9. OPMERKING: De instellingen voor snelheid en amplitude kunnen worden aangepast afhankelijk van de machine wordt gebruikt om zelfs verkrijgen glad secties. Als de instellingenniet correct is, kan het gevolg zijn oneffenheden, scheuren van weefsel of kerven. </li><li> Verzamel materiaal secties in een scintillatieflesje gevuld met verse, gekoelde 1x PBS als ze gaan binnen een week te worden ontruimd. Indien delen niet gaan binnen een week te worden ontruimd, plaats secties in 1,5 ml microcentrifugebuisjes gevuld met cryopreservative oplossing en bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 4. Optische Clearing van Brain Tissue secties LET OP: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerde methode 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bereid 25%, 50%, 75% en 90% vol / vol glycerol in 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Verwijder secties van 1x PBS of, indien in cryopreservative, spoel in 1x PBS en over te dragen aan een scintillatieflesje met 10 ml van 25% Gl / PBST. Plaats flacon op een schudder bij 4 ° C, onder blootstelling aan licht gedurende 12 uur. </li><li> Bevestigen dat alle secties gezonken naar de bottom van de flacon. Zuig het 25% Gl / PBST, waardoor er net genoeg ter dekking van de secties vul dan de flacon met 10 ml 50% Gl / PBST en plaats op een schudder bij 4 ° C, bedekt tegen blootstelling aan licht, gedurende 12 uur. Herhaal dit proces voor de 75% Gl / PBST dan de 90% Gl / PBST. Verlaat secties in de 90% Gl / PBST gedurende 24 uur tot maximaal clearing te bereiken. In de loop van de clearing proces, observeren geleidelijke optische clearing (figuur 4). OPMERKING: Dit proces kan worden versneld als oplossingen worden veranderd onmiddellijk na secties gezonken naar de bodem van de flacon. In 75% en 90% oplossingen zullen gedeelten niet helemaal naar de bodem van de flacon maar zal drijven in het midden. </li></ol> 5. Montage Brain Tissue secties <ol style="margin-left: 40px;"><li> Snijd een No. 1.5 dekglaasje in 5 stukken naar een spacer te creëren. Gebruik een liniaal en gediamanteerde potlood om te scoren en breek het dekglaasje langs de stippellijnen in figuur 5A. Discard thij midden stuk, schik de 4 buitenste stukken op een vlakte glasplaatje om een venster te maken, en dan borstel duidelijke nagellak op de naden om de stukken van de afstandhouder houden aan de dia in de juiste configuratie (Figuur 5B). OPMERKING: De spacer wordt gebruikt om de nodige ruimte tussen de schuif en het dekglaasje voor montage van de gewist secties creëren. Het dekglaasje kan op verschillende manieren in elk formaat venster noodzakelijk maken worden gesneden. Voorgesneden schuim afstandhouders zijn ook commercieel verkrijgbaar. Toe te staan ​​nagellak goed drogen, is het het beste om dia&#39;s met afstandhouders te maken ten minste een dag voorafgaand aan de montage van secties. </li><li> Transfer secties om een ​​dia met behulp van een plastic overdracht pipet met de punt afgesneden. Zorg ervoor dat in de omgeving te vullen met 90% Gl / PBST. Verlagen van een dekglaasje over de secties en zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren zorgvuldig. Overtollige Gl / PBST kan weg worden wicked met een niet-pluizende vegen. </li><li> Afbeelding GFP + neuronen bevatten RFP + <em&gt; Toxoplasma gondii cysten met een confocale microscoop direct (figuur 7A-B) dan bergen slides plat en bedekt tegen licht bij 4 ° C. OPMERKING: U afdichting glijdt volledig rond alle randen op te slaan en in beeld gebracht op een later tijdstip. Het gebruik van duidelijke nagellak aan dia verzegelen is optioneel en kan het moeilijker maken om dekglaasje te verwijderen als men secties van de dia te verwijderen op een later tijdstip voor verdere verwerking. </li></ol> 6. Imaging OPMERKING: Elke microscoop kan worden gebruikt, dat de mogelijkheid van het verkrijgen van een hoge resolutie z-stacks heeft. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Na aanvankelijk het vinden van de focal plane op 10X, veranderen in een 20X objectief en scannen via de sectie om een cyste zich in een GFP + cellen te identificeren. Centreer het gebied van belang (ROI) in het gezichtsveld. </li><li> Veranderen naar een 40X objectief. Focus op en neer door het hele ROI om ervoor te zorgen dat de gehele cel en cyst zijn zichtbaar. OPMERKING: Beelden werden verkregen met een confocale microscoop met een 40X / 1.30 Oil DIC M27 doelstelling. </li><li> De geïnstalleerde beeldverwerkingssoftware verkrijgen z-stack die de gehele cel cysten bevat. Gemiddeld gebruikt om beelden te verkrijgen instellingen worden getoond in figuur 6. Opmerking instellingen moet worden aangepast afhankelijk per onderzoekers weefselsecties en microscoop mogelijkheden. </li><li> Een maximale projectie beeld van de z-stack te krijgen door het instellen van het aantal projecties op 1. Zorg voor een volledige rotatie zicht door het instellen van het aantal projecties tot 64. OPMERKING: Andere softwarepakketten beschikbaar en kunnen worden gebruikt om maximale projectie verkrijgen, rotatie en andere uitzicht z-stack afbeeldingen. </li><li> Afbeelding analyseren met beeldvorming analyse software. </li></ol>

<ol><li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li>
<li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+transmission%2C+diagnosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li>
<li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine%2C+even+after+extensive+parasite+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246(2013).</li>
<li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li>
<li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii%3A+a+histological%2C+immunocytochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li>
<li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain%3A+A+Confocal+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroparasitology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li>
<li>Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li>
<li>Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li>
<li>Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li>
<li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li>
<li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%2C+bradyzoites%2C+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.</li>
<li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Alzheimers+Dis+Other+Demen%22%5BJournal%5D)">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li>
<li>Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis%3A+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925(2011).</li>
<li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li>
<li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+agents+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li>
<li>Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Aangezien cellulaire veranderingen in geïnfecteerde gastheercellen zijn gekoppeld aan de ziektebeelden bij infecties met andere intracellulaire organismen zoals HIV, hondsdolheid en Chlamydia 18,19, ontwikkelden we een techniek waarmee we de intieme interacties die optreden tussen de CNS bestuderen gastheercel en Toxoplasma. De hier beschreven methode Dit doel wordt bereikt doordat efficiënte beeldvorming van chronisch geïnfecteerde neuronen. Voorafgaand aan de ontwikkeling van deze methode, zoals be...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Het algemene doel van deze methode is in een hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van individuele neuronen die zijn geïnfecteerd met het obligate intracellulaire parasiet Toxoplasma gondii verkrijgen. Toxoplasma wordt vaak beschouwd als een van de meest succesvolle parasieten vanwege zijn grote tussengastheer serie, die mensen en knaagdieren bevat. Bij zowel mensen en knaagdieren, na acute infectie door het eten van besmet voedsel of water, Toxoplasma is in staat om een persistente infectie van het CZS veroorzaakt door het omzetten van zijn snelle replicerende vorm (de tachyzoite) om de trage-vermeerderingsfase encysting vorm (de bradyzoite ). In immuuncompetente individuen, wordt dit latente CNS infectie gedacht relatief asymptomatisch zijn, maar in immuungecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten of ontvangers, kan weer uitbreken van de parasiet tot fatale encefalitis toxoplasmic 1,2. Daarnaast recente studies have aangetoond dat latente infectie met Toxoplasma kan leiden tot gedragsveranderingen bij knaagdieren 3,4, hoewel het mechanisme blijft onbekend. Verrassend, ondanks deze gegevens benadrukken het belang van het CNS- Toxoplasma interactie, relatief weinig bekend is over deze relatie, in het bijzonder op cellulair en moleculair niveau. De mogelijkheid om zelfs eenvoudige aspecten van de interactie hersenen-parasiet bestuderen is deels belemmerd door technologische beperkingen. Bijvoorbeeld, het merendeel van het werk blijkt dat neuronen de cellen waarin cysten blijven is gedaan met elektronenmicroscopie (EM) 5,6. Hoewel EM geeft hoge resolutie, het is tijdrovend, arbeidsintensief en duur. Immunofluorescentie (IF) assays zijn onlangs gebruikt in combinatie met confocale microscopie met het werk van EM 7 bevestigen. IF testen zijn technisch eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, maar met behulp van deze technieken understand de ruimtelijke relatie tussen de cyste en de besmette neuron vereist seriële reconstructie, dat is tijdrovend, technisch moeilijk, en kan leiden tot verlies van waardevolle informatie. Aldus hebben we een methode die kan worden gebruikt met het muismodel van CNS toxoplasmose en laat ons beeld de gehele geïnfecteerde neuronen zonder EM of immunohistochemie (IHC) ontwikkeld. Door het ontwikkelen van een dergelijke techniek, kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de geïnfecteerde cel en de cyste in een relatief snelle en goedkope wijze verkennen. De methode die we ontwikkeld combineert nieuwere technieken voor het optisch clearing en imaging dikke hersensecties door confocale microscopie 8 met een systeem dat markeert in vivo cellen die zijn ingespoten met parasiet eiwitten 9,10. In dit systeem infecteren we Cre-reporter muizen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie na Cre gemedieerde recombinatie 11 met Toxoplasma </em&gt; Stammen die een rood fluorescerend eiwit (RFP) te uiten en te injecteren Cre recombinase in gastheercellen 9. Deze combinatie stelt ons in staat om de geïnfecteerde muizenhersenen oogsten na CNS infectie is vastgesteld, snijd dikke hersenen secties, en snel te identificeren relevante gebieden om het beeld door het vinden van de RFP + cysten. Het is belangrijk op te merken dat als gastheercel expressie van GFP alleen afhankelijk injectie van Cre door parasieten, en niet op infectie, een aantal GFP + cellen niet parasieten 10 bevatten. Als het doel van dit protocol is om te kunnen het hele geïnfecteerde neuronen, de focus is alleen op GFP + neuronen die ook een RFP + cyste bevatten, maar het protocol kan ook worden gebruikt voor het imago van de GFP + / RFP - neuronen. Zodra de besmette hersenen wordt geoogst en gesegmenteerd, worden de secties transparant gemaakt door glycerol clearing. Geschikte gebieden van de secties worden vervolgens afgebeeld met confocale microscopie, algende ongekende visualisatie van geïnfecteerde gastheercellen en de ingekapselde parasieten in hun geheel. Hier bieden we een compleet protocol voor het identificeren, optisch clearing, en imaging geïnfecteerde neuronen.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Andere vibratomen zijn compatibel</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Chirurgische apparatuur</td><td></td><td></td><td>Duimtang; Fijne schaar-zijwaarts geslepen, scherp-scherp; Scherpe schaar; Kelly hemostatiek; Mayo schaar; Micro spatel.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cellen</td><td></td><td></td><td>Dit zijn primaire cellen uit menselijke voorhuiden.  We maken deze zelf, maar ze kunnen ook worden gekocht bij externe leveranciers.</td></tr><tr><td>Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Zonder Calcium en Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natriumzout uit varkensdarm slijmvlies</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Wegwerp Scintillatie Flacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>Dit product wordt gekocht bij een interne voorraadkamer.  Andere bedrijven zijn compatibel.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klare nagellak</td><td></td><td></td><td>Andere merken zijn compatibel</td></tr><tr><td>10 ml Spuit met Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Andere spuiten zijn compatibel</td></tr><tr><td>Drieweg Stopcock</td><td></td><td></td><td>Elk merk is compatibel</td></tr><tr><td>Hypodermische naald</td><td></td><td></td><td>Elk merk is compatibel - gebruikt om de muis vast te pinnen.</td></tr><tr><td>Celkrabber</td><td></td><td></td><td>Elk merk is compatibel</td></tr><tr><td>25 G x 12" Tubing, Veiligheid Bloedafname Set, met Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Andere merken zijn compatibel</td></tr></tbody></table>

3-d imaging en analyse van neuronen infected in vivo met toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet met een breed gastheerbereik, waaronder mensen en knaagdieren. In zowel mensen als knaagdieren, Toxoplasma wordt een levenslange persistente infectie in de hersenen. Hoewel deze hersenen infectie asymptomatisch meeste immunocompetente mensen, voor de foetus of immuungecompromitteerde personen, zoals verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) patiënten deze voorkeur voor en persistentie in de hersenen kan leiden tot verwoestende neurologische ziekte. Het is dus duidelijk dat de hersen- Toxoplasma interactie is essentieel voor de symptomatische ziekte door Toxoplasma, maar we hebben weinig begrip van de cellulaire en moleculaire interacties tussen cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en de parasiet. In het muismodel van CNS toxoplasmose het is bekend dan 30 jaar dat neuronen de cellen waarin de parasiet aanhoudt, maar weinig informatie beschikbaar over welkedeel van het neuron wordt over het algemeen besmet (soma, dendriet, axon) en als dit cellulaire relatie verandert tussen stammen. Deels dit gebrek ondergeschikt is aan de moeilijkheid van beeldvorming en visualiseren gehele geïnfecteerde neuronen van een dier. Dergelijke beelden zou vergen doorgaans seriële snijden en stikken van weefsel in beeld gebracht met behulp van elektronenmicroscopie of confocale microscopie na immunostaining. Door het combineren van verschillende technieken, de hier beschreven werkwijze maakt het gebruik van dikke secties (160 urn) te identificeren en het gehele cellen die cysten bevatten, zodat driedimensionale visualisatie en analyse van individuele, chronisch geïnfecteerde neuronen zonder immunokleuring, elektronenmicroscopie , of seriële snijden en stikken. Met deze techniek kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de parasiet en de geïnfecteerde neuron begrijpen.

Figuur 7 omvat representatieve beelden van twee cyste bevattende GFP + neuronen van twee 160 urn dikke secties en een representatieve meting van de afstand van cyste-cel-orgaan Figuur 7B. Figuren 7 A en B illustreren dat deze nieuwe protocol maakt visualisatie van de geïnfecteerde neuron in zijn geheel. Figuur 7C toont dat bij deze beeldvormende techniek is het nu mogelijk om de afstand tussen de cyste en het cellichaam (Imaris 7.7) kwantific...

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Het algemene doel van deze procedure is om neuronen die besmet zijn met Toxoplasma Gandhi cysten volledig te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst Cree-reportermuizen intraperitoneaal te infecteren met parasieten die M-kerrie uitdrukken en die zodanig zijn ontworpen dat ze CRE-recombinase in de gastheercellen injecteren. Zodra de CNS-infectie is vastgesteld, is de tweede stap het uitvoeren van transcardiale perfusie met heparine-zoutoplossing, gevolgd door 4% paraldehyde.Vervolgens wordt de hersenen geoogst, worden de reukbollen en het cerebellum verwijderd en weggegooid en wordt de resterende hersenen in twee helften gesneden, waarna de helften worden verdeeld in secties van 160 micron dik. De laatste stap is om de secties op te helderen met oplopende glycerol-PBS-Tween-oplossingen en ze op dia's te monteren voor beeldvorming met confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen de beelden worden geanalyseerd met software die 3D-rendering en -analyse mogelijk maakt, en deze methode kan worden gebruikt om de cellulaire relatie tussen de cyste en de besmette neuronen te laten zien.Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals serieel, sectiëren, kleure

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Toxoplasma gondii wordt omgezet in een cyste formulier in reactie op belasting van het milieu, die kunnen worden nagebootst in weefselkweek modellen. Deze video demonstreert technieken om cyste wand vorming van onderzoeken door het activeren van beenmerg afgeleide macrofagen of het wijzigen van groeimedium pH in fibroblast cellen.

Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden

Gebruik makend van luciferase en in vivo imaging-systemen (IVIS) als een roman middel om ziekte-eindpunten identificeren voordat klinische ontwikkelingen voordoen. IVIS heeft ons toegestaan ​​om te visualiseren in real time de invasie van encefalitisch virussen over meerdere dagen, met een meer accurate ziekte model voor toekomstige studie. Het is ook toegestaan ​​om het potentieel beschermende kenmerken van antivirale middelen en vaccins sneller identificeren dan op dit moment gebruikte...

In vivo Imaging Systems (IVIS) Detectie van een neuro-invasieve encefalitisch Virus

Source: Zaeck, L., et al. High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2019). This video demonstrates the process of preparing and imaging mouse brain tissue infected with the rabies virus (RABV) to evaluate infection progression. It outlines key steps, including tissue staining with fluorescent markers, dehydration, clearing, and mounting for confocal laser scanning microscopy, culminating in the generation of a three-dimensional...

Three-Dimensional Visualization of a Rabies Virus Infection in Mouse Brain Tissue

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Neuronale processen bewaren voor ultrastructurele analyse beschrijven we een protocol voor beplating van primaire neuronen van elektronenmicroscopie netten gevolgd door flash-bevriezen, waardoor monsters gesuspendeerd in een laag van glasachtige ijs. Deze monsters kunnen worden onderzocht met een cryo-elektronenmicroscoop om structuren te visualiseren op de nanometer schaal.

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Roman, immunokleuring-compatibele weefsel clearing technieken zoals de ultieme 3D-beeldvorming van solvent-geclearde organen toestaan de 3D-visualisatie van rabiësvirus herseninfectie en zijn complexe cellulaire omgeving. Dikke, antilichaam gelabelde hersenweefsel segmenten zijn optisch transparant gemaakt om de beeld diepte te vergroten en 3D-analyse mogelijk te maken door confocale laser scanning microscopie.

Hoge-resolutie 3D-beeldvorming van rabiës virus infectie in solvent-geklaard hersenweefsel

De beschreven pijplijn is ontworpen voor de segmentatie van elektronenmicroscopie datasets groter dan gigabytes, om hele celmorfologieën te extraheren. Zodra de cellen zijn gereconstrueerd in 3D, kan aangepaste software die is ontworpen rond individuele behoeften worden gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve analyse rechtstreeks in 3D uit te voeren, ook met behulp van Virtual Reality om de zicht occlusie te overwinnen.

Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen

Het huidige protocol beschrijft lichtblad fluorescerende microscopie en geautomatiseerde software-ondersteunde methoden om prolifererende en slapende Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in intacte, gewiste organen en weefsels te visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze technieken bieden een betrouwbare manier om behandelingsresultaten te evalueren en bieden nieuwe inzichten in interacties tussen parasieten en gastheer.

Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het radioactief labelen van een mensspecifiek anti-CD19 monoklonaal antilichaam en hoe het kan worden gebruikt om B-cellen in het centrale zenuwstelsel en perifere weefsels van een muismodel van multiple sclerose te kwantificeren met behulp van in vivo PET-beeldvorming, ex vivo gammatelling en autoradiografiebenaderingen.

Beeldvorming van CD19+ B-cellen in een experimenteel muismodel met auto-immuun encefalomyelitis met behulp van positronemissietomografie

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Leer 3D-beeldvorming van neuronen geïnfecteerd met Toxoplasma gondii in muizenhersenen. Deze methode toont de ruimtelijke relatie tussen parasiet en gastheerneuronen.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Meer video's verkennen